BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie
EMBRYONÁLNI KMENOVÉ BUNKY
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU
EVROPSKÁ UNIE
MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, I
MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY      pro konkuroncwchopnwt
INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ
Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Program přednášky
• vlastnosti kmenových buněk
• embryonální kmenové buňky
• linie kmenových buněk v podmínkách in vitro
• indukované pluripotentní buňky
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Totipotence
• nelimitovaný diferenciační potenciál
• schopnost tvořit embryonální i extraembryonální tkáně
• časná stádia rýhování zygoty Pluripotence
• schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů
• buňky ICM (embryonální kmenové buňky)
Multipotence
• schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně
• např. hematopoetické kmenové buňky, neuronální kmenové buňky...
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Single Cell Embryo      5-7 Day Embryo I I Totipotent     Embryonic Stern (ES) Cells
Pluripotent
Infant l_
Adult I
"Adult" Stem Cells Multipotent
Cord Blood Stem Cells Placental Stem Cells Multipotent
VLASTNOSTI KMENOVÝCH BUNĚK
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. "^Ina^
Kmenové buňky (Stem Cells, SCs)
= buňky z embrya, fetu nebo dospělého organismu, které se za určitých podmínek mohou neomezeně množit a rovněž dávat vzniknout specializovaným buňkám různých typů tkání
• zdroje kmenových buněk:
embryo, fetus, dospělý organismus [+ placenta, pupečníková krev]
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. "^Ina^
TERMINOLOGIE:
• embryonální SCs (ESCs):
• embryonální kmenové (Embryonic Stem Cells)
• embryonální zárodečné (Embryonic Germ Cells)
• embryonální karcinomové (Embryonic Carcinoma)
• linie embryonálních kmenových buněk
• dospělé (adultní) SCs (ASCs)
• kmenové buňky nádorů (Cancer SCs, CSCs)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Hl MAN SI KM (KLUS
ť. mimoni c
I Hi I
Infant
\.lidi
Blastocyst (5-7 .1 .i v v.
KmlH-vonk stem cells
<......i.l.il i idm
(6 weeks)
Abortus (Fetal tissues)
I llll.lllv.il
cord N.....I
Wharton's Jells
I I
(krmlinc Somatic
Kmhr sonic genu cells
Fetal stem cells
Imbilical cord Umbilical cord Spermatogonia Oogonia blood stem cells     matrii stem cells
1 Hemopoietic	1 M es en dismal	1 Uver	1 Epidermal	1 Neuronal	1 Eye	1 Cut	1 Pancreas?
(skin, hair)
Bone ma mm
Peripheral   Bone marrow blood stroma
Figure 1. Classification of human stem cells.
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
>
Sternness
• sebeobnova
• diferenciace
STEM CELL
SPECIALIZED CELL (e.g., red blood cell)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Sebeobnova (self-renewal)
SCs se mohou dělit po „neomezeně" dlouhou dobu, narozdíl od ostatních buněk organismu
Diferenciace
SCs jsou nespecializované buňky, postupnou diferenciací vznikají specializované typy buněk
Plasticita (Transdiferenciace)
schopnost adultních SCs určitého orgánu nebo tkáně diferencovat do jiného druhu tkáně
Replikační potenciál SCs:
In vivo
• ESCs - tvorba ICM ve stádiu blastocysty
• ASCs - po celou dobu života organismu
In vitro
• ESCst neuronální ASCs - neomezeně
• většina ASCs - omezené dělení
• telomerázová aktivita
ESCs - symetrická mitóza ASCs - asymetrická mitóza
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Replikační potenciál SCs:
A - kmenová buňka B - progenitorová buňka C - diferencovaná buňka
o o
A
O o
A
2 - asymetrické dělení 4 (^)
1 - symetrické dělení
3 - dělení progenitorů
4 - terminálni diferenciace
O o
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
"Niche" (hnízdo) SCs
mikroprostředí (microenvironment):
podpůrné buňky, extracelulární matrix, adhezní molekuly a signální molekuly
udržuje self-renewal SCs chrání před deplecí živin reguluje proliferaci SCs
ASCs - po celou dobu života organismu
niche cells SCs (mitóza)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Diferenciační potenciál lidských SCs
Human Developmental Continuum
■ M
Single-cell l-mbrvo
3-da> Embr>o
totipotent
5-7 dav Embryo
Embryonic Stem (ES) cells Pluripotent
4-u eck Embr>o
6-wcck Embryo
Embryonic Gcrni (EG) cell«
(primordial germ cells)
Pluripotent
Fetal Tissue Stem cells
Mullipotent
' ľc rat oc arc i no ma (germ cell tumor)
'Adult" Stem cells M h/tip nie n t
Cord Blood Stem eclb Placental Stem cells Multipotent
Embryonal Carcinoma (EC) cells
Pluripotent
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. "^InaV
Embryonální zárodečné buňky (EG celis)
• vznik z primordiálních zárodečných buněk (PG celis)
• migrují v embryu do genitální lišty
• později společně se somatickými buňkami tvoří gonády
• izolace ve vhodný čas + kultivace in vitro —> pluripotentní (EG celis)
• lidské EGCs netvoří teratomy ani chiméry
Fetální kmenové buňky
• primitivní (málo diferencované) buňky v orgánech fétu
• např: KB neurální lišty, hematopoetické KB, pankreatické progenitory, neurální KB
• izolovány z abortovaných fétů
Kmenové buňky z pupečníku
pupečníková krev - hematopoetické KB (HSCs), endoteliální progenitory, mezenchymální KB (MSCs), VSELs... Whartonův rosol - zdroj mezenchymálních KB (MSCs)
• většinou jsou multipotentní
• buňky tvoří kolonie, mohou být kultivovány a mají dlouhé telomery
• vyšší imunologická kompatibilita než buňky KD
• HSCs - frekvence výskytu minimálně stejná jako v kostní d
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. "^Ina^
Schopnosti ESCs
(a) No feeders or LIF
Primitive endoderm
Embryoid body
Blastocyst
in vitro culture
ES cell clump
A * ♦ * *
(b) Injection into blastocyst
Chimeric mice
(c) Implantation into mouse
Tumor
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Embryonic Stom ColU
Tromfe* or lfm c*ět to mouie btojtocyti
Normal btottocyir
Normal Wosfocyit
Embryonic Carcinoma Colls
TetncUar tefo'oco'Cino-'-a
Normal Nouocytf
Typy mESCs
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
>
y.
ty
S/J
Izolace a indukovaná diferenciace ESCs
SELECTION OF NESTIN-POSITIVE CELLS
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
SELECTION OF NESTIN-POSITIVE CELLS
N2 medlum/bFGF, lamlnln
N2 medlum/bFGF/ B27 media supplement
Expansion Phase
NESTIN-POSITIVE NEURONAL NESTIN-POSITIVE PANCREATIC
PRECURSOR CELLS PROGENITOR CELLS
Remove bFGF
Differentiation Phase
Remove bFGF Add nicotinamide
DOPAMINE- AND SEROTONIN-SECRETING NEURONS
TYROSINE HYDRO XYLASE/SEROTONIN
INSULIN-SECRETING PANCREATIC ISLET-LIKE CLUSTERS
INSULIN/GLUCAGON
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
UNIE EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK V PODMÍNKÁCH IN VITRO
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
1981 - myší ES buněčná linie:
MJ. Evans and M.H. Kaufman University of Cambridge, UK
Gail R. Martin -
Nobel Prize 2007
University of California, San Francisco, CA, USA
1998 - lidská ES buněčná linie:
J.A. Thomson et al. University of Wisconsin, Madison, Wl, USA
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
>
y.
jmi
ty
EftaMatod •mfcryonéc ft*m c*i c«* cutia**
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts
James A. Thomson,* Joseph Itskovitz-Eldor, Sander S. Shapiro, Michelle A. Waknitz. Jennifer J. Swiergiel, Vivienne S. Marshall,
Jeffrey M. Jones
Science 282, 1145(1998);
exprese a aktivita telomere zy
A — C —	B ,JF D —
E -	F —
exprese: AP, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81
(A) Gut-like structures (B) Rosettes of neural epithelium (C) Bone (D) Cartilage (E) Striated muscle (F) Tubules interspersed with
structures resembling fetal glomer^řř,ERff£
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Derivation and characterization of new human embryonic stem cell lines in Czech Republic
Aleš Hampl u"\ Stanislava Košková \ Martina Vodinská , and Petr Dvorak
• odstanění zony pelucidy pronázou (proteáza) imunochirurgické uvolnění ICM (anti-lidský IgG, komplement)
• přenesení ICM na feeder-layer (MEFs)
• pasážování mechanicky nebo enzymaticky
A mléut \	B	C
D	E	F
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Czech stem-cell work heightens calls for EU ruling
Alison Abbott_
^»Czech scientists say they have derived three^ human embryonic stem-cell lines from spare embryos stored at an in vitro fertilization clinic in Brno.
This makes the Czech Republic the first of the eastern European countries poised to join the European Union (EU) to move into sjhis controversial research area. *
It also adds to pressure on the EU to decide whether to fund research on newly derived stem-cell lines. This research is
602
allowed under strict ethical supervision in some EU countries, such as Britain and Sweden, but is banned in others, including Germany and Italy. Last week the Spanish government changed sides and approved a proposed law to allow the production of cell lines from spare embryos for research.
The Czech Republic has no law controlling human embryonic stem-cell research. But Eva
Sykova, head of the Centre for Cell Therapy and Tissue Repair at Charles University in Prague, who developed the three cell lines
together with colleagues at the Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno, says they are working to high ethical standards. They received informed consent from donor couples undergoing in vitro fertilization, she points out.
The scientists are now characterizing the lines, and plan to study the cells' potential to develop into differentiated cells such as neurons, which they believe could have therapeutic potential. They presented their results at a meeting in Prague last month. ■
NATURE VOI.424 7AUGUST2003 www.nature.com/nature
227
ZÁKON
ze dne 26. dubna 2006
o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách a souvisejících činnostech a o zmčnč některých souvisejících zákonu
http://portal.gov.cz/app/zakony/zakon. jsp?page=0&fulltext=&nr=227~2F2006&part=&name=&rpp=15#sea^ňf S/7^
-11)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Zákon č. 40/2009 Sb., trestní zákoník
§ 167 Nedovolené nakládání s lidským embryem a lidským genomem
(1) Kdo v rozporu s jiným právním předpisem
a) použije pro výzkum lidské embryo nebo větší množství lidských embryonálních kmenových buněk nebo jejich linií,
b) doveze nebo vyveze lidské embryo nebo větší množství lidských embryonálních kmenových buněk nebo jejich linií, nebo
c) přenese lidský genom do buněk jiného živočišného druhu nebo naopak, bude potrestán odnětím svobody až na tři léta nebo zákazem činnosti.
(2) Stejně bude potrestán,
a) kdo provádí zákroky směřující k vytvoření lidského embrya pro jiný účel než pro přenesení do ženského organizmu,
b) kdo přenese vytvořené lidské embryo do dělohy jiného živočišného druhu, nebo
c) kdo během výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách provádí s těmito buňkami manipulace směřující k vytvoření nového lidského jedince (reprodukční klonování).
(3) Odnětím svobody na tři léta až osm let nebo propadnutím majetku bude pachatel potrestán,
a) spáchá-li čin uvedený v odstavci 1 nebo 2 jako člen organizované skupiny,
b) spáchá-li takový čin opětovně, nebo
c) získá-li takovým činem pro sebe nebo pro jiného značný prospěch.
(4) Odnětím svobody na pět až dvanáct let nebo propadnutím majetku bude pachatel potrestán,
a) spáchá-li čin uvedený v odstavci 1 nebo 2 ve spojení s organizovanou skupinou působící ve více státech, nebo
b) získá-li takovým činem pro sebe nebo pro jiného prospěch velkého rozsahu.
(5) Příprava je trestná.
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Alternativní metody získání pluripotentních SCs
A. Traditional Derivation of hESCs
Sperm Oocyte 8-cell stage
Blastocyst
Strict hESC hESC Mne
culture conditions
Blastomere
Implantation
B. Embryonic Germ Cells (EGCs)
Magnified view of the genital ridge
6 week embryo
Strict hESC culture conditions
Primordial Germ Cell
- the future sperm or egg cell
Embryonic Germ Cell line
i
C. "Dead" Embryos
6
So-called irreversible arrest of cell division
Strict hESC culture conditions
hESC line
"Dead" embryo
Embryo presumed to be incapable of establishing a viable pregnancy
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
>
y.
Alternativní metody získání pluripotentních SCs
D. Genetically Abnormal Embryos y PGD identifies Disease-bearing
Remove blastomere, presům harminc embryo
presumably without ^ A
harming the
genetic defect hESC line
Embryo not used to establish pregnancy to avoid generating offspring with genetic defect
E. Single-Cell Embryo Biopsy Method
Remove blastomere, presumably without harming the embryo
hESC line
F. Parthenogenesis
Parthenogenetic activation
(Trick the egg into behaving as if it's fertilized)
a
Strict hESC culture conditions -
hESC line
S5
Embryo not capable of establishing a viable pregnancy
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
>
y.
Alternativní metody získání pluripotentních SCs
i
G. Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT)
Nucleus from a somatic cell Artificially activate
^ ^-^y    the egg
Enucleated oocyte (egg with its own nucleus removed)
Strict hESC culture conditions
SCNT pluripotent stem-cell line
Not known whether the SCNT-embryo (in humans) could give rise to a viable pregnancy
H. SCNT Using an Embryo at Mitosis
Zygote arrested at mitosis using drug treatment
Chromosomes removed
and injected into enucleated zygote
Strict hESC culture conditions
ESC line
Not known if embryo (in humans) could give rise to a viable pregnancy
I. Altered Nuclear Transfer (ANT) cdx2 gene     strict hESC        ANT pluripotent
cdx2-deficient turned culture conditions    stem-cell line
I nucleus back on
ANT embryo not capable of implanting,
Enucleated oocyte 80 cannot establish
viable pregnancy
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. ^wf!
-v
Markery lidských ESCs:
• Oct-4 (TF, octamer-4 binding protein)
• Nanog (homeobox TF)
• SSEA3 SSEA4
(povrchové markery: Stage Specific Embryonic Antigen)
• Tra-1-60 Tra-1-81
(Tumor-Rejection Antigen)
• alkalická fosfatáza (Tra-2-54)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Kultivační médium pro izolaci lidských ESCs:
• DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)
• 20% FBS nebo KO-SR (serum replacement)
• aditiva ((3-merkaptoethanol, Gin, AAs, Atb)
• růstové faktory: bFGF (FGF2)
• feeder-layer (myší embryonální fibroblasty, lidské fibroblasty): inaktivace mitomycinem-C
• matrigel
Metody diferenciace lidských ESCs:
• kultivace při vyšší densitě
• kultivace v přítomnosti dalších buněčných linií
• přídavek růstových faktorů / cytokinů do média
• aktivace endogenních transkripčních faktorů
• suspenzní kultura (tvorba embryoid bodies)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Zachování self-renewal mESCs vs. hESCs
• nepotřebují feeder
• LIF (leukemia inhibitory factor)
• vazba na LIF R a gpl30 receptor
• aktivace (fosforylace) transcripčního faktoru STAT3
• protiháč: ERK1/2 —» diferenciace
• specifický marker SSEA-1
ff
Blastocyst /^^l
Inner cell mass
Embryonic stem cells
Cell receptors
Plasma membrane
\
Transcription STAT factor
Signal Transduction Pathway
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Zachování self-renewal mESCs vs. hESCs
• potřebují feeder layer nebo
• adhezivní matrix (laminin, kolagen IV, heparan sulfát proteoglykany(HSPGs), entaktin - Matrigel)
• kondiciované médium z MEF
• KO - serum replacement (insulin, transferin, BSA)
• FGF-2 (4ng/ml)
• aktivace signálních drah: FGF, TGF(3 rodina - activin, nodal
• protiháč: BMP —» diferenciace
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Základní signální dráhy ovlivňující self-renewal a pluripotent
TGF-ß/Activin/Nodal
IGF-IR
FGFR
OA
a. Frizzled
■ ß-Catenin
I I
Eric 1/2 p-Catonin Smad2/3 Smad4
NIC D
Smad2/3
Smad 1/5/8 Smad4 *nad1/5/B
Catenin Smad2/3 Smadl/S/8
Gene Expression / Gene Expression
♦__r
^ Gene Expression
Oct 4      Sox2 Nnnog
I and Seit Renewal
hESC markers Oct-4 SSEA3/4 Sox2 TRA-1-60 Nanog   TRA-1-81
Differentiation
Endoderm Mesoderm Ectoderm
Primordial Germ Cells
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
>
y.
IP
S/J
feeder-layer
myší vs. lidský
• druhová odlišnost
• odlišnosti v produkci růstových faktorů
myši
CF1
lidsky
CRL 2429
SCRC 1042
MEFs
HFFs
CF 1   1041   1042  1043   1044   2429 control
B
MEFs _HFFs_
CF 1   1041    1042    1043     1044 2429
FGF-2
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
>
y.
jmi
hESCs niche
• regulace Smadl signální (diferenciační) dráhy
• agonista-BMP2 (bone morphogenic factor)
• produkován extra-embryonálním endodermem
• antagonista - GDF3 (growth and differentiation factor (GDF)
• produkován hESCs
A Extra-embryonic Human embryonic stem
endoderm (ExE) cells (hESCs)
„Adaptované" lidské ESCs:
• ESCs v podmínkách in vitro
• změny v karyotypu
• nejčastěji zisky (gains) na chromosomech 12, 17 a X
• obdobné změny - markery germinálních nádorů
• prokázáno již od nízkých pasáží
n li n n u
li U II li II II
e 9
10 11
US?
12
li I» h ti
13 14 15 16
Í5S
1/
19 20
21 22
li
II
16
Y
Peter Andrews University of Sheffield
aVjbrs/>
Ill
3
=
1
=
16
20
21
zisky a ztráty částí chromozomů
17
12
III
■0
ro
Ž 50J ^ 40
i'
trisomie chl7
H14.*3*6 H14»3»1S H14.*3»20 H14«3.27
Passage number
H14»3.32
Baker et al., Nature Biotechnology 2007
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
>
(/i
y.
jmi
ty
S/J
7043
Pluripotent Stern Cells
( Totipotent )
In vivo fertilized egg
8 cell embryo
Cultured undifferentiated stem cells
Neural cells
Cardiac muscle
Blood cells
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
>
y.
ty
s/j
Diferenciační protokoly pro ESCs in vitro:
• neuróny, astrocyty, oligodendrocyty
• kardiomyocyty
• endoteliální bunky
• pankreatické (3-buňky
• CD34+ hematopoetické progenitorové bunky
• antigen-prezentující bunky a NK-buňky
• bunky plicního epitelu
• osteoblasty
• hepatocyty
• melanocyty
• bunky prostaty
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Přínos studia kmenových buněk
• Studium vývoje organismů na buněčné a molekulární úrovni
• Nádorová biologie - nádorové KB
• Tvorba modelů různých onemocnění
• Studium „genových cílů" pro nová léčiva
• Testování léčiv, teratogenních a toxických sloučenin
• Studium mechanismů regenerace tkání
• Buněčná terapie - náhrada chybějící nebo nefunkční buněčné populace
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Indukované pluripotentní kmenové buňky (iPSCs)
diferencovaná somatická buňka
reprogramace vývoje
vnesením a spuštěním vhodných genů
změna do „embryonálního" stádia
Late Embryo IS to 16 days
Lineage committed cells
Adult stem cells can give rise to specific tissue families
Hair A skin tissue family
Induced Pluripotent stem cells
Mature body cells reprogramed
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
>
y.
jmi
Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors
Kazutoshi Takahashi1 and Shhya Yamanaka1 ~'
1 Department of Stem Cel Biology. Institute far Frontier Medical Sciences. Kyoto University. Kyoto 606-8507. Japan ' CREST. Japan Science and Technology Agency. Kawagucfi 332-0012. Japan "Contact: yarranaKa0frontier.kyoto-u.ac.jp
Do.iaioi6^.ce.L2oo6.o7.o24 CeH 726, 663-676, August 25, 2006
vytvoření iPSCs bez využití embrya
metoda:"jaderné programování somatických buněk"
4 geny : 0ct4, Sox2, c-Myc, Klf4
retrovirové vektory (náhodná integrace, nádorová transformace buněk)
přeprogramování kožní buňky na pluripotentní
ověřeno diferenciací a podílem iPSCs na tvorbě embrya (chimérické embryo)
>
y.
ft
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. ^Mna^
Schéma tvorby myších iPSCs
broblast
Expression of factors
.10 ■
Days after infection 20
-30-
SSEA1
c c «>
HI
.. . Time of transgene expression "   required for ^programming
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Podíl iPSCs na chimérickém myším embryu
Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells
Junying Yu,1,2* Maxim A. Vodyanik,2 Kim Smuga-Otto,1,2 Jessica Antosiewia-Bourget,1,2 Jennifer L Frane,1 Shulan Tian/ Jeff Nie,3 Gudrun A. Jonsdottir,3 Victor Ruotti,i Ron Stewart,3 Igor I. Slukvin,2,4 James A. Thomson1*2,5*
Science ZW, 1917(2007);
• 4 geny : Oct4, Sox2, Nanog, Lin28
• lentivirové vektory (náhodná integrace, nádorová transformace buněk, nekontrolovaná exprese)
• přeprogramování kožní buňky na pluripotentní
• ověřeno: celogenomová exprese podobná hESCs, exprese povrchových antigénu, tvorba teratomů po injekci do imunodeficientní myši
využití iPSCs
• studium vývoje a funkce tkání
• transplantační medicína (vlastní buňky)
• vývoj a testování léčiv
• modelování chorob
• léčba genetických poruch (genové inženýrství)
• náhrada za hESCs z embryí
rizika spojená s přenosem a indukcí exprese nových genů
Virus cames reprogramnwg fadors rto somittc cdTt nudeus
Sonubccdis reprogrammed
Cuíixe as per
hESCs
M.......t, ,j
I | |
.PSCkne
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Příprava tělu vlastních iPSCs
<Kľf?>
Add reprogramming factors as virus, plasmid or protein
Obtain somatic cells from patient and expand
^3
Wait two days
^
Unpurified early iPSCs
Expand, test and validate colonies
Clonal patient-matched iPSCs
OiOOOO
oootoo •oooot
oo»ooq
Culture 2-4 weeks
Wait two days
Pick colonies and re-plate at clonal density
Feeder cells (or defined media)
Re-plate in ES
media.
Wait 1-2 weeks
FIG. 1. Direct reprogramming. Somatic cells are obtained from a patient and expanded if necessary. Reprogramming factors are added, and the pluripotent state is induced. iPSCs are cultured in embryonic stem (ES) cell media for 1-2 weeks, after which colonies are isolated at clonal densities and expanded. iPSCs, induced pluripotent stem cells.
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4. ^vS^
ARTICLE
doi:10.1038/naturel2968
Stimulus-triggered fate conversion of somatic cells into pluripotency
Haruko Obokata1,2,3, Teruhiko Wakayama3*, Yoshiki Sasai4, Koji Kojima1, Martin P. VacantiLS, Hitoshi Niwab, Masayuki Yamato7 & Charles A. Vacanti1
Here we report a unique cellular reprogramming phenomenon, calkxl stimulus-triggered acquisition of pluripotency i SI \l' i. which requires neither nuck-ar transfer nor the introduction of transcription factors. In STAP. Strong external stimuli such as ajransknt low pi 1 st lessor rcprogrammed mammalian somatic cells| resulting in the generation of phi-ripotent cells. Through real time imaging ol SI AP cells 35 i\cd Irom puritied lymphoc\ tes. .is well as gene rearrangement analysis, we found that committed somatic cells give rise to STAP cells by reprogramming rather than selection. STAP cells showed a substantial decrease in DNA methylation in the regulatory regions of pluripotency marker genes Blastocyst injection showed that STAP cells efficiently contribute to chimaeric embryos and to offspring via germline transmission. We also demonstrate the derivation of robustly expandable pluripotent cell lines from STAPcells. Thus, our findings indicate that epigenetic fatedetermination of mammalian cells can be markedly converted in a context-dependent manner by strong environmental cues.
30 JANUARY 2014 I VOL SOS I NATURE I 641
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
Lymphocyte fraction
Spleen {Oct4-gfp)
FACS sorting
CD45<
pH 5.7 37 °C, 25 min
Centrifugation
-►
Remove supernatant
Resuspend in medium
DMEM/F12 medium (B27+LIF)
	600-i
	
0) ««—	500-
sual	400-
>	
0) CL	300-
_C/)	
d) u	200-
d)	
-Q C3	100-
>	
Ocf4-GFP+ OcM-GFP"
I i
I »
dO d1   d2  d3  d4  d5  d6 d7
• Exprese: Oct4, Nanog, Sox2
• Diferenciace: ektoderm, mesoderm, endoderm
• Tvorba teratomů
• Tvorba chimér
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
>
(/i
jmi
Obokata falsified data in STAP papers: probe
Riken report slams scientist's lack of'ethics'
Bi8120 Aplikovana bunecna biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
A glossary for stem-cell biology
Austin Smith1
Stem-cell biology is in a phase of dynamic expansion and is forming connections with a broad range of basic and applied disciplines. The field is simultaneously exposed to public and political scrutiny. A common language in the stem-cell community is an important tool for coherent exposition to these diverse audiences, not least because certain terms in the stem-cell vocabulary are used differently in other fields.
Asymmetric division Generation of distinct fates in progeny from a single mitosis. Oriented division may position daughter cells in different microenvironments or intrinsic determinants may be segregated into only one daughter. Observed in some but not all stem cells and can occur in other types of progenitor cell.
Niche Cellular microenvironment providing support and stimuli necessary to sustain self-renewal.
Plasticity Unproven notion that tissue stem cells may broaden potency in response to physiological demands or insults.
Cancer cell of origin Precancerous cell that gives risetoa cancer stem cell. May be a mutated stem cell, or a committed progenitor that has acquired self-renewal capacity through mutation.
Cancer-initiating cell General term that encompasses both cancer cell of origin and cancer stem cell.
Cancer stem cell Self-renewing cell responsible for sustaining a cancer and for producing differentiated progeny that form the bulk of the cancer. Cancer stem cells identified in leukaemias and certain solid tumours are critical therapeutic targets.
Cell replacementtherapy Reconstitution of tissue by functional incorporation of transplanted stem-cell progeny. Distinct from 'bystander' trophic, anti-inflammatory or immunomodulatory effects of introduced cells.
Clonal analysis Investigation of properties of single cells. Essential for formal demonstration of self-renewal and potency.
Potency The range of commitment options available to a cell.
Totipotent Sufficient to form entire organism. Totipotency is seen in zygote and plant meristem cells; not demonstrated for any vertebrate stem cell.
Pluripotent Able to form all the body's cell lineages, including germ cells, and some or even all extraembryonic cell types. Example: embryonic stem cells.
Mu Itipotent Can form multiple lineages that constitute an entire tissue or tissues. Example: haematopoietic stem cells. Oligopotent Able to form two or more lineages within a tissue. Example: a neural stem cell that can create a subset of neurons in the brain. Unipotent Forms a single lineage. Example: spermatogonia! stem cells.
Progenitor cell Generic term for any dividing cell with the capacity to differentiate. Includes putative stem cells in which self-renewal has not yet been demonstrated.
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.
>
(/i
Commitment Engaging in a programme leading to differentiation. For a stem cell, this means exit from self-renewal.
Embryonic stem cell Pluripotent stem-cell lines derived from early embryos before formation of the tissue germ layers.
Founder/ancestor/precursor cell General terms for cell without self-renewal ability that contributes to tissue formation. In some cases they generate tissue stem cells.
Immortal strand The hypothesis of selective retention of parental DN A strands during asymmetric self-renewal. Potential mechanism to protect stem cells from the mutations associated with replication.
In vitro stem cell Self-renewal ex w'vo in cells that do not overtly behave as stem cells in vivo. Occurs due to liberation from inductive commitment signals or by creation of a synthetic stem-cell state.
Label-retaining cell Candidate for adult tissue stem cell because of slow division rate and/or immortal strand retention. Interpret with caution.
Lineage priming Promiscuous expression in stem cells of genes associated with differentiation programmes.
Long-term reconst'rtution Lifelong renewal of tissue by transplanted cells. The definitive assay for haematopoietic, epidermal and spermatogonia! stem cells. Transplantation assay may not be appropriate for all tissues.
Regenerative medicine Reconstruction of diseased or injured tissue by activation of endogenous cells or by cell transplantation.
Reprogramming Increase in potency. Occurs naturally in regenerative organisms (dedifferentiation). Induced experimentally in mammalian cells by nuclear transfer, cell fusion, genetic manipulation or in vitro culture.
Self-renewal Cycles of division that repeatedly generate at least one daughter equivalent tothemothercell with latent capacity for differentiation. This is the defining property of stem cells.
Stem cell A cell that can continuously produce unaltered daughters and also has the ability to produce daughter cells that have different more restricted properties.
Stem-cell homeostasis Persistence of tissue stem-cell pool throughout life. Requires balancing symmetric self-renewal with differentiative divisions at the population level, or sustained asymmetric self-renewal.
Sternness Unproven notion that different stem cells are regulated by common genes and mechanisms.
Tissue stem cell Derived from, or resident in, a fetal or adult tissue, with potency limited tocells of that tissue. These cells sustain turnover and repair throughout life in some tissues.
Transit-amplifying cell Proliferative stem-cell progeny fated for differentiation. Initially may not be committed and may retain self-renewal.
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 08 / 7.4.