BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - 14.4.2014 Adultní a nádorové kmenové buňky doc. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OPVidělávání y^^ď MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost '4řfAP INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky 2 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 Proqram ořednášk 3 Adultní kmenové buňkv (ASCs' biologické vlastnosti a diferenciační potenciál transdiferenciace, EMT mikroprostředí (niche) ASCs využití ASCs pro buněčné terapie -» 28.4.2014 Nádorové kmenové buňky (CSCs) biologické vlastnosti a hypotézy vzniku CSCs markery CSCs možnosti cílené protinádorové terapie BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 ADULTNI KMENOVÉ BUNKY (ADULT STEM CELLS, ASCs) Bi8120 Aplikovaná bunečná biologie 7 09/ 14.4.2014 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /1 Typy ASCs: • mozek • krev • rohovka • sítnice • srdce • tuková tkáň • kůže • dřeň zubu • kostní dřeň • cévy • kosterní svalstvo • střeva • pupečníková krev .4.2014 O c Cord Blood Stem Call Neural Stem Cell O O O € CO Plalelels Red Blood White Blood Mesenchymal Glial Cells Neurons Cells Cells Cells Lidské SCs kostní dřeně BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 f, j- Ii 0 ■:h Plasticita hematopoetických SCs 8 Bone mirrow celil 3one mlrrow zontami man/ Ultful tltťn ctili iclccitd A and (j*ůwf. N curii cellf Mu*cle Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie 7 09/ 14.4.2014 > Izolace hematopoetických SCs pomocí FACS BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 Transdiferenciace = schopnost buněk diferencovat do fenotypu charakteristického pro jiný typ tkáně nebo orgánu, než byla tkáň původní • hematopoetické SCs —► kardiomyocyty, hepatocyty Rataiczak et al. 2006 • populace velmi malých buněk v kostní dřeni, 855 85*3 Mini review REVIEW ARTICLE _Cancer Initiating Cells or Cancer ——^-^^Stem Cells in the Gastrointestinal Tract and Liver Tumour-initiating cells vs. cancer 'stem1 cells and CD 133: What's in the name? Jiri Neužil íl~b~*. Marina Stantic a, Renata Zobalova a,b, Jaromíra Chladová b, Xiufang Wang a, Lubomír Procházka a,c, Lanfeng Dong a, Ladislav Andera d, Slephen J. Ralph e GANG-MING ZOU* ANCES STEM-CELLS Cancer Stem Cells Identification and Targets Sbarmih fíttpat I» Ijfr \jk m 0 # * y& jé. 4$ + '+ A <$ *^ i[tmí*-ll H uUuff Md R«]íň»fathrt iUdKln* Alison L.Allan Editor Cancer Stem Cells in Solid Tumors ttč HumanaFre&s Cancer. Stem Cells Methods and Protocols t- *3 T - 4 ,S CANCER STEM CELLS THÍGfllEiftMJPPACl it i:r'l b, ManUi Unlá Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie 7 09/ 14.4.2014 o, ^^^^ • Semi nars in Cancer Biology 22(2012)462-470 17 ELSFVTHR Contents lists available at SciVerse ScienceDirect Seminars in Cancer Biology journal homepage: www.elsevier.com/locate/semcancer Review The bed and the bugs: Interactions between the tumor microenvironment and cancer stem cells Zafira Castanoa>b<1, Christine M. Fillmore c-d>c fl, Carla F. Kimc def, Sandra S. McAllister3 bf s * Stem Cell Rev and Rep (2011) 7:227-731 DOI 10.1007/s 1201 5-010-9194-6 Seeing is Believing: Are Cancer Stem Cells the Loch Ness Monster of Tumor Biology? Justin D. Lathia ■ Monica Venere ■ Mahenilra S. Rao ■ Jeremy IV. Rich UROLOGIC ONCOLOGY Urologie Oncology: Seminars and Original Investigations 26 (200S) 581-589 ~ Review article "Cancer stem cells"—Lessons from Hercules to fight the Hydra Felix Roman Moltzahn, M.D.1. Jens-Peter Volkmer, M.D.1-*. Daniel Rottke, M.D., Rolf Ackermann. M.D.2 - IMI i Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 v5*w** 18 Journal of Pathology j Ptrtbol 2009; 21 7: 282-298 Published online 23 September 2008 in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com) DOI: 10.1002/path.2453 Invited Review Stem cells in liver regeneration, fibrosis and cancer: the good, the bad and the ugly _WFVIFW APTiriF Cytometry Die Hard: Are Cancer Stem Cells the Bruce Willises of Tumor Biology? FOLIA HISTOt HEMICA ET CYTOBIOLOGIC A Vol. 43. No. 4,2005 pp. 175-181 Cancer stem cells - normal stem cells "Jedi" that went over to the "dark side" Mariusz Z. Ratajczak ie 7 09/ 14.4.2014 Zásadní změna pohledu na biologii nádorů A. stochastický/klonálně evoluční model B. CSCs model 19 —X —"N.---_ / /\ ® o 9o • • O Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie 7 09/ 14.4.2014 20 Heteroqenní prostředí ^BCAF HTAM •Lymphocyte QTlCs r ,/TAC* TDI 1 T O O -* 1 % 1 solidního nádoru C = kapilára N = nekróza TAM = tumor-associated marcophages TICs = tumor initiating cells (= CSCs) TACs = transiently amplifying cells TD = terminally differentiated cells 4*RS& ilMlf BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 ^%Z^ Přehled bioloqickvch vlastností CSCs: specifické m i kro prostředí (niche) ^^^f^ schopnost sebeobnovy (self-renewal) proliferační potenciál / schopnost asymetrického dělení diferenciační potenciál vysoká telomerázová aktivita specifické markery, resp. jejich kombinace specifické signální dráhy (Wnt, Notch, SHH) rezistence vůči apoptóze metastatický potenciál / schopnost epiteliálně-mesenchymální transice (EMT) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 Mikroprostředí (niche) CSCs v solidních nádorech: hypoxie, ECM, mezibuněčné interakce, extracelulární (secernované) faktory a signály = "tissue makeup" 22 Blood vessels Secreted factors Stroma CSC Non-CSC tumor cells CSC niche Self-renewal ->- Differentiation Drug resistance Radiation resistance CSC-specific antigens O Siem cell niche Stem cell Asymmetrie division Daughter cell tfo Progenitor cells Lineage-committed cells Current Opinion in Biotechnology Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie 7 09/ 14.4.2014 Diferenciační potenciál CSCs 23 Diferenciace CSCs z nádoru mozku v podmínkách in vitra neurony astrocyty nediferencované CSCs Metastatický potenciál CSCs • změny interakcí s ECM • vytváření invadopodií (participace CD133?) • u CSCs karcinomů schopnost EMT/MET 24 LYMPHATIC VESSEL PRIMARY HNSeC (tumor nest) BLOOD VESSEL © Epithelial cancer cell Cancer siem cell Cancer stem cell undergoing EMT Tumor associated fibroblast DISTANT metastasis Bi8120 Aplikovaná bunečná biologie 7 09/ 14.4.2014 25 'Otézv vzniku CSCs nádorová transformace embryonálních SCs (aberantní depozity embryonálních SCs v organismu) nádorová transformace adultních SCs, resp. progenitorových buněk v příslušné tkáni nádorová transformace diferencovaných buněk ve tkáni (mutace podmiňující dediferenciaci na fenotyp CSCs) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 Hypotézy vzniku CSCs: 26 Self-renewal > c LU Progenitor cells i Differentiated cells Self-renewal O \^/ Tumour ^ffi^N progression Cancer stem cell 27 SCs normální tkané: • hematopoetické SCs • neurálníSCs • neuroektodermální SCs • epiteliální SCs prsní žlázy • epiteliální SCs renálních tubulů • SCs jaterní tkáně • ovaria lni epiteliální SCs • cervikální epiteliální SCs • epiteliální SCs sítnice nádoru: Odpovídající typ • leukémie • nádory mozku • neuroblastom • nádor prsu • Wilmsův tumor hepatoblastom karcinom vaječníku karcinom děložního krčku retinoblastom BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 Vznik nádoru v důsledku transformace ASCs nebo progenitorů: karcinom prsu Basal-like breast cancer Bi potential breast epithelial stem cell S as a I-I ike breast cancer stem cell Luminal breast cancer stem cell Bipotemial progenitor Myoepithelial Lumim| progenitors progenitors I Luminal breast cancer 1 O Differentiated myoepithelial cells CD1Q-, SMA\CK14' Differentiated luminal epirheiial cells Muc1\CD24\CK1Ů' IUI CD24* lo Distant metastasis Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie 7 09/ 14.4.2014 Funkční testv fenotvou CSCs 48 • tvorba agregátů (aggregation assay) • tvorba kolonií (colony forming assay) • tvorba sfér (sphere formation assay) • testy klonogenity (clonogenicity assay) • testy tumorigenicity (tumorigenicity assay) —w BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 Tvorba agregátů (aggregation assay) 49 • kultivace buněčných suspenzí v nádobkách s neupraveným povrchem nebo metoda visících kapek (hanging drops) Tvorba kolonií (colony-forming assay) • vysetí naředěné buněčné na kultivační misky vytváření kolonií 50 Collagen Solution Serum-free MegaCurt*-C rnedium containing growth factors Mouse CFU-Mk Double chamber cj iure s;il1= J rate, fix and stain megakaryocytes for acetylcholinesterase activity Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie 7 09/ 14.4.2014 51 !:■'■■■ Aq.ir Mnlnx PDGFoľ KRAS-diiven q : .. ..i .i. E-B4vyv TrUiironwmJ C*Hb Irjn.r.md, . r.irin . j. i C nl i um »p*r>in>n'' Furnijil n m i il Cr ľ PTp-plvlp dHnljI-Fri. Bi8120 Aplikovaná bunečná biologie 7 09/ 14.4.2014 '.■■I ■■■■ M CVIILIIT ri.,n-.i,,i,n inn rl«i[[rt»*tl MTT 52 Testy klonogenity (clonogenicity assay) • inokulace izolovaných buněk do 96-jamkových destiček, proliferace a tvorba kolonií (>50 buněk) • holoklony, meroklony, paraklony Rhabdomyosarkornová linie NSTS-11: test tumorigenicity v NOD/SCID myších ^^^^^^^^^^^ \ T i' i . f b _ e / ■ Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie 7 09/ 14.4.2014 55 Rhabdomyosarkornová linie NSTS-11: IHC analýza xenograftů M3A138 M3B138 M3C138 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 Rhabdomyosa r kornová linie NSTS-11: IHC analýza xenograftu Příklad komplexní analýzy CSCs in vitro (Osteosarkom) ß BS2 BS 12 GS IS BS 16 HTIOflO Narwg OCT3/4 GADPI1 AS AS AS AS AS (Tirino et al., FASEB J, 2011) CD 133 58 Příklad komplexní analýzy CSCs in vitro (Osteosarkom) (Tirino et al., FASEB J, 2011) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 59 Důsledky "paradigmatu CSCs" pro léčbu nádorů: • selhání klasické protinádorové léčby (chemorezistence a radiorezistence CSCs) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 60 Konvenční vs. cílená protinádorová léčba: Drugs specifically targetin differentiated cells J Complete remission Relapse Differentiated cancer cells Cancer stem cells Drugs specifically targeting cancer stem cells Initially no clinical response is detected by traditional criteria Eventually cancer stops producing new cells Cure Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie 7 09/ 14.4.2014 Mechanismy chemorezistence CSCs: • účinná schopnost reparace DNA • variabilní exprese a fosforylace kináz • nízká proliferační aktivita (Ki67 index) • aktivní mechanismy "multidrug resistance" (exprese ABC transportérů) Mechanismy radiorezistence CSCs: • účinná schopnost reparace DNA • nízká proliferační aktivita (Ki67 index) • overexprese antiapoptotických genů BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 61 Možné strateaie léčbv cílené proti CSCs 62 • ovlivnění interakcí mezi CSCs a mi kro prostředím • indukovaná diferenciace • ovlivnění signálních drah udržujících sebeobnovu Riziko: poškozeních adultních SCs v nenádorové tkáni normal cell tumorígenic cell seff-renewal renewal of malignant potential non-selective targeting O shared renewal mechanisms normal cell tumorigenk cell self-fen ewa I renewal of malignant potential selective targeting different renewal mechanisms Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie 7 09/ 14.4.2014 63 Příklady konkrétních strategií léčby cílené proti CSCs: • onkolytická virová terapie s využitím modifikovaných adenovirových vektorů proti CD44+/CD24" buňkám - karcinom prsu • anti-EpCAM monoklonální protilátka - karcinom pankreatu • ATRA-ind u kovaná diferenciace - neuroblastom BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 /14.4.2014 Review Cel Pharmacogenomics and cancer stem cells: a changing landscape? Francesco Crea1, Maria Ana Duhagon2, William L. Farrar3 and Romano Danesi1 Stem Cells' Translational and Clinical Research Concise Review: Stem Cells As an Emerging Platform for Antibody Therapy of Cancer Richard T. Frank,8** Joseph Najbauer," Karen S. Aboody:i'<: Nanomedicine April 2012, Vol. 7, No. 4, Pages 597-615 , DOI 10.2217/nnm.l2.22 (doi:10.2217/nnm.l2.22) Review Cancer stem cells and drug resistance: the potential of nanomedicine Serguei Vinogradov & Xin Wei