Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. • vlastnosti kmenových buněk • embryonální kmenové buňky • linie kmenových buněk v podmínkách in vitro • indukované pluripotentní buňky Program přednášky: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Totipotence • nelimitovaný diferenciační potenciál • schopnost tvořit embryonální i extraembryonální tkáně • časná stádia rýhování zygoty Pluripotence • schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů • buňky ICM (embryonální kmenové buňky) Multipotence • schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně • např. hematopoetické kmenové buňky, neuronální kmenové buňky… Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. VLASTNOSTI KMENOVÝCH BUNĚK Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Kmenové buňky (Stem Cells, SCs) = buňky z embrya, fetu nebo dospělého organismu, které se za určitých podmínek mohou neomezeně množit a rovněž dávat vzniknout specializovaným buňkám různých typů tkání • zdroje kmenových buněk: embryo, fetus, dospělý organismus [+ placenta, pupečníková krev] Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. TERMINOLOGIE: • embryonální SCs (ESCs): • embryonální kmenové (Embryonic Stem Cells) • embryonální zárodečné (Embryonic Germ Cells) • embryonální karcinomové (Embryonic Carcinoma) • linie embryonálních kmenových buněk • dospělé (adultní) SCs (ASCs) • kmenové buňky nádorů (Cancer SCs, CSCs) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Stemness • sebeobnova • diferenciace Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Sebeobnova (self-renewal) SCs se mohou dělit po „neomezeně“ dlouhou dobu, narozdíl od ostatních buněk organismu Diferenciace SCs jsou nespecializované buňky, postupnou diferenciací vznikají specializované typy buněk Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Plasticita (Transdiferenciace) schopnost adultních SCs určitého orgánu nebo tkáně diferencovat do jiného druhu tkáně Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Replikační potenciál SCs: In vivo • ESCs - tvorba ICM ve stádiu blastocysty • ASCs - po celou dobu života organismu In vitro • ESCs, neuronální ASCs - neomezeně • většina ASCs – omezené dělení • telomerázová aktivita ESCs - symetrická mitóza ASCs - asymetrická mitóza Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. A – kmenová buňka B – progenitorová buňka C – diferencovaná buňka 1 – symetrické dělení 2 – asymetrické dělení 3 – dělení progenitorů 4 – terminální diferenciace Replikační potenciál SCs: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. “Niche” (hnízdo) SCs • mikroprostředí (microenvironment): podpůrné buňky, extracelulární matrix, adhezní molekuly a signální molekuly • udržuje self-renewal SCs • chrání před deplecí živin • reguluje proliferaci SCs • ASCs - po celou dobu života organismu niche cells SCs (mitóza) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Diferenciační potenciál lidských SCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Embryonální zárodečné buňky (EG cells) • vznik z primordiálních zárodečných buněk (PG cells) • migrují v embryu do genitální lišty • později společně se somatickými buňkami tvoří gonády • izolace ve vhodný čas + kultivace in vitro  pluripotentní (EG cells) • lidské EGCs netvoří teratomy ani chiméry Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Fetální kmenové buňky • primitivní (málo diferencované) buňky v orgánech fétu • např: KB neurální lišty, hematopoetické KB, pankreatické progenitory, neurální KB • izolovány z abortovaných fétů Kmenové buňky z pupečníku pupečníková krev – hematopoetické KB (HSCs), endoteliální progenitory, mezenchymální KB (MSCs), VSELs... Whartonův rosol – zdroj mezenchymálních KB (MSCs) • většinou jsou multipotentní • buňky tvoří kolonie, mohou být kultivovány a mají dlouhé telomery • vyšší imunologická kompatibilita než buňky KD • HSCs - frekvence výskytu minimálně stejná jako v kostní dřeni Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. 5denní blastocysta Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Schopnosti ESCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Typy mESCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Izolace a indukovaná diferenciace ESCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. LINIE EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK V PODMÍNKÁCH IN VITRO Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. 1981 - myší ES buněčná linie: M.J. Evans and M.H. Kaufman University of Cambridge, UK Gail R. Martin University of California, San Francisco, CA, USA 1998 - lidská ES buněčná linie: J.A. Thomson et al. University of Wisconsin, Madison, WI, USA Nobel Prize 2007 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Postup při vytvoření linie ESCs: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. exprese: AP, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 exprese a aktivita telomerázy (A) Gut-like structures (B) Rosettes of neural epithelium (C) Bone (D) Cartilage (E) Striated muscle (F) Tubules interspersed with structures resembling fetal glomeruli. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. • odstanění zony pelucidy pronázou (proteáza) • imunochirurgické uvolnění ICM (anti-lidský IgG, komplement) • přenesení ICM na feeder-layer (MEFs) • pasážování mechanicky nebo enzymaticky Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. http://portal.gov.cz/app/zakony/zakon.jsp?page=0&fulltext=&nr=227~2F2006&part=&name=&rpp=15#seznam Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Zákon č. 40/2009 Sb., trestní zákoník Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Alternativní metody získání pluripotentních SCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Alternativní metody získání pluripotentních SCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Alternativní metody získání pluripotentních SCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Markery lidských ESCs: • Oct-4 (TF, octamer-4 binding protein) • Nanog (homeobox TF) • SSEA3 SSEA4 (povrchové markery: Stage Specific Embryonic Antigen) • Tra-1-60 Tra-1-81 (Tumor-Rejection Antigen) • alkalická fosfatáza (Tra-2-54) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Kultivační médium pro izolaci lidských ESCs: • DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) • 20% FBS nebo KO-SR (serum replacement) • aditiva (b-merkaptoethanol, Gln, AAs, Atb) • růstové faktory: bFGF (FGF2) • feeder-layer (myší embryonální fibroblasty, lidské fibroblasty): inaktivace mitomycinem-C • matrigel Metody diferenciace lidských ESCs: • kultivace při vyšší densitě • kultivace v přítomnosti dalších buněčných linií • přídavek růstových faktorů / cytokinů do média • aktivace endogenních transkripčních faktorů • suspenzní kultura (tvorba embryoid bodies) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Zachování self-renewal mESCs vs. hESCs • nepotřebují feeder • LIF (leukemia inhibitory factor) • vazba na LIF R a gp130 receptor • aktivace (fosforylace) transcripčního faktoru STAT3 • protiháč: ERK1/2  diferenciace • specifický marker SSEA-1 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Zachování self-renewal mESCs vs. hESCs • potřebují feeder layer nebo • adhezivní matrix (laminin, kolagen IV, heparan sulfát proteoglykany(HSPGs), entaktin – Matrigel) • kondiciované médium z MEF • KO - serum replacement (insulin, transferin, BSA) • FGF-2 (4ng/ml) • aktivace signálních drah: FGF, TGFb rodina - activin, nodal • protiháč: BMP  diferenciace Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Základní signální dráhy ovlivňující self-renewal a pluripotenci Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. feeder-layer myší vs. lidský • druhová odlišnost • odlišnosti v produkci růstových faktorů myší lidský _ Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. hESCs niche • regulace Smad1 signální (diferenciační) dráhy • agonista-BMP2 (bone morphogenic factor) • produkován extra-embryonálním endodermem • antagonista – GDF3 (growth and differentiation factor (GDF) • produkován hESCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. „Adaptované“ lidské ESCs: • ESCs v podmínkách in vitro • změny v karyotypu • nejčastěji zisky (gains) na chromosomech 12, 17 a X • obdobné změny - markery germinálních nádorů • prokázáno již od nízkých pasáží Peter Andrews University of Sheffield Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Baker et al., Nature Biotechnology 2007 trisomie ch17 zisky a ztráty částí chromozomů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Diferenciační protokoly pro ESCs in vitro: • neurony, astrocyty, oligodendrocyty • kardiomyocyty • endoteliální buňky • pankreatické β-buňky • CD34+ hematopoetické progenitorové buňky • antigen-prezentující buňky a NK-buňky • buňky plicního epitelu • osteoblasty • hepatocyty • melanocyty • buňky prostaty Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Přínos studia kmenových buněk • Studium vývoje organismů na buněčné a molekulární úrovni • Nádorová biologie – nádorové KB • Tvorba modelů různých onemocnění • Studium „genových cílů“ pro nová léčiva • Testování léčiv, teratogenních a toxických sloučenin • Studium mechanismů regenerace tkání • Buněčná terapie - náhrada chybějící nebo nefunkční buněčné populace Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. • diferencovaná somatická buňka • reprogramace vývoje • vnesením a spuštěním vhodných genů • změna do „embryonálního“ stádia Indukované pluripotentní kmenové buňky (iPSCs) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. • vytvoření iPSCs bez využití embrya • metoda:“jaderné programování somatických buněk” • 4 geny : Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 • retrovirové vektory (náhodná integrace, nádorová transformace buněk) • přeprogramování kožní buňky na pluripotentní • ověřeno diferenciací a podílem iPSCs na tvorbě embrya (chimerické embryo) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Schéma tvorby myších iPSCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Podíl iPSCs na chimerickém myším embryu epiblast Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. • 4 geny : Oct4, Sox2, Nanog, Lin28 • lentivirové vektory (náhodná integrace, nádorová transformace buněk, nekontrolovaná exprese) • přeprogramování kožní buňky na pluripotentní • ověřeno: celogenomová exprese podobná hESCs, exprese povrchových antigenů, tvorba teratomů po injekci do imunodeficientní myši Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. využití iPSCs • studium vývoje a funkce tkání • transplantační medicína (vlastní buňky) • vývoj a testování léčiv • modelování chorob • léčba genetických poruch (genové inženýrství) • náhrada za hESCs z embryí rizika spojená s přenosem a indukcí exprese nových genů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Příprava tělu vlastních iPSCs Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. • Exprese: Oct4, Nanog, Sox2 • Diferenciace: ektoderm, mesoderm, endoderm • Tvorba teratomů • Tvorba chimér Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.