KURZ ZÁKLADŮ PROTEOMIKY
ČASOVÝ ROZVRH:
PONDĚLÍ 7:50- 7:55 Zahájení praktika (UKB, A2, 2.NP, místnost č. 211, Dr. Hejátko)
8:00 – 9:00 2-D elektroforéza – rehydratace proužků
9:00 – 9:30 Exprese rekombinantních proteinů – zaočkování expresní kultury
9:30 – 10:00 Úvod do experimentální části (přednáška)
9:30-9:40 2D elektroforéza (Dr. Konečná)
9:40-9:50 MS analýza (Dr. Zdráhal)
9:50-10:00 Rekombinantní proteiny (Dr. Pekárová, Mgr. Degtjarik, Mgr. Gelová)
10:00 – 13:00 Struktura proteinů, proteomické databáze (Dr. Zdráhal, Ing. Zábrady,
Mgr. Klumpler)
13:00 – 13:45 OBĚD
13:45 – 14:30 Exprese rekombinantních proteinů – indukce
Příprava 1-DE gelů (pro SDS-PAGE a nativní PAGE)
14:30 – 15:00 In-solution proteolytické štěpení směsi proteinů pro LC-MSMS
analýzu
15:00 – 15.30 Příprava 1-DE gelů (pro SDS-PAGE a nativní PAGE)
15.30 -16.05 Příprava gelů pro 2-DE
16:05 – 16:45 Exprese rekombinantních proteinů – sklizeň kultury
Příprava noční kultury pro izolaci plazmidové DNA
16.45 – 18:00 1. rozměr 2-D elektroforézy: izoelektrická fokuzace (IEF)
ÚTERÝ 7:45 – 9:15 Izolace plazmidové DNA
9:15– 10:00 Sekvenování – PCR
10:00 – 11.00 2. rozměr 2-D elektroforézy: SDS-PAGE
11,00 – 12.00 OBĚD
12.00 – 14.00 Barvení 2-DE gelů, densitometrie
14.00 – 17.00 Software pro vyhodnocování 2-D gelů, databáze 2-D gelů
Sekvenace DNA –čištění vzorku (prostřídání skupin), nasazení vzorku
17.00 – 17.30 Ukončení in-solution proteolytického štěpení proteinů pro LC-MS/MS
analýzu
Nasazení vzorků do autosampleru a začátek LC-MS/MS analýzy
STŘEDA 7:30 – 8:30 In-gel proteolytické štěpení proteinů separovaných 2-D
elektroforézou
8:30-13:00 Purifikace rekombinantních proteinů pomocí metalochelatační
afinitní chromatografie
Demonstrační chromatografie – FPLC
PAGE analýza rekombinantních proteinů – příprava vzorků
- SDS-PAGE analýza
Stanovení koncentrace proteinů metodou dle Bradfordové
ČTVRTEK 8:30 – 9:00 Nativní PAGE analýza – nanesení vzorků na gel
9:00 – 11:00 Analýza proteomu – identifikace proteinů metodou MALDI-TOF
MS (ukončení in-gel proteolytického štěpení proteinů separovaných
2-D elektroforézou a analýza vzorků MALDI-TOF hmotnostní
spektrometrií)
11:00 – 12:30 Ukončení nativní PAGE – aktivitní barvení (MUG)
- Western blotting
12:30 – 13:30 OBĚD
13:30 – 16:30 Western blotting
Analýza obrazu – densitometrie. software pro vyhodnocování 1D gelů
Dle dohody (vyhodnocení čistoty purifikovaných proteinů)
Vyhodnocení sekvencování DNA, čtecí rámec (Work Bench)
PÁTEK 8:00 – 10:00 Vyhodnocení výsledků LC-MSMS a MALDI-TOF MS analýz
10:00 – 11:00 “dodělávky“, konzultace, vypracování a odevzdání protokolů
11:00 kolokvium
Cvičící (legenda):
2-DE a příprava pro MS RNDr. Hana Konečná, Danuše Fridrichová
Analýza obrazu Mgr. Gábina Lochmanová
MS analýza doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.
Struktura proteinů Ing. Matej Zábrady, Mgr. Tomáš Klumpler, Ph.D.
Exprese a purifikace rekombinantních proteinů Ing. Blanka Pekárová, Ph.D., Mgr. Zuzana Gelová, Ing.
Matej Zábrady, Mgr. Oksana Degtjarik
Izolace a purifikace DNA, práce s WorkBench Bc. Martina Válková,
Sekvencování DNA Bc. Martina Válková
Dohled nad laboratoří a přípravou materiálu ing. Šárka Skoupá