Ubikvitóny a tvorba proteínových komplexov Peter Kolesár 13.3.2014 Post-translačné modifikácie proteínov •zvyšujú repertoár proteínov kódovaných bunkovým genómom •rýchle a reverzibilné adaptácie na zmeny •Pripojenie - malých molekúl - fosforylácia, acetylácia, metylácia,... • - proteínových molekúl: ubikvitín + ubikvitínu podobné proteíny (ubiquitin-like proteins, UBLs) = ubikvitóny Ubikvitóny Hochstrasser, 2009 Ubikvitóny - β-grasp fold •Ubikvitín •SUMO-1 •NEDD-8 T. Wilkinson Konjugačný cyklus ubikvitónov Schwartz & Hochstrasser, 2003 Dopad pripojenia ubikvitónu •Pripojenie na proteín cez flexibilný C-koniec •→ priame ovplyvnenie proteínu zriedkavé • • •Prináša povrch pre proteínové interakcie → stimulácia proteín-proteínových interakcií a tvorby proteínových komplexov •Interakčný partner obsahuje nekovalentné väzobné miesto špecifické pre daný ub. (ubiquiton binding domain, UBD) • • • •interakcia medzi ub. a UBD je hlavným mechanizmom funkcie týchto modifikácií C-koniec UBD UB Ubikvitín •malý proteín (76 aminokyselín) •hojný vo všetkých eukaryotických bunkách •globulárna štruktúra •primárna sekvencia je vysoko konzervovaná •kovalentné pripojenie k iným proteínom: karboxylový (C) koniec ubikvitínu (glycín) sa kovalentne pripojí k ε-amino skupine lyzínového zvyšku vnútri cieľového proteínu izopeptidovou väzbou / k amino-skupine N-konca proteínu peptidovou väzbou Ubikvitín - prekurzory •Ubikvitín je kódovaný génovou rodinou, ktorej primárne translačné produkty sú fúzne proteíny •fúzie s ribozomálnymi proteínmi / polyubikvitín –Ub + ribozomálny proteín – spoločná regulácia ubikvitínového systému s translačnou aktivitou bunky –polyubikvitínové gény - exprimované pri stresových podmienkach •fúzne translačné produkty sú rýchlo spracované aktivitou ubikvitínových C-terminálnych hydroláz → voľný ubikvitín Woelk et al., 2007 Ľudia: •E1 – 2 • •E2 – 35 • • •E3 › 1000 • • •Deubikvitinačné enzýmy (DUBs) odštepujú ubikvitín zo substrátu Konjugačný systém E3 ubikvitín ligázy •udeľujú špecificitu tým že rozoznávajú cieľové substráty •väzobné miesto pre cieľový protein + pre špecifický E2 enzým •priblížia substrát a E2 - tým sprostredkovávajú prenos ubikvitínu • •2 hlavné triedy: •RING (Really interesting new gene) E3 ligázy (95%) •HECT (homologous to E6-AP COOH terminus) E3 ligázy Rozdiel mezi HECT a RING E3 ligázami •Rozdiel v prenose ubikvitínu na substrát: •HECT – obsahujú konzervovaný katalytický cysteín, ktorý funguje ako akceptor ubikvitínu z E2. Ubikvitín je následne prenesený na špecifický lyzín substrátu •RING – ubikvitín je prenesený z E2 priamo na substrát Rotin & Kumar, 2009 RING E3 ligázy •RING doména obsahuje 7 cysteínov a 1 histidín alebo 6 cysteínov a 2 histidíny, ktoré držia dva atómy zinku v charakteristickej konformácii (cross-brace motif) •RING sa viaže s E2 • •2 velké podskupiny: –jednoduché RING E3 – na jednom polypeptide sa nachádza RING doména aj doména pre väzbu substrátu – –cullin-RING E3 – tvorené modulárnymi podjednotkami - využívajú RING box protein 1 (RBX1) a RBX2 v komplexe s cullinom a ďalšími substrát-rozoznávajúcimi proteínmi Nalepa et al., 2006 Deshaies & Joazeiro, 2009 Jednoduché RING E3 ligázy •MDM2 –hlavná ubikvitín ligáza pre p53 – p53= „ochranca genómu„ - zabraňuje mutagenéze a následnej karcinogenéze zástavou bunkového cyklu alebo apoptózou, asi 50% ľudských nádorov obsahuje mutáciu v jeho géne –onkogénny RING E3 enzým - expresia je transkripčně indukovná proteínom p53 → negatívna sľučka (MDM2 degraduje p53) –MDM2 inaktivuje p53 nejmenej 3 mechanizmami: •fyzicky blokuje transaktivačnú doménu p53 •podporuje transport p53 z jadra, čo ho udržuje ďaleko od cielových génov •ubikvitín – dependentnou degradáciou –môže pôsobiť ako ubikvitín ligáza aj pre iné tumor supresory –Cielená liečba – vyradenie MDM2 / inhibícia MDM2 interakcie s p53 malými molekulami → stimulácia tumor-supresorovej aktivity p53 (nutlin, PRIMA-1 – fáza II klinických testov) Cullin-RING E3 ligázy Nalepa et al., 2006 Petorski et al., 2005 -multi-podjednotkové E3 ligázy zostavené na cullino-ovom lešení -7 cullinov v ľudských bunách - každý súčasťov množstva E3 ligáz •APC/cyklozóm (Anaphase promoting complex) –1,5 MDa komplex (asi 13 podjednotiek – obsahuje aj cullin (APC2) a RING (APC11) podjednotku) –s APC/C přechodně asociují E2 enzymy UBCH5 nebo UBCH10 –aktivita závisí na aktivátoroch – napr. CDC20, ktorý je aktivní od metafázy do telofázy –Spúšťa prechod z metafázy do anafázy – ubikvitináciou proteínov ako securin, S a M cyklíny, ... –v metafáze APC/CCDC20 iniciuje ubkvitináciu securinu (inhibitor separázy) → aktivovaná separáza štiepi Scc1 podjednotku kohezínu (drží sesterské chromatidy pohromade), čo umožňuje rozchod sesterských chromatíd k pólom bunky – Peters et al., 2006 Cullin-RING E3 ligázy U-box E3 ligázy •U-box motif je štruktúrne podobný RING doméne a viaže E2 enzýmy •U-box neviaže ióny kovu, priestorovú konformáciu určujú intramolekulárne vodíkové väzby •CHIP (carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein) = STUB1 – U-box ligáza dôležitá pri odstraňovaní abnormálnych proteínov ako je nesprávne poskladaný CFTR pri cystickej fibróze a tau proteiny ktoré sa vyskytujú pri niektorých neurodegeneratívnych chorobách (AD) •málo preskúmané HECT E3 ligázy •U ľudí približne 30 HECT ligáz •HECT doména – 350 aminokyselín na C-konci proteínov •HECT doména (homologous to E6-AP COOH terminus) - prvý krát objavená u ubikvitín ligázy E6-AP, ktorá sa asociuje s E6 HPV (human papillomavirus) onkoproteínom, čo vedie k ubikvitinácii a degradácii p53 v bunkách exprimujících HPV-E6 → možná tvorba nádorov (rakovina krčku maternice = děložního čípku) –mutácie pri aktívnom mieste E6-AP – Angelmanov syndrom – mentálna retardácia, nadmerný smiech, .... N-terminální katalytická doména (obsahuje aktivní místo cysteinu-žlutě) ohybová doména Ubc vazebná doména Ubc7 Príklady HECT E3 ligáz Rotin & Kumar, 2009 Monoubikvitinácia / polyubikvitinácia •Polyubikvitinácia – samotný ubikvitín je substrátom ubikvitinácie •Ubikvitín má 7 lyzínov ktoré môžu byť modifikované + N-koniec Komander, 2009 Monoubikvitinácia / polyubikvitinácia Komander, 2009 Dopad pripojenia ubikvitínu •stimulácia proteín-proteínových interakcií •Interakčný partner (ubikvitínový receptor) obsahuje nekovalentné väzobné miesto špecifické pre ubikvitín (ubiquitin binding domain, UBD) •Asi 20 rôznych typov UBD s rôznymi štruktúrami a veľkosťou •Väčšina UBD sa viaže s hydrofóbnym miestom ubikvitínu okolo Ile44 (Leu8, Ile44, Val70) (zvyšok ubikvitínu je polárny) • UBD UB UBD – väzba s monoubikvitínom Husnjak & Dikic, 2012 Rôzne ub reťazce majú odlišnú topológiu Husnjak & Dikic, 2012 UBD - odlíšenie rôznych ub reťazcov Komander, 2009 Funkcie ubikvitinácie Woelk et al., 2009 Cytozolická degradácia proteínov v proteazómoch •veľký (2 MDa) multipodjednotkový proteázový komplex na degradáciu proteínov •cielene degraduje proteíny označené K48 polyubikvitináciou (4 a viac ubikvitínov v reťazci) 26S proteazóm 2004 Nobelova cena za chémiu – objav ubikvitín-dependentnej proteazomálnej degradácie proteínov - Avram Hershko, Aaron Ciechanover, Irwin Rose •Konjugácia ubikvitínu - hlavná nelyzozomálna proteolytická dráha •Po selektívnom označení proteínu konjugáciou ubikvitínového reťazca K48 dochádza k jeho degradácii v proteazóme •odstránenie abnormálnych proteínov, riadi dĺžku života dôležitých regulačných proteínov (transkripčné faktory (p53), cyklíny, securin,...) • Štruktúra 26S proteazómu •Skládá se z 2 subkomplexov: •20S centrálna časť (core particle) – vykazuje katalytickú aktivitu •19S regulačná časť (regulatory particle) Štruktúra 26S proteazómu •20S centrálna časť –tvar súdku → zložený zo 4 spojených kruhov → 2 identické vonkajšie α kruhy a 2 vnútorné β kruhy –každý kruh je zložený ze 7 rôznych podjednotiek - α1-7β1-7 β1-7 α1-7 –proteolyticky aktívne miesto je na β podjednotkách (β1, 2, 5) –α podjednotky obklopujú vstup pre substrát a výstup pre produkt •19S regulační část –zložená najmenej z 18 rôznych podjednotiek, ktoré tvoria subkomplexy bázu (base) a viečko (lid) –viečko obsahuje podjednotky, ktoré viažu ubikvitinované reťazce a 2 deubikvitinačné enzýmy (izopeptidázy) odstraňujúce ubikvitíny (recyklácia) –báza obsahuje 6 ATPáz priliehajúcich k vonkajšiemu kruhu 20S –ATPázy viažu proteíny, ktoré majú byť degradované a za hydrolýzy ATP ich rozbaľujú a posúvajú do 20S Kloetzel, 2001 Architektura proteazómu Lander et al, Nature, 2012 Ubikvitínové receptory proteazómu Finley, 2009 Priebeh degradácie 1.substrát určený k degradácii sa pomocou ubikvitínového K48 reťazca naviaže na 19S, kde sa polyub reťazec odštiepi a zrecykluje 2.ATPázy linearizujú zbalený proteín (esenciálne pre vstup do 20S, globulárne proteíny sú príliš veľké) a zároveň regulujú otváranie vstupného kanáliku do 20S 3.po vstupe substrátu do centrálnej časti je polypeptid štiepený 6 proteolytickými miestami (2 štiepia preferenčne za hydrofóbnymi ak, 2 za bázickými ak, 2 za kyslými ak) na krátké peptidy 4.peptidy sú uvoľnené z proteazómu a sú degradované cytozolickými endopeptidázami a aminopeptidázami na jednotlivé ak a využité pre syntézu nových proteínov či metabolizmus J Am Soc Nephrol 17: 1807-1819 (2006) Imunoproteazóm •exprimuje sa v bunkách pri zápalovej odpovedi (expresia spustená interferónom) a v antigén-prezentujúcich bunkách imunitného systému •Je hybridom pozostávajúcim zo štandardných proteazómových podjednotiek a 3 katalytických β-podjednotiek špecifických pre imunoproteazóm •Štiepi odlišne od 26S - tvorí väčšiu frakciu peptidov schopných slúžiť ako antigénne peptidy (viazať sa na MHC I molekuly) •Antigénne peptidy sú na povrchu bunky naviazané na MHC I molekuly a prezentované pre cytotoxické CD8+ lymfocyty • • SUMO proteíny •Small Ubiquitin-like Modifiers •Malé ~ 11 kDa proteíny •18-20% sekvenčná identita s ubikvitínom •Kvasinky, bezstavovce – iba jeden SUMO proteín •cicavce – 3 izoformy: SUMO-1, SUMO-2, SUMO-3 • •Sumoylácia – kovalentné pripojenie SUMO proteínu k lyzínu cieľového proteínu • -esenciálna vo všetkých eukaryotických bunkách • – väčšinou vo forme monomérov a nie reťazcov • - nevedie k proteozomálnej degradácii • SUMO-1 Sumoylácia Aos1/Uba2 (Sae1/Sae2) human Ubc9 SIZ/PIAS family RanBP2 Pc2 Mms21 Sumoylácia •Reverzibilný proces – SUMO dekonjugované pomocou ULP proteáz u kvasiniek / SENP proteáz u cicavcov •Typické SUMO-akceptorové miesto: • • • • • • •Dopad sumoylácie: SUMO stimuluje interakcie s proteínmi obsahujúcimi SUMO-interakčný motív (SIM) – 3-4 hydrofóbne ak + priľahlé negatívne nabité zvyšky (napr. IVIIEDD) hydrofóbna ak (Ile, Val) cieľový lyzín glutamová/asparágová kyselina ψKxE(D) HSUMO1_1A5R_nmr_ribbons.png K SIM K sumohnev.jpg sumousmev.jpg K SIM SIM K sumohnev.jpg SIM indukovateľnosť špecifickosť sumohnev.jpg sumousmev.jpg SUMO a PML telieska (bodies) •PML proteín (promyelocytic leukemia) je tumor supresor, ktorý spolu s ďalšími interakčnými partnermi v jadre vytvára PML jadrové telieska •PML telieska sú dôležité pri regulácii transkripcie, bunkového cyklu, posttranslačných modifikácií, protivírovej odpovedi, oprave DNA, apoptóze,... •SUMO má centrálnu úlohu pri tvorbe PML teliesok – sumoylácia a následné nekovalentné SUMO – SIM interakcie medzi PML podjednotkami navzájom a s ďaľšími proteínmi sú nevyhnutné pre tvorbu PML teliesok Bernardi, 2007 SUMO funguje ako lepidlo, ktoré drží komplex pohromade SUMO - funkcie •SUMO má významnú úlohu vo viacerých bunkových procesoch: –Jadrový transport –Regulácia transkripcie –Prenos signálu –Metabolizmus DNA –Stabilita genómu SUMO GENES & DEVELOPMENT 18:2046–2059 SENP1 SENP2 SENP3 – nucleolus SNP6 – cytoplasma SUMO vs Ubikvitín •proteíny môžu byť modifikované SUMOm alebo ubikvitínom, často s odlišnými následkami •v niektorých prípadech SUMO súťaží s ubikvitínom o daný lyzínový zvyšok, ale často v regulačných dráhach spolupracujú NEDD8 •NEDD8 – 9 kDa, 60% sekvenčná identita s ubikvitínom •Neddylačný cyklus: - štiepenie neaktívneho prekurzoru • - E1 = NAE (APPBP1/UBA3) • - E2 = Ubc12 / Ube2F • - E3 ligázy • - proteázy •Substráty = cullinové podjednotky E3 cullin-RING ligáz •kovaletným pripojenie NEDD8 ku cullinu je nevyhnutné pre interakciu ligázy s E2, teda pre ubikvitináciu substrátu ISG15 •ISG15 = interferon stimulated gene •Dve spojené domény s vysokou sekvenčnou homológiou k ubikvitínu – 17 kDa •Expresia stimulovaná interferónmi – ISG15 len u vyšších eukaryotov, ktoré používajú interferónovú signalizáciu •E1 (Ube1L), E2 (UbcH6, UbcH8), E3 (Herc5) a deISGyláza (UBP43) sú tiež indukované interferónmi •Úloha v obrane proti vírusom a baktériám – ISG15 modifikuje proteíny vírusu aj hostiteľa •