Nukleární magnetická rezonance Gradientní NMR spektroskopie Selekce signálů • homogenita magnetického pole - kdyby nebylo magnetické pole homogenní, vykazovala by jádra stejného typu v různých pozicích vzorku rozdílné precesní frekvence a tím i rozdílné chemické posuny (rozšířeni signálu) • homogenita je nastavena cívkami kolem vzorku - upravují pole v osách x, y, z a jejich kombinacích (viz. lekce 10) • magnetické pole může v čase fluktuovat => je potřeba ho zastabilizovat -lokování "locking" např. na signál deuteria, které je přítomné v nějakém množství v rozpouštědle (např. D20) • řízená a přesně definovaná nehomogenita může být využita k selekci signálu Gradienty v případě homogenního magnetického pole se vektory reprezentující různé pozice v kyvetě posunou za čas t o stejný úhel a (stejná frekvence) v případě nehomogenního mag. pole se vektory posunou o různý úhel (různá frekvence) X Selekce signálů výběr signálu páru 1H-13C a eliminace nebo rozfázování 1H-12C - fázové cykly 90° 90° 180° 1/J 13C 13c 1/2J 1/2J li ik - pulzní gradient magnetického pole 90= 90o 1/2J 90° 1/2J 13C GP Selekce signálů výběr signálu páru 1H-13C a eliminace nebo rozfázování 1H-12C : - fázové cykly _ 90°^ <—-—.1 II Aaa^ B 90° 180 13C 1/2J V2J II Selekce signálů Výběr signálů pomocí fázových cyklů i/j H-13C ^-^C-není v NMR aktivní => v čase 1/J se nevyvíjí 180° i a+b= r, k vývoji kaplingu dochází jen pro pár 1H - 13C (ne pro 1H - 12C) měření dvou spekter (A a B), sečtení/odečtení není perfektní kvůli experimentálním nepřesnostem - zbytkové signály 1H - 12C Selekce signálů výběr signálu páru 1H-13C a eliminace nebo rozfázování 1H-12C - pulzní gradient magnetického pole 1|_I 90 x 90 ^ 90c 1/2J 1/2J l3C GP G Selekce signálů Výběr signálů pomocí gradientů • signály 1H-12C se rozfázují v rovině pomocí gradientu G • 90°y sklopí 1H-13C signály do osy x - během 1/2J zrefokusují • výhody - žádné artefakty vznikající odečtem spekter (viz. předchozí obr.) • měření jednoho spektra - rychlejší akumulace signálu Gradienty X X v případě homogenního magnetického pole se vektory na všech pozicích v kyvetě posunou za čas t o stejný úhel a gradientem o intenzitě G uměle vygenerujeme nehomogenní magnetické pole a dojde k různému vývoji v jednotlivých částech vzorku po dobu trvání G G Gradienty Oz = PY"CgBg Oz - fázový posun p - řád koherence (SQ, DQ) y-magnetogyrická konstanta Tg - doba trvaní gradientu Bg - intenzita gradientu X O = 0 - suma fází musí být nulová pro refokusaci signálu HSQC s gradienty (gs-HSQC) nastavení gradientů : splnění podmínky £ Q = 0: HSQC: p1 = p2 (SQ), xx = t2, Bx = B2 => poměr gradientů se řídí poměrem y ^(pro1H-13CGl:G2 4:l) Gradienty HMQC: 1H 90 dl d2 180 ti/2 ti/2 90 fl 90 GP G1 G2 G3 Gl-DQ, G2-ZQ, G3-SQ Ti = T2 = T3 0 = 0 = (yc+Yh)G1 + (Yc-Yh)G2 + ("Yh)G3 pro ^-"C, např: G1:G2:G3 = 5:3:4 (l+4)*5 + (l-4)*3 + (-4)*4 = 0 • použití gradientů je velmi významné pro 1H-13C HMBC v přirozeném zastoupení, kde se jinak při fáz. cyklech odečítá kolem 97-98 % signálu -> tl šum • nezbytné pro 15N - v přirozeném zastoupení 3x méně než 13C (0.37 % vs. 1.11 %) Gradient-Enhanced 1H-15N HMBC HMQC s gradienty 4 1 2 22,3 HMBC s gradienty 3D spektra 2D • 2D experimenty - dvě dimenze -> FT dvou časových proměnných - FID (t2) a inkrementační čas tľ • 2D spektrum - rovina, kde je interakce dvou jader zobrazena jako vrstevnice 3D • 3D experimenty - přidán třetí časový vývoj (druhá inkrementační perioda) FID (t3) a inkrementační čas tx a t2 • 3D spektrum - kostka, kde je interkace jader zobrazena jako bod uvnitř kostky 3D spektra • 3D spektrum - kostka, kde je interkace jader zobrazena jako bod uvnitř kostky • každý rozměr kostky představuje jednu frekvenční (časovou) proměnnou • vhodné pro velké molekuly, biomolekuly • kombinované experimenty HMQC-COSY, HMQC-TOCSY ":»'-:-WiT.:.j: rovina H,H pri 6C=26,7 ppm % 2 Gradient-Selected HMQC-TOCSY dl pi 62 ' IJ2 ' p2 ' XJ2 'd3 p5 p6 64 p7 aq field gradients P3 p4 gl g2 GARP 23 12 23 16 8 20 23 13 11 IS 20 15 14 11 37 1513 UL $ 0 It e fr f > 6> ft 9 1 . • o * ft A ft tu W ■ -30 ■40 -50 -60 -70 5C 8H