ProtDNAInt_f DNA-proteinové komplexy Komplexy spojené s transkripcí (až 5% genomu) Komplexy podílející se na opravě DNA Chromatinové strukturní komplexy http://npidb.belozersky.msu.ru/ Bi7015 - Chemické vlastnosti, struktura a interakce nukleových kyselin (doc. Fojta a prof. Palecek) DNA-vazebné motivy specifických transkripčních faktorů (enhanceosom) Obecné TFII komplexy a proces transkripce Komplexy spojené s transkripcí File:Transcription Factors.svg Enhanceosom Tvarová a nábojová specifita DNA determinuje typy DNA-vazebných domén (oproti velké rozmanitosti protein-proteinových interakčních domén) - Proteiny interagují s cukrfosfátovou kostrou (fosfát) nebo přes žlábky s bazemi - Interakce sekvenčně nespecifické (kostra - histony, mohou být strukturně specifické - HMG proteiny) nebo sekvenčně specifické (žlábky – transkripční faktory) „shape readout“ zakřivení kostry souvisí se sekvencí „shape readout“ zakřivení kostry - souvisí se sekvencí a prostředím Rohs et al, Annu Rev Bioch, 2010 Vazba DNA-protein může indukovat změny - vazba proteinu může indukovat změny ve struktuře DNA - vazba DNA na protein často indukuje změny v jeho struktuře - případně u nestrukturovaným proteinů strukturu indukuje Rohs et al, Annu Rev Bioch, 2010 1jj4 (a uvidíte histony) 2kei, Lac represor Vazba proteinů s DNA prostřednictvím solných můstků •fosfáty mohou interagovat s Arg a Lys – solné můstky/salt bridges (pozitivní náboje Arg a Lys vytváří vazbu s negativním nábojem fosfátové skupiny) •Elektrostatický náboj/povrch naznačuje vazebné schopnosti proteinu • Gajiwala & Burley, COiSB, 2000 Minor groove Minor groove Major groove Major groove sekvenčně-specifický protein kontaktuje báze („direct“ readout) – skrze velký nebo malý žlábek – velký žlábek je lépe přístupný DAA mADA Jak odliší protein různé páry bazí? “base readout” Pozice donor vs akceptor + metyl skupina Metylace A(6) u bakterií změna! AAD ADA CH3 AAD ADAm Vazba proteinů s DNA prostřednictvím vodíkových vazeb •Velký žlábek má velikost odpovídající rozměrům a-šroubovice a má exponované H-vazebné skupiny •Ade zbytky N-6 a H-7 mohou tvořit specifické vodíkové vazby s Gln a Asn •Cyt-Gua párem může tvořit specifické vodíkové vazby s Arg • Silná vazba, sekvenčně specifická - afinita nM – mM Slabá vazba, strukturně specifická - afinita mM – mM Rohs et al, Annu Rev Bioch, 2010 - více jak 70 SCOP superrodin (strukturních motivů) - dle sekundárních struktur – a-šroubovice (17), b-listy (7), smíšené a/b motivy (48) Motivy DNA vazebných domén •Zipper typ –Leucinový zip –Helix-loop-helix •Helix-otáčka-helix –HTH –Winged helix –TALE •Zinkový prst – bba zinc-finger –Hormon-receptor –Loop-sheet-helix –Gal4 •Histon, HMG-box • b-sheet motivy http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e8/Leucine_zipper.png/220px-Leucine_zipper.pn g a-šroubovice b-listy Literatura: Luscombe et al, Genome Biology, 2000 Motivy DNA vazebných domén http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e8/Leucine_zipper.png/220px-Leucine_zipper.pn g •Zipper typ (dle způsobu dimerizace) –Leucinový zip (tzv. bZIP = basic) –(transcr. fact. yGCN4, c-Jun/c-Fos=AP-1) •2 α-helixy (2 x 60 AMK) •coiled-coil (>30AMK, Leu, C-term) •basická část (N-terminus, navazuje na CC) •bazická šroubovice vázána do VŽ • – Interakce bazických AMK: Arg(232+240)=PO4, Arg(243)=Gua Konsensus sekvence: TGACTCA GCN4 – regulace genů pro syntézu AMK 1YSA 1YSA Jones a spol., NAR, 2003 NUCPLOT Konsensus sekvence: TGACTCA GCN4 File:Signal transduction pathways.svg Efferl & Wagner, NRC, 2003 Wikipedie AP-1 AP-1 kombinace homo/hetero heterodimery File:C-Myc-DNA complex.png Motivy DNA vazebných domén http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e8/Leucine_zipper.png/220px-Leucine_zipper.pn g •Zipper typ (dle způsobu dimerizace) –Leucinový zip (tzv. bZIP = basic – transcr. fact. yGCN4, c-Jun/c-Fos) •2 α-helixy (2 x 60 AMK) •coiled-coil (30AMK, Leu, C-term) •basická část (N-terminus, navazuje na CC) •bazická šroubovice vázána do VŽ • –Helix-loop-helix (c-Myc/Max, MyoD) •CC a bazické části jsou odděleny smyčkou •bazická šroubovice vázána do VŽ •smyčka poskytuje větší flexibilitu pro vazbu šroubovice-smyčka-šroubovice Motivy DNA vazebných domén •Zipper typ –Leucinový zip –Helix-loop-helix •Helix-otáčka-helix –HTH –Winged helix –TALE •Zinkový prst – bba zinc-finger –Hormon-receptor –Loop-sheet-helix –Gal4 a-šroubovice •Obsahuje ~ 20 AMK ve dvou šroubovicích vzájemně kolmých Øa-helix pro vazbu na DNA („recognition“) - b-obrátka – druhá šroubovice ØSekvenčně-specifická vazba prostřednictvím „recognition“ šroubovice a velkého žlábku Ønejčastější motiv u prokaryot -homodimery vážou palindrom. sekvence ØHTH motiv se obvykle vyskytuje ve svazku 3-6 šroubovic (stabilizovaných hydrofobním jádrem) Ømotiv může být buď součástí hlavního proteinu (Cro) nebo z něj může pouze vybíhat (LacI) Helix-turn-helix motiv (HTH) Luscombe et al, Genome Biology, 2000 Helix-turn-helix motivy (spojené listy nebo šroubovicemi) – odstup HTH (34Å) odpovídá jedné otáčce B-DNA Sekvenčně se různé HTH příliš nepodobají 1. variabilita v rozpoznávaných sekvencích DNA 2. variabilita v pozici „recognition“ šroubovice ve velkém žlábku (paralelně k rovině bazí nebo delší šroubovice jsou paralelně k cukr-fosfátové kostře) Liljas a spol. 6CRO 1LMB Regulace transkripce v kvasinkových buňkách Typ buňky Geny kontrolované MAT lokusem a haploid aSG OFF haploid SG ON a2 diploid aSG OFF haploid SG OFF a2 a2 a1 Eukaryontní heterodimery vážou nesymetrické cílové sekvence (větší variabilita sekvencí, více proteinových kombinací) 1LE8 mat a2 mat a1 „Winged“ helix (okřídlená šroubovice) Gajiwala & Burley, COiSB, 2000 Luscombe et al, Genome Biology, 2000 - „winged“ HTH obsahuje „recognition“ šroubovici (H3) a b-listy, které poskytují další kontakty s DNA - Interakce bazí a cukr-fosfátové kostry se šroubovicí (H3) - „winged“ HTH v mnoha specifických transkripčních faktorech ale také v „general“ TFII faktorech Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012 Histon H1/H5 interaguje s DNA (nukleosomem) a vytváří dimery (nukl. diady) – WHD doména může vytvářet více kontaktů (H3 šroubovice-MŽ, wing-cukrfosfátová kostra, protein-protein int.) stereoskopický obrázek docking (pouze model) Skládání nukleosomů do kompaktnějších struktur Fan & Roberts, PNAS, 2006 J. Fajkus Kumar et al, PLoS One, 2012, Palecek et al, JBC, 2006 - „winged“ HTH obsahuje „recognition“ šroubovici (H3) a b-listy, které poskytují další kontakty s DNA - WHD (i další struktury) poskytují pouze „kostru“ a záleží na postraních řetězcích jaká DNA nebo protein se naváže Nse4 kleisin interaguje s SMC5 proteinem prostřednictvím hydrofobních vazeb PthXo1 23 repetic obtáčí DNA ve VŽ Mak et al, Science, 2012 TALEN technologie Transcription activator-like effectors (TALE) Patogenní bakterie injikují do rostlinných buněk ovlivňují transkripci rostlinných promotorů Tandemové repetice (34) AMK v pozicích 12 a 13 určují specifitu (repeat-variable diresidue) – hlavní: HD, NG, NI, NN, NS, HG, N* Mak et al, Science, 2012 Interaguje otáčka/turn spíše než šroubovice Motivy DNA vazebných domén •Zipper typ –Leucinový zip –Helix-loop-helix •Helix-otáčka-helix –HTH –Winged helix –TALE •Zinkový prst – bba zinc-finger –Hormon-receptor –Loop-sheet-helix –Gal4 •Histon, HMG-box • b-sheet motivy b-listy a-šroubovice Zinc-finger/Zinkový prst - cca 30 AMK ve dvou krátkých antiparalelních b-listech a a-šroubovici - smyčka („hairpin“) stabilizovaná („crosslinked“) Zn2+ - koordinovaný 4xCys nebo 2xCys + 2xHis (tetraedrická struktura) C2H2 motiv: Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His PDB grafika 1ZAA, Zif268 - vazba na DNA je relativně slabá, takže se typicky vyskytuje tandemově několik domén za sebou (3x v Zif268) - a-šroubovice se váže do VŽ – v tandemu obtáčí VŽ - vazba na DNA je relativně slabá, takže se typicky vyskytuje tandemově několik domén za sebou (3x v Zif268) -a-šroubovice se váže do VŽ – v tandemu obtáčí VŽ - AMK na pozici 0 – 6; variancemi AMK v těchto pozicích lze dosáhnout různé sekvenční specifity Mnoho kontaktů je nepřímých přes molekuly vody - AMK na pozici 0 – 6; variancemi AMK v těchto pozicích lze dosáhnout různé sekvenční specifity - a-šroubovice váže 2, 3 nebo 4 sousední páry bazí - nejčastější jsou kontakty Arg-Gua - Gua se může vázat i na His, Lys, Ser - Ser se může vázat na T či A Zif268 - CTCF (zkratka z CCCTC factor) izolátor/insulator brání transkripci - váže se mezi transkripční aktivátory a obecné transkripční faktory - obsahuje 11 zinkových prstů CTCF 2749850_1471-2199-10-84-2 Razin a spol., Biochemistry, 2012 11 ZF > - obsahuje 11 zinkových prstů – k vazbě na DNA používá různé kombinace ZF 1-s2 Stitzel a spol., Cell Metabolism, 2010 Ohlsson a spol., TiG, 2001 - CTCF funguje též jako kotva pro nukleosomy - interaguje s kohesinem a podílí se na utváření vyšších chromatinových struktur „genome editing“ Zinc Finger Nucleases: Highly-specific Genomic Scissors Image - Dobře charakterizované DNA-proteinové kontakty –je známá specifita ZFs pro všech 64 možných kombinací 3 sousedních bp - Lze pro specifickou sekvenci DNA poskládat ZFs – nová technologie „zinc nuclease“ pro genové manipulace Full-size image (85 K) Transcription activator-like Perez-Pinera a spol., COiCB, 2012 64 variant pro všechny triplety 87_zincfingers Vazba 2 zinkových prstů – spojuje 2 transkripční faktory (další ZnF vážou DNA): 1y0j Protein interaguje s RNA HIV nukleokapsid (1a1t) EEA1 protein se váže na specifický lipid obsažený v endosomech – esenciální pro transport molekul do buněčných kompartmentů (1joc) Rozdíl mezi Zinc-finger a RING-finger doménami (interakce mezi E2 a E3 proteiny) Perry a spol., TiBS, 2008 - jeden z nejlépe prostudovaných motivů (váže DNA, RNA i v jiných typech proteinů) Hormon receptor family Jaderné receptory – steroidní hormony, thyroidní hormony a retinoidy – navázání ligandu stimuluje translokaci receptoru z cytoplasmy do jádra a vazbu na HRE (hormon response element - regulaci transkripce) - α-šroubovice-smyčka(loop)-α-šroubovice (kolmé) - 4 Cys koordinují Zn - 1. helix ve velkém žlábku a smyčka s druhým helixem kontaktují cukr-fosfátovou kostru - doména dimerizuje (přes smyčku) File:Nuclear Receptor Structure.png navázání ligandu stimuluje vazbu k DNA File:NR mechanism.png - Hormony (estrogen) nebo syntetické látky (diethylstilbestrol) působí jako agonisté a stimulují vazbu koaktivátorů - antagonisté (synt., hydroxytamoxifen) brání vazbě agonistů a koaktivátorů a stimuluje vazbu s korepresorem http://en.wikipedia.org/wiki/Nuclear_receptor - seznam receptorů a jejich ligandů třída I (homodimery, cytoplasma) a třída II (heterodimery, jádro) – vazba ligandu také moduluje vazbu ko-aktivátorů (dalších transkripčních faktorů nebo chromatinových remodelátorů/např. histon acetylasa – acetylace uvolní nukleosom) Nuclear_receptor_action wikipedia Loop-sheet-helix - smyčky vycházející mimo hlavní core doménu – vyčnívá b-list a α-šroubovice - 3 Cys a 1His koordinují Zn - helix ve velkém žlábku a smyčka v malém žlábku - Aktivace transkripce skrze kyselou TA doménu - core/DNA-vazebná doména p53 – transkripční faktor důležitý pro regulaci buněčného cyklu, apoptozy a opravy poškozené DNA (nádorový supresor) TFIID,TFIIH - transkripce MDM2/MDM4 - ubi Loop-sheet-helix - Konsensus sekvence PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy (v promotorech p21, PUMA) - 95% “nádorových” mutací je v „core“ doméně (R273H) -Regulace/aktivace modifkací C-koncové domény Protein se váže jako tetramer (C-koncová doména) - - core/DNA-vazebná doména p53 – transkripční faktor důležitý pro regulaci buněčného cyklu, apoptozy a opravy poškozené DNA (nádorový supresor) Gal4 - 2 α-šroubovice - 6 Cys koordinuje 2 Zn (2 Cys sdílené 2 Zn) - 1. helix ve velkém žlábku a 2. kontakt s cukr-fosfátovou kostrou - Dimerizuje přes krátký CC segment Marmortstein et al.: Nature, 1992 - transkripční faktor reguluje v kvasinkách metabolismus galaktosy (kvasinkový dvou-hybridní systém) Gal4 Motivy DNA vazebných domén •Zipper typ –Leucinový zip –Helix-loop-helix •Helix-otáčka-helix –HTH –Winged helix –TALE •Zinkový prst – bba zinc-finger –Hormon-receptor –Loop-sheet-helix –Gal4 Kombinace motivů (šroubovice, Zn …) … nejčastěji VŽ a šroubovice Kombinace více proteinů … enhanceosome IFN-b enhanceosom File:Signal transduction pathways.svg Efferl & Wagner, NRC, 2003 Wikipedie enhanceosome IFN-b enhanceosom IFN-b enhanceosom AP-1 NF-kB Panne et al, Cell, 2008 Panne, CO in SB, 2008 - jeden z nejlépe popsaných enhancerů u vyšších eukaryot – induk. viry - sekvence -102 až -47 básí upstream od počátku transkripce - TF pokrývají 72% povrchu DNA (těsné sbalení DB-domén) – málo PPI - nicméně vazba 8 proteinů je koordinovaná (AP-1, IRF-3, IRF-7, NF-kB) transkripce c-Jun ATF-2 AP-1 Activator Protein = b-ZIP (basic leucine zipper) IFN-b enhanceosom AP-1 NF-kB Panne et al, Cell, 2008 Panne, CO in SB, 2008 - koordinovaná vazba 8 proteinů (AP-1, IRF-3, IRF-7, NF-kB) - AP-1 slabě interaguje s IRF proteinem, ale IRF proteiny mezi sebou nemají žádný kontakt - šroubovice IRF-3 ve VŽ ohýbá DNA, což stimuluje vazbu dalšího IRF - ohyby se po ½ otočce kompenzují, takže DNA je v tomto úseku ROVNÁ transkripce IRF – interferon regulation factor = šroubovice ve velkém žlábku a smyčka kontaktuje base v malém žlábku IFN-b enhanceosom AP-1 NF-kB Panne et al, Cell, 2008 Panne, CO in SB, 2008 - koordinovaná vazba 8 proteinů (AP-1, IRF-3, IRF-7, NF-kB) - p50/REL-A dimerizují (b-listy) - p50 slabě interaguje s IRF-7 - vazba do VŽ … transkripce NF-kB enhanceosome - TF pokrývají 72% povrchu DNA (těsné sbalení DB-domén) IFN-b enhanceosom IFN-b enhanceosom http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=122 enhanceosome CBP/p300 Příště: - Histon, HMG-box - b-sheet motivy - enhanceosom ... a počátek transkripce