CG030 – Struktura (architektura) a funkce proteinových komplexů Oficiální fotografie doc. Mgr. Jan Paleček, Dr. rer. nat. doc. Jan Paleček jpalecek@sci.muni.cz (garant) - anglicky nebo česky? biochemici nebo mol. biol.? - - kdo na čem pracuje (zapsat) – přednášky o komplexech, na kterých pracují studenti – prohloubení znalostí s novým úhlem pohledu - Pohled na vybrané procesy probírané v biochemii a molekulární biologii z hlediska proteomiky a především z hlediska proteinových komplexů - výběr komplexů majících vztah k tématům probíraným v laboratořích „chromatinových molekulárních komplexů“, NCBR a dalších skupin z MU - doporučení přednášek: Struktura a funkce eukaryotických chromozomů (C9041), Proteomické metody (CG080) 27.2.2014 11-12.50hod A2-2.11 doc. Marek úvod do strukturní biologie 6.3.2014 11-12.50hod A2-2.11 doc. Paleček protein-proteinové interakce, komplexy 13.3.2014 11-12.50hod A2-2.11 Dr. Kolesár ubiquitinace, ligasy (cullin, APC), proteasom 20.3.2014 11-12.50hod A2-2.11 doc. Marek signální dráhy, GPCR 27.3.2014 11-12.50hod A2-2.11 doc. Paleček DNA-proteinové interakce, vazebné motivy 3.4.2014 11-12.50hod A2-2.11 doc. Paleček DNA-proteinové interakce, transkripční komplexy 10.4.2014 11-12.50hod A2-2.11 Dr. Blažek cyclin/CDK komplexy v buněčném cyklu a transkripci 17.4.2014 11-12.50hod A2-2.11 Dr. Kolesar Oprava DNA, homologní rekombinace 24.4.2014 11-12.50hod A2-2.11 doc. Paleček chromatinové komplexy 1.5.2014 svatek 8.5.2014 svatek 15.5.2013 11-12.50hod A2-2.11 doc. Paleček Evoluce komplexů 22.5.2013 11-12.50hod A2-2.11 doc. Paleček Zkouška - test Program přednášek 2014 Informační zdroje Liljas a spol: Structural biology (2009) … … nejnovější články z časopisů Cell, Nature, Science, PLoS … Databáze proteinových struktur: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do, http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/ Database protein-proteinových interakcí: http://string-db.org/newstring_cgi ... http://www.ebi.ac.uk/intact/?conversationContext=1 Textbook Of Structural Biology Prot interakce kniha ProtDNAInt_f Zkouška: - přednáška x test? •Úvod - Analýza proteinu –Domény •fold-struktura (ss, PDB) •v PyMolu připravit 3D strukturu •Interakce (IntAct) –Komplexy •Funkce •Lokalizace –evoluce •Konkrétní nová data – článek (< 5 let) • •Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat poznatky z přednášek … Otázky při studiu nových proteinů •Konzervace sekvence? Strukturní data? •S jakými partnery interaguje přímo? Jsou koexprimovány a kolokalizovány? Skrze jaké domény interagují? •Je součástí komplexu? Architektura/funkce komplexu? •Ovlivňují nějaké interakce aktivitu daného proteinu? •Kde v buňce/organismu se protein nachází? • http://bhapp.c2b2.columbia.edu/PrePPI/cgi-bin/search.cgi?query=nse3&protein=Q05541 Zhang et al, Nature, 2012 Osnova •Úvod do komplexů – příklady komplexů – sestavování a soudržnost komplexů – funkce komplexu a fenotyp – protein-proteinové interakce – vliv post-translačních modifikací na PPI – komplexy jako adaptéry a lešení – inhibice PPI … •na většině buněčných procesů se podílí komplexy (většina studií se zabývala jednotlivými proteiny nebo aktivitami – pro zjednodušení problému analyzujeme většinou jednu enzymovou aktivitu či funkci jednoho proteinu …) ~800 komplexů v S.c. Bertero et al, Cell, 2010 RPA1, 2, 3 - heterotrimer PCNA homotrimer helikasa hexamer Bertero et al, Cell, 2010 RPA1, 2, 3 - heterotrimer PCNA homotrimer helikasa hexamer •většiny klíčových procesů jako replikace DNA, transkripce, translace se účastní multiproteinové molekulární stroje • •většiny klíčových procesů jako replikace DNA, transkripce, translace se účastní multiproteinové molekulární stroje (složené z více komplexů či podkomplexů) • TFIIB Rpb4/7 RNA pol II TFIIE TFIIF TFIIH TBP TFIIA TRANSKRIPCE PROTEASOM 1fnt Od jednodušších ke složitějším Stabilní proteinové komplexy jsou složené z jednotlivých proteinů/podjednotek které spolu interagují - pokud schází podjednotka, tak nefunguje celý komplex – komplex se nesestaví/rozpadá SMC6 SMC5 Delece kterékoli podjednotky je pro kvasinkovou buňku letální - Mutace mají relativně podobný fenotyp, ale … Deplece kterékoli podjednotky lidského komplexu má za následek pokles hladiny ostatních proteinů Sergeant et al., MCB, 2005 Fanconi anemia „komplementační skupiny“ – geny/proteiny jejichž mutace způsobují FA syndrom – ukázalo se, že většina z nich tvoří jádro FANC komplexu Jones, CMLS, 2012 přerušení protein-proteinové interakce je relativně snadné u slabých dimerů – větší komplexy jsou většinou stabilizovány více interakcemi a je tedy obtížnější je narušit SMC6 SMC5 Stabilita komplexu je zpravidla větší než pouhý součet jednotlivých protein-proteinových interakcí mezi podjednotkami (větší povrch, efekt přiblížení a zorientování partnera …) Nse4 Pull-down kvasinkový 2 a 3-hybridní systém wt mut Podjednotky komplexů koexprimovány (ko-translace) Proteiny s nimiž ko-purifikovala jiná než jenom vlastní mRNA Duncan & Mata, PLoS Genetics, 2011 (S. pombe) Duncan & Mata, PLoS Genetics, 2011 (S. pombe) Proteiny se skládají hned po translaci, nebo za pomoci chaperonů, nebo až v určitém místě (např. v mitochondrii po odštěpení signální sekvence …) - často jsou podjednotky komplexů koexprimovány (podobná regulace transkripce + ko-translace) samostatně by se neposkládaly, byly by nestabilní, toxické nebo by agregovaly (filamenta; protein-proteinové interakce často přes hydrofobní povrchy a je třeba je vytvořit co nejdřív) - koexprese a kopurifikace proteinů (kdo purifikuje proteiny?) Komplexy se utvářejí (převážně) prostřednictvím protein-proteinových interakcí •Polypeptidový řetězec má tendenci vytvářet sekundární struktury -> terciární struktury -> quarterní tj. komplexy (stejné typy nekovalentních vazeb, kritérium minimální energie) (šroubovice a listy se k sobě skládají podobným způsobem) •iontové, vodíkové, hydrofobní síly (kovalentní vazby - disulfidické můstky především u extracelularních proteinů) •vodíkové můstky především u b-listů • – Komplexy se utvářejí (převážně) prostřednictvím hydrofobních protein-proteinových interakcí •- hydrofobní zbytky jsou tlačeny dovnitř proteinu (nikoli do solventu) nebo interakce (nejčastější způsob vazby) –součet hydrofobních sil je značný (převažuje u většiny interakcí) –hydrofobní povrchy se podílí na vytváření coiled-coil vláken f a d e b f c g a d c g f e b Coiled-coil doména je častým dimerizačním modulem proteinů - Ostatní domény/moduly lze definovat pouze obecně: proteiny musí mít komplementární tvar i charakter - - Variabilita je velká – nelze je jednoduše definovat - obtížná predikce (založená na struktuře „vyřešených“ komplexů, v 2010 pouze 300 struktur s partnery z celkem desítek tisíc PDB dat) Dva příklady „vyřešených“ komplexů - Interakční plocha/oblast 1150-10000A2 (vs pro ligandy 100-600A2) - z analýzy protein-proteinových interakcí lze usuzovat na potenciální stabilní komplexy vs přechodné interakce - variabilita interakčních povrchů je velká => variabilita PPI (nelze je jednoduše definovat) S jakými partnery a jak silně interagují vaše proteiny? Jaké domény obsahují? interaktom Post-translační modifikace značně mění povrch (tvar, náboj) – vytváří specifický nový povrch – mohou interagovat specifické vazebné domény - např. SH2 domény váží fosfopeptidy – dvě vazebná místa (fosfoTyr a peptid – peptid určuje vazebnou specificitu) Modifikace AMK zbytek interakční doména Fosforylace tyrosin SH2, PTB serin/threonin 14-3-3, WD40, WW, BRCT acetylace lysin bromodoména metylace lysin chromodoména hydroxylace prolin VHL b ubiquitinace lysin UIM, UBA, CUE SUMOylace lysin SIM Např. SH2 domény váží fosfopeptidy – dvě vazebná místa (fosfoTyr a peptid – peptid určuje vazebnou specificitu) – PDB: 2PLD Bottomley, EMBO Rep., 2004 Modifikace histonů ovlivňují složení a přístupnost chromatinu – bromodoména GCN5 (HAT) navázaná na acetylovaný H4 lysin – PDB: 1E6I SH2 (a jiné) domény jsou často jako moduly součástí proteinů rozmanitých funkcí – provazují proteiny mezi sebou (přechodně, kondicionálně – regulace buněčných procesů) Golemis a Adams - kinása se váže na částečně fosforylovaný substrát a dále ho fosforyluje (MAPKKK signální dráhy) SH2 (a jiné) domény jsou často jako moduly součástí proteinů rozmanitých funkcí – provazují inter- a intramolekulárně ubiquitinace většinou jsou vlastnosti proteinů/komplexů kontrolovány a modifikovány prostřednictvím jejich interakcí a modifikací se sousedními proteiny a dalšími komponentami buněk (DNA, RNA, fosfolipidy, cukry a sekundárními posly) Replikace Oprava DNA Buněčný cyklus Protein-proteinové interakce modulují velmi často GDP-GTP konverze – konformační změna (doc. Marek) – „přenáší“ signál Mnoho proteinů obsahuje pouze interakční domény a mají jediný úkol: nukleace multiproteinových komplexů – scaffold (lešení, STE5) Uetz and Finley, FEBS Lett. 2005 Uetz and Finley, FEBS Lett. 2005 Přeskládáním modulů lze vytvářet komplexní biologické systémy - záměna některé kinásy přesměruje signál do jiného cíle - v průběhu evoluce některé moduly fůzovaly - některé viry využívají buněčné moduly k invazi do buněk (přesměrování ve prospěch viru) - některé onkogeny jsou výsledkem fůze modulů Ivanov et al, TiPS, 2013 Signální dráha (aktivace) - PPI předají - - - Komplexy (blok supresoru) - některé viry využívají buněčné moduly k invazi do buněk (přesměrování ve prospěch viru) - některé onkogeny jsou výsledkem fůze modulů Problémy inhibice (vývoje léků) … - interakční plocha 1150-10000A2 (větší než kapsy enzymů pro malé ligandy) - ploché bez hlubokých kapes (jako pro ligandy) - hydrofobní charakter PPI (nerozpustnost léku) - nelze vycházet z přirozených ligandů (jako u enzymů) - … ale - interakce „peptid ve žlábku“ jsou relativně malé - lze inhibovat interakci i relativně malou molekulou (hot-spot) - vhodné je cílení na interakce regulované post-translační modifikací (viz fosfopeptidy) - mimikování peptidů Inhibice PPI Ivanov et al, TiPS, 2013 Whitby a Boger, ACR, 2012 Inhibice PPI: p53-MDM2 Shangary & Wang, Annu Rev Pharm Toxicol, 2009 HP-E6 ubiquitinace p53-MDM2 (4HFZ) - Inhibice interakce MDM2 stabilizuje p53 – podpora nádorové suprese jeden z prvních Inhibice PPI: p53-MDM2 větší komplexy jsou stabilizovány více interakcemi, ale může se rozpadnout i celý nová peptidomimetika peptidomimetika peptidomimetika fosfopeptidová vazba acetyl-peptidová vazba kapsa pro ATP Závěry •na většině buněčných procesů se podílí komplexy (stabilní či dynamické) •Stabilita komplexu je zpravidla větší než pouhý součet jednotlivých protein-proteinových interakcí •funkce celého komplexu je závislá na každé podjednotce (komplex se nesestaví nebo rozpadne bez všech podjednotek) •některé podjednotky mohou plnit funkci adaptérů či lešení (scafold) •proteiny jsou spojeny prostřednictvím interakcí mezi doménami •protein-proteinové interakce můžeme znázorňovat jako interakční/funkční sítě (databáze mohou napovědět ...)