Program TRITON
Racionální návrh proteinů
Modelování mutantních proteinů,
výpočet reakčních cest,
protein-ligand docking
2
Racionální návrh proteinů
● Proteiny:
– enzymy (biologické katalyzátory)
– proteiny vázající ligandy
– další proteiny
● Kromě přirozené role v buňkách se proteiny uplatňují i v
průmyslových aplikacích (biotechnologie), např. enzymy jako
katalyzátory reakcí
● Vlastnosti přirozených proteinů jsou často nevyhovující pro
biotechnologické aplikace (malá katalytická účinnost
enzymů, neschopnost pracovat s některými substráty)
● Cílem je modifikace proteinu vhodným způsobem tak aby
získal požadované vlastnosti
3
Racionální návrh proteinů
Protein:
• známá struktura
• známá funkce
Nový protein:
• modifikovaná
struktura
• modifikovaná
funkce
Modifikace proteinu:
• genetické techniky
• chemické techniky
Jak modifikovat strukturu proteinu abychom
dosáhli požadované změny jeho funkce?
4
Racionální návrh proteinů
● Každý protein má specifickou sekvenci aminokyselin (primární
struktura)
● Na základě toho dochází k formování motivů sekundární a
terciální struktury – získáváme 3D strukturu proteinu
● Modifikací primární struktury dojde též k modifikaci 3D
struktury
● Pokud je modifikace malá (substituce jedné nebo dvou
aminokyselin) je změna 3D struktury zpravidla jen malá a týká
se jen místa, kde se modifikovaná aminokyselina nachází
● Pokud tuto změnu provedeme na aminokyselině nacházející se
v aktivním centru enzymu, ovlivníme jeho katalytické
vlastnosti
5
Metoda počítačové místně-cílené
mutageneze
● Chceme modifikovat strukturu proteinu tak abychom ovlivnili
jeho funkci
● Potřebujeme znát 3D strukturou proteinu
● Prozkoumáme strukturu proteinu a lokalizujeme důležitá
místa, např. aktivního centrum enzymu
● Navrhneme aminokyseliny jejichž záměna by mohla ovlivnit
strukturu aktivního centra
● Namodelujeme 3D struktury proteinových mutantů, v nichž
jsou vybrané aminokyseliny substituovány za jiné
(použijeme metodu homologního modelování)
● Pomocí metod počítačové chemie spočítáme pro jednotlivé
mutanty, jakým způsobem byla ovlivněna funkce proteinu
(např. jeho enzymatická aktivita)
6
Enzymová katalýza
Enzymy:
● biologické katalyzátory
● globulární proteiny
● katalýza probíhá v aktivním centru enzymu
● snížení aktivační energie prostřednictvím nevazebných
interakcí aktivního centra se substrátem
E a
E 0
REAKTANTY
PRODUKTY
TRANZITNÍ STAV
REAKČNÍ KOORDINÁTA
E
7
Aktivní centrum enzymu
Interakce mezi substrátem a proteinem v aktivním centru:
● vodíkové vazby
● elektrostatické interakce vč. dipolových
● van der Waalsovy interakce
● hydrofobní interakce
● stackingové interakce
8
Modelování enzymových reakcí
● Chemické reakce - vznik nebo zánik kovalentních vazeb =>
nelze použít molekulovou mechaniku => kvantově-chemické
metody
● Proteiny - velké molekuly - nelze použít ab initio metody =>
semiempirické kvantově-chemické metody (AM1, PM3)
● Nelze zahrnout celou molekulu
do výpočtu => použijeme
aminokyseliny aktivního centra
(kavita)
● Napodobení situace v reálném
proteinu - fixace atomů
peptidické páteře
9
Studium haloalkan dehalogenasy DhlA
● Haloalkan dehalogenasy - odbourávají chlorované a
bromované uhlovodíky
● Tříkrokový mechanismus reakce
● Výpočet reakční cesty SN2 kroku semiempirickými QM
metodami
Enz C
O
O
C
R1
R2
H
Cl
Cl
Enz C O
O
C
R1
R2
H
O
HH
H
+
Enz C O
O
C
R1
R2
H
OH
Enz C
O
O
C
R1
R2
HOH+
SN2 AdN
E
10
Reaktant
Trp175
Trp125
Asp124
CBT
11
Tranzitní stav
12
Produkt
13
Výpočet reakční cesty
-235
-225
-215
-205
-195
-185
-175
-165
1.21.72.22.73.23.7
reaction coordinate
Energy[kcal/mol]
distanceC-O
E
14
15
Enzym
MODELLER MODELLER MODELLER
Mutant 1 Mutant 2 Mutant n    
    
Cavity 1 Cavity 2 Cavity n    
MOPAC /
DRIVER
MOPAC /
DRIVER
MOPAC /
DRIVER
Reaction
pathway
    
    
    
    

,0,qx
    
,0,qx 
,0,qx
Identification of mutants with significant activity
Reaction
pathway
Reaction
pathway
Počítačový návrh enzymů
(metoda použitá v programu TRITON)
16
Studie – mutageneze hehalogenasy DhlA
mutace Phe172
17
Protein-ligand docking
● Další významnou skupinou jsou proteiny vázající ligandy
● Jedná se o proteiny, které pomocí nevazebných interakcí
váží reverzibilně malé molekuly
● Schopnost ligandu vázat se na daný protein lze zjisti pomocí
metody molekulového dokování
18
Molekulové dokování
● Molekulové dokování slouží k nalezení konfigurace, ve které
se k sobě váží dvě molekuly
● Nejpoužívanější je “protein-ligand docking“ kdy hledáme
konfiguraci ve které se ligand váže na protein
● Metoda molekulového dokování automaticky testuje různé
pozice, orientace a konformace ligandu vůči proteinu a
počítá energie jejich vzájemné interakce; konfigurace s
nejmenší energií odpovídá skutečné struktuře komplexu
protein-ligand
●
19
Počítačový návrh proteinů vázajících ligand
(metoda použitá v programu TRITON)
Protein
MODELLER MODELLER MODELLER
Mutant 1 Mutant 2 Mutant n    
    
AutoDock     
Binding
Energy 1
    
Comparison of binding affinities
AutoDock AutoDock
Binding
Energy 2
Binding
Energy n
20
Program TRITON
MOPAC / DRIVER
calculation of the reaction
pathway
AutoDock
calculation of the binding
affinities an binding modes
TRITON
graphic interface – interactive specification
of input data and visualisation of outputs
MODELLER
modelling of mutant structures
from a source protein