ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR VI. Aplikace qRT-PCR Aplikace 1. Detekce DNA Diagnóza infekčních onemocnění (přítomnost patogenů v krvi, séru, plazmě ...) - Sledování minimální reziduálni nemoci - Detekce patogenů v potravinách a v životním prostředí - Detekce GMO - Autenticita potravin 2. Detekce RNA - Minimální reziduálni onemocnění (Her2 - karcinom prsu, Bcr-Abl - CML, ELAVL-4 - neuroblastom) - Detekce RNA virů - Diagnóza nádorových onemocnění (PSA - karcinom prostaty) - Validace microarray experimentů 3. Detekce SNP 4. High Resolution Melting Analysis 5. Kvantifikace množství (konkrétních) proteinů Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Diagnóza - rychlá, citlivá a přesná determinace patogenů Klasické kultivační metody - časově náročné (24-48hod), nízká citlivost, omezené spektrum druhů qRT-PCR - např. geny kódující 23S rRNA nebo 16S rRNA Rutinní diagnostika - Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumonieae Monitoring zneužitelných druhů - biodefense Yersinia pestis, Bacillus anthracis Výzkum - testování antibiotik - multidrug resistant strains (analýza bodových mutací v genech zodpovědných za metablismus ATB) - Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus Houbová a parazitární onemocnění - Aspergillus fumigatus, Candida sp. - Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum Aplikace Příklad protokolu: Detekce Prevotella intermedia Stěr z úst Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, cfg. 20min/15 OOOg Izolovat bakteriální DNA ze supernatantu Návrh primem (Primer Express) - oblast 16S rDNA Např.: Forward: 5'-AATACCCGATGTTGTCCACA-3' Reverse: 5'-TTAGCCGGTCCTTATTCGAA-3' Reakční směs PCR 2x SYBR green Master Mix (Applied Biosystems) 26,0|llI 95°C 1min Forward primer (10|aM) 2,0jiI Reverse primer (10|aM) 2,0|al 95°C 15s PCR grade H20 15,0|il 60°C 1min Vzorek DNA nebo standard 5,0|al f 40X ) Disociační křivka - 60-95°C Aplikace nepřítomnost signálu - variabilita v sekvencích/falešně negativní výsledky Hydrolyzační (TaqMan) i hybridizační sondy Kvantifikace - virový titr např. hepatitída B/C, HIV, EB, cytomegalovirus atd. Transplantace Detekční limity - genomové ekvivalenty (ge) End-point analýza - detekční limit 5x101 ge; dynamický rozsah 101-104 ge Hybridizační analýzy - detekční limit 2x101 ge; dynamický rozsah 101-104ge Inter- a intra assay variabilita >40% gRT-PCR - detekční limit 1x101 ge; dynamický rozsah 101-108 ge Inter- a intra assay variabilita <5-10% Interní amplifikační kontrola - Paralelní PCR známého standardu - Tzv „Spiking" vzorků známými sekvencemi - Paralelní analýza příbuzného viru (např. pro lidský HSV - tulení PhHV) Aplikace Příklad protokolu: Detekce viru chřipky (Influenza A) - 5' nukleázová assay Stěr z nosohltanu Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, Izolovat virovou RNA ze supernatantu Návrh primerů a sondy (Primer Express) - oblast M1 (influeznaA matrix gene) Např.: Forward: 5'-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3' Reverse: 5'-GGTGACAGGATTGGTCTTGTCTTTA-3' Sonda: Fam-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG-BHQ+ Reakční směs - One Step PCR (Qiagen) PCR Qiagen One Step RT-PCR Enzyme Mix 1,0jil 50°C 20min (Reverzní transkripce) Qiagen One Step RT-PCR Buffer (5x) 5,0jil Qiagen One Step RT-PCR dNTP mix (1 OmM) 1,0|al 95°C 15min (Aktivace polymerázy) Forward primer (10(iM) 2,0|llI Reverse primer (10|aM) 2,0|al 95°C15s ľ ) Sonda (20|aM) 0,2\ú 60°C1min \___/ PCR grade H20 8,8[i\ Vzorek DNA nebo standard 5,0[i\ Aplikace http://www.idahotec.com/BioDefense/ Terénní qRT-PCR - Detekce patogenů mimo laboratoř - Komerční specializovaná řešení http://www.rapidcycler.com/GSA/index.html Aplikace Jednonukleotidové polymorfismy SNP DNA sekvence lišící se v jediném nukleotidu Kódující i nekódující oblasti Záměna nukleotidu nemusí nutně vést k záměně AA Variabilita v odpovědi k patogenům, léčivům, atd. Senzitivita k onemocněním h tt p ://www. n c b i. n I m. n i h. g o v/p roj ects/S N PI Single Nucleotide Polymorphism PubMed Nucleotide Protein Genome Structure PopSet Taxonomy OMIM Books SNP Search for SNP on NCBI Reference Assembly j Search Entrez SNP Q for Go Aplikace SNP genotypizace TaqMan Invader assay (Flap endonukleáza) SNP microarray Invader assay in which probe complements the SNP resulting in fluroescene FEN cleavage site ^Srm o cleavage o Invader assay in which probe mismatches at the SNP location preventing cleavage from occuring no FEN deavage site Quencher no cleavage and no fluorescence PCR amplification of location of interest with blotlnylated primer NaOH wash and attachment to streptavidin Hybridization of PCR product with an allele specific probe in the presences of a DNA duplex binding fluorescence molecule The temperature at which the DMA hybrid denatures and fluorescence is lost is recorded and compared between assays with different probes Reference: Based on Olivier M.2005.The Invader assay for SNP genotyplng. Aplikace SNP genotypizace APEX (Arrayed primer extension) - 2D matice, oligonukleotidy imobilizované 5'koncem - PCR produkt je hybridiziován a prodloužen DNA polymerázou - Fluorescenčně značené terminátorové nukleotidy Tetra-primer based PCR pi C allele specific A allele specific P3 A DNA: G allele 9 C P4 P2 PI DNA: A allele i C P4 P2 PCR PCR product Gel electrophoresis PCR product qiq homozygote G/A heterozygote A/A homozygote Not allele specific G allele specific A allele specific Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza Forward Primer J 4 17 ■ 7 5' Revsrse Filme r rtrO'f......^mO. .?tTn Allele Match Mismatch Allele rfrO.-TT Mitch I I ľv J ■ ■ i n ■ ■ ■ Mismatch Legend v Fluorescent Probe Q Reporter ® Fluorescent Probe '.ňcé:; Minor Groove Binder Quencher TSfl ONA. Polymerase 9 Molecular Probe Target Sequence Emission of Fluorescence X Undetermined tu Allele X Both AlleleY NTC Allele X [SNP Alle I q 1) -i •ŕ " H ■ä _ *. H i ri i Aplikace Analýza křivek teplot tání = High resolution melting analysis Analýza komplexních sekvencí PostPCR analýza Snadná analýza neznámých sekvencí Sledování disociace řetězců DNA v závislosti na teplotě B. Normalized Melting Curves 100 TI C O 3 Single-stranded DNA (random coils) 76 79 82 Tm 88 91 Temperature [°C] ■ oo ® V (< fild types : allele) Mute jnts 3le) Hi äteroz1 /gote; y \^ ? r; 3 hi A ňi (D ;Calle /pes íle) / \ < ľ ( k/lutar T nllfll its-=0 \ ""V V s. J 1 Hete rozyg otes 81 5 82 82.5 83 33I 84 84.5 TompTHlurc ("Q 80 86.5 87 Aplikace = High resolution melting analysis Výhody: - Univerzální primery pro oblast nesoucí hledaný polymorfismus - Jediný fluorofor (SYBR Green) - „High throughpuf, automatizace Aplikace: - SNP, mutace - genotypizace Typizace mikroorganismů Time (hours) VÝHODA: 0 1 2 l I 2 A 5 6 1 A B IC E If g DNAprep 1 PCR 'scan analysis > cycle sequencing t capillary analysis electrophoresis No variants detected ► Report within 3 hrs Variants identified ► Report within 6 hrs Erali M. et al. 2010. Methods 50(4):250-261 Aplikace Příklad: Screening X-linked chronic granulomatous disease (OMIM 300481) Location or CVBßandamelogenin primers on X-1 inked chronic granulornarous disease primer places. Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Sample 6 I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex 1 a 1 S 1 a 1 a 1 a 1 a B Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex 2 9 2 2 9 2 0 2 0 2 9 C Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex 3 10 3 10 3 10 3 10 3 10 3 10 D Ex EX Ex EX Ex Ex EX EX EX EX Ex Ex 4 11 4 11 4 11 4 11 4 11 4 11 E Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex 5 12 5 12 5 12 5 12 5 12 5 12 F Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex 6 13 6 13 S 13 6 13 6 13 S 13 G Ex 7 Ex 7 Ex 7 Ex 7 Ex 7 Ex 7 H XY XY XY XY XY XY 13 exonu + amelogenin alternativa: sekvenování 84 86 88 Temperature (°C) Aplikace Wild lypo íaequonr.r Variant bequence --1_I_I_I_I_I_1_ -I-1-1-.-1-L-1-1. -0.04 J-1-1-!-1-1-1-1- _1_I_I_I_I_I_I_l_ S5 M 67 SS 89 90 91 92 as M 47 88 3S 90 31 82 Temperature ["O Aplikace mi RNA detekce MikroRNA (miRNAs) -Malé molekuly RNA - rostliny i živočichové - konzervativní sekvence - 21 mery - regulují expresi genů vazbou na 3' nepřekládaný region mRNA (3'UTR) Pre-miRNA miRNA genes Nucleus Cytoplasm jdnn Juicer TÍTľlhlIi miRNA duplex I WlT I i jdnnr mľíilli One strand incorporated into Rlz C Tumor suppressor gene Rlz C ■ 11«. v.^^—. Target Til I. mil «1111 5-—íŕ^*"--iflW* m*+*a Cytosine H Cytosine sulphonate H20 MM Endonukleázy citlivé metylovaným sekvencím BsoFI, Hpall, Mspl and Hhal 1 STEP 2| Hydrolytic Deamination HS03- OH I STEP3| H Alkali H Uracil Desulphonation Uracil The two main components of the epigenetic code DNA methylation Methyl marks added to certain DNA bases repress gene activity. Historic modification A combination of different molecules can attach to the 'tails' of proteins called histones. These alter the activity of the DNA wrapped around them. Aplikace Kvantitativní analýza DNA metylací pomocí real-time PCR Nemetylováné cytosiny jsou konvertovány na U bisulfitovou metodou 1. Pro každou sekvenci dva páry primem nebo ft ® P __m_ 2. Jsou použity oligonukleotidy hybridizující k nemetylovaným sekvencím a blokující PCR Aplikace ImunoPCR - Vazba specifického oligonukleotidu k monoklonální protilátce - Protein (Antigen) je imobilizován jinou monoklonální protilátkou - Vzniká sendvič (assemblage) - podobně jako ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) -tzv. PCR- ELOSA (Enzyme-Linked Oligonucleotide Sorbent Assay - Množství oligonukleotidu imobilizovaného prostřednictvím mAb je kvantifikováno PCR Fig. 5. Real-time immuno-PCR (assemblage 11) (■) and EL1SA (▲) readouts of standard samples (logarithmic scale). Aplikace ImunoPCR - stanovení PSA v laser-mikrodisekovaných buňkách Human Pathology (2008) 39, 1474-1482 ELSEVIER Human PATHOLOGY www,elseviencom/locate/humpath Original contribution Prostate-specific antigen mRNA and protein levels in laser microdissected cells of human prostate measured by real-time reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction and immuno-quantitative polymerase chain reaction Pamela Pinzani PhDa, Kristina Lind PhDbd, Francesca MaLentacchi GabrieLLa Nesi MDC, Francesca SaLvianti PhDa, Donata ViUari MDf, MikaeL Kubista PhDde, Mario PazzagLi PhDa, Claudio Orlando PhDaJ m 3 g-l 100000- 1 -1-1-1-1-1-1-\— N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 R-0.660: p<0.001 IO00O0 :ny.:m:- 30000D 400000 sooaoo sooooo PSA Protein (moltculf sfctll) Aplikace Single cell profiling B ®(o) Total number of ^ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts = 7 Total number of ^ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts = 7 Total number of ^ transcripts = 6 Cell collection Cell lysis Reverse transcription Real-time PCR Data analysis glass capillaries flow cytometry laser capture purification detergents heat osmotic mechanic • reverse transcriptase • priming »temperature profile • pre-ampliflcation mastermix priming temperature profile ■ detection chemistry pre-amp I ifi cation • normalization • quality assessment • statistics Stahlberg A. and Bengtsson M. 2010. Methods 50(4):282-288 Aplikace Circulating tumor cells (CTCs) Alluni-Fabbroni. 2010. Methods 50(4):289-297 Aplikace Amplifikace DNA bez PCR? Helicase-dependent isothermal DNA amplification 1. dsDNAje denaturovaná pomocí helikáz a SSB proteinů 2. Primery hybridizují ke komplemntární sekvenci 3. Polymeráza doplní ssDNA na dsDNA, která slouží jako substrát helikázám 3 cr LL 0 1 1 -M (D C OD