titl CZ •Dvoudimenzionální elektroforéza • •Hana Konečná • • •CENTRÁLNÍ LABORATOŘ - PROTEOMIKA •CEITEC – Středoevropský technologický institut •NCBR – Národní centrum pro výzkum biomolekul PřF • zahlavi CZ proteinový vzorek komplexní směs peptidů komplexní proteinový vzorek jednoduchý směs peptidů jednoduchá databáze identifikace kvantifikace 2D GE proteinové čipy multiD-LC MS MS/MS charakterizace modifikace shotgun zahlavi CZ proteinový vzorek komplexní směs peptidů komplexní proteinový vzorek jednoduchý směs peptidů jednoduchá databáze identifikace kvantifikace 2D GE proteinové čipy multiD-LC MS MS/MS charakterizace modifikace shotgun zahlavi CZ I. SEPARACE II. PREFRAKCIONACE Dvoudimenzionální elektroforéza 2-DE ? zahlavi CZ zahlavi CZ bunka HOMOGENIZACE break • mechanicky • ultrazvukem • tlakem • zmražením / rozmražením • detergentovou lyzí • • zahlavi CZ MĚŘENÍ KONCENTRACE PROTEINU zahlavi CZ * §žádný celkový náboj §0.5 – 4% §použitelné ve vysokých koncentracích močoviny § §neionogenní §zwitterointové § §SDS jen v nízkých koncentracích (do 0.25%) DETERGENTY zahlavi CZ zahlavi CZ ZÁKLADNÍ PRAVIDLA § zabránit proteolýze § jednoduchý postup § čerstvé reagencie § čerstvý vzorek § odstranit pevné částice - centrifugace § odstranit kontaminanty zahlavi CZ § • • de teprve o prefrakcionaci, chromatografie, imunoprecipitace, frakcionace detergenty zahlavi CZ 2-DE pI sds • první rozměr • druhý rozměr IEF SDS-PAGE zahlavi CZ zahlavi CZ IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE • imobilizovaný pH gradient • amfolyty + + + - - - zahlavi CZ strips strips non-linear zahlavi CZ ROZSAH STRIPU narrow zahlavi CZ zahlavi CZ sds zahlavi CZ STRIP GEL + - + FOKUSACE SDS-PAGE - ekvilibrace zahlavi CZ 2-DE INSTRUMENTACE § Protean IEF § Protean Dodeca Cell § Densitometer GS-800 § FLA-7000, STORM PDQuest, Quantity One New Campus_11 New Campus_13 New Campus_16 Protean Plus Dodeca Cell Mini-Protean 3 Dodeca Cell Protean II xi Cell zahlavi CZ DETEKCE PROTEINU • gel x blot • visualizace barvení radioaktivita imunodetekce • barvení v gelu · po elektroforéze · před elektroforézou · specifické pro protein · specifické pro PTM · viditelné spektrum · fluorescence • zahlavi CZ Sypro Ruby Coomassie silver 1.4 ng 36 ng 0.6 ng DETEKCE PROTEINU V GELU PTM specifická barvení Pro-Q Diamond Pro-Q Emerald zahlavi CZ Figure: 7KB BARVENÍ PROTEINU – LINEARITA Sypro Ruby zahlavi CZ zahlavi CZ PDQpict1 • kvalitativní • kvantitativní ANALÝZA OBRAZU zahlavi CZ biologické replikáty technické replikáty biologická variabilita technická variabilita stejný organismus za stejných podmínek stejný vzorek stejně zahlavi CZ 2D or not 2D ? §vizuální aspekty §reprodukovatelnost §dynamický rozsah §extrémní proteiny (membránové,basické...) §nesnadná automatizace §postdigesční extrakce zahlavi CZ zahlavi CZ MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE § velké objemy vzorku § možnost koncentrace na koloně § membránové proteiny, basické proteiny § není nutno barvit § peptidy – přímo na MS § automatizace § vizuální aspekty ztraceny: pI a Mr § LC - sériová analýza § GE současně pro více vzorků PROTI PRO zahlavi CZ digi Difference Gel Electrophoresis DIGE zahlavi CZ BIOMARKERY … jehly v kupce sena prefrakcionace ▪ separace ▪ identifikace ▪ srovnání kontrola vs.vzorek • seno - proteiny bez vztahu k onemocnění • jehly - specifické proteiny pro onemocnění • potenciální jehly obtížně validovatelné biologická variabilita! • které jehly dále zkoumat? • často PTM, neidentifikovány MS • zahlavi CZ Den 21 – před klinickým projevem Den 44 – po klinickém projevu separace identifikace zahlavi CZ DIGESCE • IN-GEL • IN-SOLUTION trypsin Glu-C Asp-N thermolysin MAVEPFPRRPITRPHASIEVDTSGTGGSAGSSEKVFCLIGQAEGGEPNTVYELRNYAQAKRLFRSGELLDAIELAWGSNPNYTAGRILAMRIEDAKPAS AEIGGLKITSKIYGNVANNIQVGLEKNTLSDSLRLRVIFQDDRFNEVYDNIGNIFTIKYKGEEANATFSVEHDEETQKASRLVLKVGDQEVKSYDLTGG AYDYTNAIITDINQLPDFEAKLSPFGDKNLESSKLDKIENANIKDKAVYVKAVFGDLEKQTAYNGIVSFEQLNAEGEVPSNVEVEAGEESATVTATSPI KTIEPFELTKLKGGTNGEPPATWADKLDKFAHEGGYYIVPLSSKQSVHAEVASFVKERSDAGEPMRAIVGGGFNESKEQLFGRQASLSNPRVSLVANSG TFVMDDGRKNHVPAYMVAVALGGLASGLEIGESITFKPLRVSSLDQIYESIDLDELNENGIISIEFVRNRTNTFFRIVDDVTTFNDKSDPVKAEMAVGE ANDFLVSELKVQLEDQFIGTRTINTSASIIKDFIQSYLGRKKRDNEIQDFPAEDVQVIVEGNEARISMTVYPIRSFKKISVSLVYKQQTLQA MS pms zahlavi CZ G I G O zahlavi CZ GARBAGE IN - GARBAGE OUT G I G O zahlavi CZ • R.M. Twyman: Principles of Proteomics • R.Westermeier, T.Naven, H-R Höpker: Proteomics in Practice • A.J.Link: 2D Proteome Analysis Protocols • Current Protocols in Protein Science • R.J.Simpson: Proteins and Proteomics • T.Rabilloud: Proteome Research: Two-dimensional Gel • Electrophoresis and Identification Methods • A. Görg, W. Weiss, M.J.Dunn: Proteomics 2004, 4, 3665, rev. • I. Miller, J. Crawford, E. Gianazza: Proteomics 2006, 6, rev. • F.Chevalier: Proteome Science 2010, 8:23, review • R. Burgess, M. Deutscher: Guide to Protein Purification zahlavi CZ I. SEPARACE II. PREFRAKCIONACE zahlavi CZ GENOM PROTEOM IZOFORMY PTM asi 200 typů (fosforylace, glykosylace, acylace, methylace…) KONCENTRAČNÍ ROZSAH asi deset řádů PREFRAKCIONACE MS zahlavi CZ zahlavi CZ [USEMAP] Abundantní proteiny v lidské plazmě zahlavi CZ • odstranění abundantních proteinů afinitní chromatografií HSA IgG Albumin and IgG removal - before/after AFINITNÍ DEPLECE zahlavi CZ zahlavi CZ CPPL Combinatorial Peptide Ligand Library zahlavi CZ schema PROTEOMINER PREFRAKCIONACE zahlavi CZ IEF • prefrakcionace v roztoku • • • • • • • prefrakcionace v roztoku na IPG stripu zahlavi CZ offgel 16 pivo 70 proteinů OFFGEL IEF prefrakcionace proteinů nebo peptidů zahlavi CZ digest směsi proteinů IEF směsi peptidů na IPG stripu frakce stripu IPG-IEF zahlavi CZ SDS 8M Urea Peptides DTT IAA spin spin spin incubation spin proteins nucleic acids Lysate 8M Urea Ammonium Trypsin SDS DTT IAA bicarbonate PROTEINS PEPTIDES Nature Methods 6, 359 - 362 (2009) Filter Aided Sample Preparation FASP FASP Filter aided sample preparation zahlavi CZ zahlavi CZ GELOVÁ CHROMATOGRAFIE H12_SEC zahlavi CZ INSPIRATIVNÍ LITERATURA PRO MÍRNĚ POKROČILÉ Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: A tutorial Thierry Rabilloud et al. Journal of Proteomics 2011 Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: past, present and future Thierry Rabilloud et al. Journal of Proteomics 2010 Proteomic biomarker discovery: It's more than just mass spectrometry Josip Blonder et al. Electrophoresis 2011 zahlavi CZ OPVK_MU_vlevo_2 For all the complex problems and difficult questions there is always one simple, easily comprehensible w r o n g answer.