Výživa a transport látek Prostředí, ve kterém bakterie rostou a množí se, musí obsahovat : •Zdroj uhlíku – pro syntézu malých organických molekul, sloužících jako skelet makromolekul •Zdroj dusíku – tvorba amino- a imino- skupin jako součásti organických látek •Zdroj energie – pro biosyntézu nízkomolekulárních látek a biologických makromolekul tvořících strukturu buňky •Minerální prvky •Růstové faktory – vyžadované organizmy, pokud si je nedokáží syntetizovat • Zdroje uhlíku • • • •Zdroj uhlíku = výchozí substrát • pro biosyntézu • • • • sacharidů lipidů aminokyselin organických bází nukleotidů bílkovin Zdroje uhlíku •Rozdělení bakterií podle uhlíkaté výživy • * autotrofní – základním zdrojem uhlíku je CO2 • * heterotrofní – základním zdrojem uhlíku je jakákoliv organická látka Zdroje uhlíku - autotrofie •U bakterií není autotrofie vázána jen na fotosyntézu (metanotrofové,…) •Existují dva způsoby získání energie - fototrofie a chemotrofie a dva způsoby získávání uhlíku – autotrofie, heterotrofie, které jsou vzájemně kombinovatelné. •Podle výživy lze tedy organizmy rozdělit na fotoautotrofní, fotoheterotrofní, chemoautotrofní, chemoheterotrofní File:Troph flowchart.svg Kombinace zdrojů uhlíku a energie Zdroje uhlíku •Chemoautotrofie (chemolitotrofie)– známa jen u bakterií. Energie se získává oxidací redukovaných anorganických sloučenin (síry, dusíku, železa,..) a zdrojem uhlíku je CO2. •Chemoheterotrofie – zdrojem uhlíku a energie je prakticky jakákoliv oxidovatelná organická látka – většina organizmů •Bakterie metylotrofní – jako zdroj energie a uhlíku slouží většinou jednouhlíkaté sloučeniny obsahující metylskupinu –CH3 (metan, dimetyleter, metanol). • Metylotrofie je obligatorní (Methylomonas) nebo fakultativní (Hyphomicrobium) Zdroje dusíku •Amonné soli, amoniak – pro většinu organizmů – snadno se transportují do buňky (nejvhodnější jako síran a fosfát nebo sůl organických kyselin) •Dusičnany – využívány houbami a některými kvasinkami nebo bakteriemi (nejprve nutná redukce a amonné soli) •Aminokyseliny •Močovina – výhradně jako zdroj dusíku u urobakterií •Molekulový dusík – většinou u bakterií a sinic Zdroje energie •Světelné kvantum – fototrofie •Organické a anorganické látky – chemotrofie (energie se získává oxidoredukčními pochody, jedna látka je oxidována, druhá redukována) • ■ akceptor elektronů a vodíku vzniká katabolizmem donoru - kvašení (fermentace) • ■ akceptorem elektronů a vodíku je molekulový kyslík – aerobní respirace • ■ akceptorem elektronů a vodíku je kyslík v oxidované anorganické sloučenině anaerobní respirace (sírany, nitráty, CO2, …) • Zdroje minerálních látek •Kyslík a vodík – významně ovlivňují celkový metabolizmus buňky. Některé organizmy vyžadují molekulový kyslík a některé mohou využívat molekulový vodík. •Podle vztahu ke kyslíku se organizmy dělí na • striktní (obligatorní) aeroby – aerobní respiratorní metabolizmus • striktní (obligatorní) anaeroby – rostou jen v anaerobních podmínkách (i malý parciální tlak O2 je pro ně toxický) • fakultativní anaeroby – mají metabolické dráhy jak pro respiratorní tak i fermentatorní metabolizmus • aerotolerantní organizmy – mají fermentatorní metabolizmus, rostou v přítomnosti O2, ale nevyužívají jej • Zdroje a využití minerálních látek •Síra – sírany, thiosírany, sirovodík, S0 – při oxidoredukčních pochodech spojených se změnou rH •Fosfor – soli kyseliny fosforečné – součást NK, koenzymů, fosfolipidů, makroergické vazby, … •Draslík – v různých reakcích, při syntéze bílkovin •Sodík – regulace osmotického tlaku, transportní systém, ovlivňuje aktivitu některých enzymů •Hořčík – syntéza bílkovin, syntéza nebo hydrolýza ATP, součást chlorofylu •Železo – reaktivní místo v proteinech obsahujících hem (cytochromech, kataláze) a dalších proteinech •Kobalt – složka vitaminu B12 •Vápník – význam při sporulaci •Zn, Cu, Mo, Ni, Se atd. součástí metaloenzymů Růstové faktory •Růstový faktor – molekula (komponenta buňky), kterou buňka nedovede syntetizovat ze živin •Podle vztahu k růstovým faktorů jsou buňky • ■ prototrofní – všechny potřebné složky syntetizují ze živin • ■ auxotrofní – některé molekuly nedokáží syntetizovat a získávají je z prostředí. Auxotrofie je přirozená (organizmus nemá odpovídající genetickou výbavu) nebo vzniká z prototrofního organizmu ztrátovou mutací •Vyžadovány jsou především vitaminy, aminokyseliny a baze • Transport látek do buňky •Protože buňka je systém otevřený, musí existovat řízený, selektivní a obousměrný transport mezi základní cytoplazmou a vnějším prostředím – barierou je semipermeabilní cytoplazmatická membrána •Tři typy transportu • ■ nespecifická prostá difúze • ■ specifický přenos bílkovinným přenašečem • ■ pinocytóza (u bakterií neexistuje) • Nespecifická prostá difúze •Nespecifická difúze se týká jen malého počtu molekul a iontů (voda, molekuly rozpustné v tucích,Cl-,HCO3-,NO3-, ..) •Rychlost je přímo úměrná koncentračnímu (nebo elektrochemickému) gradientu dané látky a teplotě ▼ Specifický přenos bílkovinným přenašečem •Usnadněná difúze – přenos specifickou bílkovinou po koncentračním gradientu (bez dodání energie) •Aktivní transport prostřednictvím vazebného proteinu. Energii dodává ATP. Primární aktivní transport •Aktivní transport využívající chemiosmotický gradient cytoplazmatické membrány (protonový gradient). Sekundární aktivní transport •Skupinová translokace je uskutečňována transportní bílkovinou a přenos je spojen s modifikací přenášené látky (fosforylací) • Usnadněná difúze •Transport je uskutečňován specifickou bílkovinou, ale po koncentračním spádu dané látky •Rychlost je závislá na koncentračním gradientu, počtu transportních bílkovin a teplotě. Jedna molekula transportní bílkoviny může přenášet až 60 000 molekul substrátu za sekundu •Transport funguje obousměrně (do buňky i z buňky) • Aktivní transport prostřednictvím vazebného proteinu - primární aktivní transport •V periplazmatickém prostoru se na velmi afinní vazební bílkovinu naváže přenášená látka a předá ji na integrální membránový protein, který ji přenese na vnitřní stranu membrány •Předáním energie (z ATP) na transportní protein se rozpadne komplex substrát-bílkovina a substrát se uvolní do základní cytoplazmy Transportní protein Aktivní transport prostřednictvím vazebného proteinu - sekundární aktivní transport •Zdrojem energie pro transport je protonový gradient •Transport je uskutečňován jediným membránovým proteinem •Transport iontů jde po koncentračním gradientu, transport živin proti koncentračnímu gradientu •Symport – oba ligandy jsou transportovány jedním směrem •Antiport – ligandy jsou transportovány opačným směrem •Uniport – přenášejí se jen ionty •Je velice častý u bakterií (u E.coli se takto dostává do buňky až 40% substrátů) Vně Uvnitř Uniport Symport Uniport Antiport Symport Aktivní transport prostřednictvím vazebného proteinu – skupinová translokace •transportovaný substrát je chemicky měněn •Např. specifické pro každý přenášený cukr jsou enzymy Enz II a EnzIII vázané na cytoplazmatickou membránu •Fosfotransferázový systém plní také regulační funkci (např. transport glukózy inhibuje transport laktózy sekundárním transportem – glukózový efekt ; nebo inhibuje adenylátcyklázu, která je nutná pro přepis laktózového operonu , …. •Při skupinové translokaci nemůže dojít k vytvoření rovnováhy přenášeného substrátu na membráně, protože je chemicky modifikován •Většina substrátů je přenášena více než jedním mechanizmem (galaktóza celkem 5) • Metabolizmus Metabolizmus •Každá živá buňka je otevřený systém, který je charakteristický výměnou s prostředím (hmoty, energie, informace) •Živiny z prostředí do buňky → transformace – tvorba energie, syntéza biomolekul → exkrece metabolitů •Tok hmoty, energie a informace buňkou → metabolizmus • • • Metabolizmus •Metabolická aktivita mikroorganizmů je mimořádně různorodá •Metabolizmus buňky (tok hmoty a energie buňkou) tvoří celek, který má dvě protichůdné kategorie • katabolizmus • anabolizmus Metabolizmus •Katabolizmus – představuje degradativní procesy, vedoucí ke tvorbě energie (-ΔG) •Anabolizmus – vede k syntéze jednotlivých složek buňky a je spojen se spotřebou energie (+ΔG) •Katabolizmus a anabolizmus jsou dva protichůdné procesy, které vedle sebe existují v prostoru a čase a vzájemně se podmiňují Metabolizmus •Proces metabolizmu je souhrn biochemických reakcí, které • a/ probíhají posloupně a jsou “seřazeny“ do řad – metabolické dráhy • b/ uzavřeny do kruhu – cykly • •Výsledný metabolit může vznikat více než jednou metabolickou drahou – alternativní metabolické dráhy • • • Energie •V rovnovážném stavu je volná energie minimální a nedochází k její změně •Potom ΔGo = 0 z toho • • ΔGo = - RT ln K = -2,303 RT log K • • R – konstanta (the gas constant = 8.314 J/mol·K) • T – teplota • K – rovnovážná konstanta • Makroergické vazby •Energetický metabolizmus probíhá při spřažení exergonických a endergonických reakcí •Pro uskutečnění syntézy je nutné, aby součet změn volné energie obou spřažených reakcí byl negativní nebo alespoň s nulovou hodnotou Makroergické vazby •Syntetické reakce probíhají většinou za účasti energeticky bohaté sloučeniny (ATP, látka schopná vytvářet makroergickou vazbu) •Díky vysoké hladině ΔG makroergické vazby, se aktivuje substrát a umožní se tím vlastní reakce ATP •ATP – univerzální přenašeč energie – univerzální donor fosfátu v anabolických reakcích •Soustava ADP ↔ ATP je univerzálním “spřahovačem“ katabolizmu a anabolizmu •Kterákoliv exergonická reakce může “pohánět“ jakoukoliv endergonickou reakci •Proto je metabolizmus jako celek vysoce spolehlivý • ATP Centrální úloha ATP při syntéze biologických makromolekul D:\Users\Uživatel\Documents\Martin MU\sluz\prednasky cviceni\prednasky2015\mikrobiologie\synteza polysaccharidu.png Biochim Biophys Acta. 1967 Feb 14;137(1):23-32. Controlling effects of ATP, mg2+ and CTP in the biosynthesis of lipids. Erbland JF, Brossard M, Marinetti GV. ATP •Tvorba ATP • ☺ na úrovni substrátu • ☺ na úrovni membrány • * u prokaryot na cytoplazmatické membráně • * u eukaryot na vnitřní membráně mitochondrií 1. Tvorba ATP na úrovni substrátu 2. - vysokoenergetická molekula fosfátu je přenesena z katabolizovaného organického substrátu na ADP za tvorby ATP organický fosfát - enzym - ADP – ATP - procesy kvašení, energeticky málo výhodné EMP dráha Clostridium, Bifidobacterium Tvorba ATP na úrovni membrány •Respirační řetězec •ATP se generuje •vytvářením potenciálu •na membráně přechodem •přes cytochromový •řetězec http://orion.chemi.muni.cz/zakladni_pojmy_z_biochemie/page0256.htm File:NAD+ phys.svg NAD(P) File:NADP+ phys.svg Nicotinamide adenine dinucleotide Role NAD(P) v metabolizmu •NAD(P) – univerzální přenašeč vodíku a elektronů •Jeho redukovaná i oxidovaná forma volně cirkuluje v základní cytoplazmě •Molekula NAD(P)+ je redoxním systémem • NAD(P)+ + 2 H+ + 2e- ↔ • NAD(P)H ++ H+ E´0 = - 0,32V Role NAD(P) v metabolizmu •NAD(P) – je druhým substrátem řady cytoplazmatických dehydrogenáz (laktát dehydrogenáza, glyceraldehyd-3-P dehydrogenáza, ….) •Některé dehydrogenázy využívají jako druhý substrát NAD+ jiné NADPH+ •Bakterie (a některé mikroorganizmy a živočišné buňky) obsahují NAD(P)+ -transhydrogenázu, katalyzující reakci • NADPH + NAD+ ↔ NADP+ + NADH Role NAD(P) v metabolizmu •NADH je určeno především k redukci kyslíku a produkci ATP na úrovni membrány (exergonické reakce) • •NADPH je určeno především k redukcím v biosyntetických pochodech (endergonické reakce) Role NAD(P) v metabolizmu biosyntetické reakce katabolizmus respirační řetězec ATP ADP + Pan NADP+ NADPH+H+ NAD+ NADH+H+ ATP ADP+Pan O2 H2O oxidované produkty redukované substráty redukované produkty biosyntézy oxidované metabolity Role NAD(P) v metabolizmu •Koncentrace • NAD+/NADH • NADP+/NADPH • NADH/NADPH • jsou v buňce konstantní, • jejich velikost se citlivě reguluje, • v závislosti na rychlosti tvorby a • spotřeby Metabolizmus •Rozdělení organizmů ve vztahu ke zdrojům energie • •Chemotrofní •Fototrofní Vztah chemotrofů ke kyslíku •Obligátně (striktně) aerobní • zisk energie → aerobní respirace •Obligátně (striktně) anaerobní • zisk energie → anaerobní respirace • Akceptorem elektronu může být dusičnan, síran či podobné • → fermentace •Fakultativně anaerobní • zisk energie → aerobní respirace • → anaerobní respirace • → fermentace •Mikroaerofilní •Aerotolerantní Glykolýza glukóza P glukóza-6- 3-fosfoglycerát P P P P fruktóza-6- fruktóza -1,6- glyceraldehyd-3- 1,3-difosfoglycerát 2-fosfoglycerát fosfoenolpyruvát pyruvát P P P P AT NADH P P P ADP AT ADP 2 2 2 2 2 2 aldoláza Pi glyceraldehyd-3-P dehydrogenáza 2 AT 2 ADP P fosfoglycerokináza enoláza pyruvát kináza ADP P AT laktát etanol acetaldehyd+CO2 pyruvátdekarboxyláza NAD+ NADH NAD+ laktát dehydrogenáza alkohol dehydrogenáza Fermentace – úloha pyruvátu pyruvát Streptococcus Lactobacillus kvasinky Propionibacterium Clostridium E.coli Salmonella laktát etanol CO2 propionová k. HAc, CO2, H2 máselná k. butanol aceton izopropyl alkohol CO2 etanol mléčná k. mravenčí k. acetoin CO2 , H2 glykolýza Fermentace •Homofermentativní kvašení – konečným produktem je jedna látka v převažujícím množství (obvykle více než 90%) - homofermentativní mléčné kvašení – Lactobacillus acidophilus → kyselina mléčná (acidofilní mléko) •Heterofermentativní kvašení – konečným produktem je několik metabolitů (některý může převažovat) – máselné kvašení - Clostridium → kyselina máselná, butanol, izopropyl alkohol,aceton • • • • Etanolové kvašení u kvasinek • Glukóza fruktóza-diP • • 2 gly-P 2 trióza-P • • pyruvát • • acetaldehyd etanol 2ATP 2ADP 4ATP 4ADP 2CO2 2NAD+ 2NADH+H+ EMP dráha 2CO2 etanol Čistý výtěžek : 2 ATP/mol glukózy Čistý výtěžek : 2 ATP/mol glukózy Etanolové kvašení u bakterií ketodeoxyglukonátová (Entner-Doudorofova)dráha • glukóza • • glu-6-P • • glukonát-6-P • • 2-oxo-3-deoxy-6-P-glukonát • • pyruvát glyceraldehyd-3-P • • • • etanol CO2 etanol CO2 + + -2H+ - H2O + 2H+ +2H+ ATP ADP 2 ADP 2 ATP Čistý výtěžek: 1 ATP/ mol glukózy Organizmus: Zymomonas Homofermentativní mléčné kvašení • •glukóza EMP 2 pyruvát • • •2 laktát 2 NAD+ 2 NAD+ 2 NADH+H+ 2 ATP 2 ADP 4 ADP 4 ATP Čistý výtěžek : 2 ATP/mol glukózy 2 laktát 2 CO2 Organizmy : Lactobacillus acidophilus, L.bulgaricus, L.casei, L. leichmannii, Streptococcus lactis Heterofermentativní mléčné kvašení (fosfoketolázová dráha) • glukóza • • • • glukóza-6-P • • • • k.6-P-glukonová • • • • ribulóza-5-P • • • • • • Čistý výtěžek : 2 ATP/mol glukózy • • ATP ADP NAD+ NADH+H+ xylulóza-5-P glyceraldehyd-3-P acetyl-koA acetyl-P k.pyrohroznová acetaldehyd CO2 NAD+ NADH+H NAD+ NADH+H+ 2 ADP 2 ATP NAD+ NADH+H+ laktát fosfoketoláza ADP ATP HSkoA NADH+H+ NAD+ HSkoA NADH+H+ NAD+ etanol Organizmy : Lactobacillus brevis, L.delbrueckii, Leuconostoc mesenteroides Propionové kvašení glukóza EMP-dráha PEP pyruvát oxalacetát malát fumarát sukcinát sukcinyl-koA HSkoA propionyl-koA metylmalonyl-koA CO2 H2O acetyl-koA acetyl-P HSkoA NAD+ NADH+H+ HSkoA Pan 2 ATP 2 ADP 4 ATP 4 ADP NADH+H+ NAD+ ADP ATP FADH2 FAD ADP ATP CO2 acetát propionát Organizmy: Propionibacterium, Veillonella alcalescens navíc Intermediáty do syntéz Máselné kvašení glukóza pyruvát acetyl-koA koA acetaldehyd acetyl-koA butyryl-koA krotonyl-koA β-hydroxybutyryl-koA acetoacetyl-koA acetoacetát butyrylaldehyd acetát acetát acetyl-koA etanol acetát CO2 aceton izopropanol CO2 H2 + butyrát Butanol Kosmetika… NAD+ NADH+H+ NAD+ NADH+H+ NAD+ NADH+H+ NAD+ NADH+H+ EMP NAD+ NADH+H+ NAD+ NAD+ NADH+H+ NADH+H+ Organizmy: Clostridium butyricum, C.butylicum, C.acetobutylicum, C.saccharoperbutylacetonicum Kvašení pentóz ribóza ribóza-5-P ribulóza-5-P xylóza xylulóza xylulóza-5-P arabinóza ribulóza ribulóza-5-P acetyl-P glyceraldehyd-3-P acetát Pan H2O EMP ATP ADP ATP ADP ATP ADP ADP ATP 2 ADP 2 ATP laktát Organizmy: bakterie mléčného kvašení (výroba produktů mléčné výživy) Kvašení aminokyselin I. •Zkvašování jednotlivých aminokyselin •Zahrnuje reduktivní deaminaci podle rovnice • • R- CH2CHCOOH + 2H+ • • R-CH2COOH + NH3 • NH2 Těmto procesům podléhají především: alanin, arginin, histidin, kys. glutamová, glycin, treonin, metionin, prolin, tryptofan Kvašení aminokyselin II. •Anaerobní dekarboxylace vedoucí k tvorbě aminů. Proces je katalyzován substrátově specifickými dekarboxylázami. Reakce jsou příznačné zvláště pro diaminokyseliny. • CH2-CH2-CH2-CH2-CH-COOH • • • CH2-CH2-CH2-CH2-CH2 + CO2 NH2 NH2 NH2 NH2 lyzin kadaverin Kvašení dvojic aminokyselin •Sticklandovy reakce (Stickland u Clostridium – r.1939) •Energie je získávána oxidoredukcí mezi dvěma vhodnými aminokyselinami • nebo • aminokyselinou a bezdusíkatou látkou Kvašení polysacharidů •Glykogen a škrob amylázy oligosacharidy maltóza maltáza glukóza (Clostridium, Bacillus) •Celulóza celuláza celobióza celobiáza glukóza (Clostridium) •Pektin protopektinázy celulóza + protopektiny kys.polygalatouronová pektináza metanol + kys.galaktouronová+arabinóza+galaktóza+ xylóza kys.máselná + octová + CO2+ H2 (Clostridium, Bacillus macerans) Regulace zpětnou vazbou Tvorba energie na úrovni membrány •Aerobní respirace •Anaerobní respirace •Fototrofie Tvorba energie na úrovni membrány •Aerobní respirace • neúplná oxidace substrátu • primárních alkoholů • glukózy • úplná oxidace substrátu • Krebsův cyklus • Cyklus dikarbonových kyselin • Cyklus kyseliny glyoxalové • Pentózový cyklus (hexózomonofosfátová dráha) Neúplná oxidace alkoholů •Oxidace primárních alkoholů • kyseliny •Oxidace sekundárních alkoholů • ketony • Neúplná oxidace glukózy glukóza glukóza-6-P k.glukonová k.6-P-glukonová ribulóza-5-P k. 2-ketoglukonová k. 5-ketoglukonová Acetobacter melanogenum k. 2,5-diketoglukonová Acetobacter suboxidans fosforylační dráha nefosforylační dráha Gluconobacter (syntéza NK) (syntéza – bílkoviny) Úplná oxidace substrátu Krebsův cyklus ATP respirační řetězec β-oxidace mastných kyselin glykolýza Oxidace biomolekul protein lipid nukleové kys. polysacharidy peptidy aminokyseliny Glycerol + mastné kyseliny puriny pyrimidiny kys.močová dihydroxyuracil pentózy monosacharidy pyruvát acetát TCA NH4+ S2- PO43- CO2 H2O + + + + Hydrolázy vně buňky toto do buňky Aerobní oxidace lipidů •H2C – O – mastná kyselina • HC – O – mastná kyselina •H2C – O – mastná kyselina • •H2C – O – mastná kyselina • HC – O – mastná kyselina • O • H2C – O – P O –(X) • OH lipáza fosfolipáza D fosfolipáza C fosfolipáza B fosfolipáza A Oxidace polysacharidů •Prvním krokem je hydrolýza na mono- nebo di-sacharidy • • Oxidace škrobu a glykogenu •Škrob i glykogen je tvořen proměnlivým podílem • amylózy – lineární řetězec α-1,4-glukozid •a • amylopektinu – rozvětvený řetězec α-1,4-glukozid s větvením 1,6 • •*hydrolýza větvení vazby 1,6 specifický enzym α-1,6-glukozidáza •α-amyláza,β-amyláza, -amyláza •α-amyláza štěpí škrob na kterémkoliv místě •β-amyláza štěpí škrob z obou konců • -amyláza štěpí z neredukujícího konce po glukózových jednotkách •α-amyláza + amylóza dextrin maltóza+ glukóza (6:1) •Účinek α-amylázy na amylopektin závisí na stupni větvení (vazby 1,6 nehydrolyzují) • • • Oxidace škrobu a glykogenu •Fosforolytické štěpení řetězce s vazbami 1,4 • Začíná u neredukujícího konce působením polysacharidfosforylázy α-D-glukóza-1-fosfát • fosfoglukomutáza • glukóza-1,6-difosfát Štěpení celulózy (vazba 1,4) celulázovým komplexem prehydratační faktor (aktivační faktor, bobtnací faktor) -amyláza α-amyláza β-amyláza β-amyláza celobiáza -amyláza Štěpení bílkovin •protein • polypeptid • oligopeptid • aminokyselina • •Atak z aminového konce • bílkovinného řetězce proteáza endopeptidáza exopeptidáza Oxidace aminokyselin •Oxidace aminokyselin v aerobních podmínkách začíná oxidativní deminací • •R-CHCOOH + ½ O2 R-COCOOH + NH3 • • • •Aminokyseliny mohou být oxidovány jednotlivě nebo několik současně NH2 Anaerobní respirace Anaerobní respirace •Při anaerobní respiraci je organický substrát oxidován přenosem protonů a elektronů na kyslík vázaný v anorganické látce •Elektrony na vázaný kyslík - uskutečňují příslušné cytochromreduktázy •Tímto způsobem získávají energii chemoorganotrofní bakterie, vyjimečně chemolitotrofní •U chemoorganotrofních bakterií je organická látka současně zdrojem energie i uhlíku • Anaerobní respirace •Procesy anaerobní respirace • * redukce dusičnanů na dusitany • * denitrifikace • * desulfurikace • * redukce CO2(metanové kvašení) Redukce dusičnanů na dusitany •Nitrát reduktáza je membránově vázaný enzym obsahující molybden •Syntéza nitrát reduktázy je striktně blokována molekulovým kyslíkem •Na 1 mol NO3- - 2 ATP •Hromadění vytvořeného dusitanu potlačuje růst bakterií • •Organizmy: E.coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus a další fakultativně anaerobní bakterie • Nitrát reduktáza Fp - flavoprotein FeS – bílkovina s nehemově vázaným Fe-S Redukce dusičnanů na dusitany •Zdrojem vodíku a elektronů může být jakákoliv organická látka •CH3COOH + 4NO3- • CO2 + 4NO2- + 2 H2O •nebo • •C6H12O6 + 12 NO3- • 6 CO2 + 6 H2O + 12 NO2- Denitrifikace •Denitrifikace – proces redukce dusitanů na N2 nebo N2O nebo směs obou plynů •2 NO2- + 4 H+ N2O + H2O + 2 OH- •N2O + 2 H+ N2 + H2O • •CH3COOH + 2 NO2- • 2 CO2 + N2O + H2O + 2 OH- Desulfurikace •Donorem elektronů a protonů je organická látka nebo plynný vodík •Jako akceptor vystupuje síran, siřičitan, thiosíran, tetrathionát, …. •Redukci těchto látek uskutečňují především anaerobní bakterie – zástupci rodů Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfosarcina, Desulfonema a některé Archeae Desulfonema sp. Desulfurikace •Při procesu desulfurikace vznikají energeticky bohaté sloučeniny APS - adenozin 5´-fosfosulfát •a • PAPS – fosfoadenozin-5´-fosfosulfát APS PAPS Využíván v disimilačním metabolizmu Využíván v asimilačním metabolizmu Redukce CO2 a CO •Konečným produktem je metan •Organizmy jsou striktní anaerobové (jsou podstatně citlivější ke kyslíku než denitrifikační nebo desulfurikační bakterie) •Jsou dvě skupiny metanogenních organizmů využívajících jako akceptor protonů a elektronů CO2 • metanogenní • homoacetogenní •Jako zdroj vodíku a elektronů nikdy nevyužívají cukry a aminokyseliny •Jako substrát slouží H2, nižší mastné kyseliny, primární alkoholy, izoalkoholy. Redukce CO2 - donor metanol metanogeneze •Corr – protein obsahující korrinoid •CODH – karbonmonooxid dehydrogenáza metanogeneze biosyntéza Tvorba acetyl-koA pro biosyntézu Využití redukční síly k redukci metanolu na metan Tvorba redukční síly oxidací metanolu na CO2 Co dehydrogenáza Některé alternativní akceptory elektronů v anaerobní respiraci •Desulfotomaculum auripigmentum redukuje arsenát v po redukci síranů – As2S3 – je vytvářen intracelulárně i extracelulárně. Produkce “minerálů“ se označuje jako biomineralizace. As2S3 Tvorba As2S3 v prostředí je součástí detoxifikačních procesů v prostředí Chemolitotrofní bakterie Energetický metabolizmus chemolitotrofních bakterií •Chemolitotrofní bakteri získávají energii precesy aerobní respirace •Zdrojem energie je redukovaná anorganická látka •Konečným akceptorem vodíku a elektronů je molekulový kyslík •Zdrojem uhlíku je CO2 •Podle povahy substrátu • Oxidace amoniaku (nitrifikace) • Oxidace sloučenin síry (sulfurikace) • Oxidace sloučenin železa • Oxidace vodíku • Oxidace metanu Energetický metabolizmus chemolitotrofních bakterií Energetický metabolizmus - nitrifikace •Oxidace amoniaku probíhá ve dvou stupních •nitritace •2 NH3 + 3 O2 2 NO2- + H2O + 2 H+ •nitratace •2 NO2- + O2 2 NO3- Energetický metabolizmus - nitrifikace Organizmus: Nitrosomonas (obligatorní chemolitotrof a autotrof), Nitrosococcus Nitritace amoniumoxigenáza Energetický metabolizmus - sulfurikace •Biochemizmus oxidace redukovaných sloučenin síry není dostatečně znám •Sekvence reakcí •4 S2- 2S2O32- S4O62- SO32- + S3O62- 4 SO32- • 4 SO42- Energetický metabolizmus – oxidace Fe • •Leptothrix je schopný oxidovat vedle železa i mangan •Mn2+ + ½O2 + H2O • MnO2 + 2 H+ • ΔGo = -68 kJ Energetický metabolizmus oxidace vodíku •Bakteriální dehydrogenázy plynného vodíku •vodík:NAD+-oxidoreduktáza (dehydrogenáza vodíku) – rozpustná – tvorba redukčních ekvivalentů pro biosyntézu a membránově vázaná – oxidace vodíku za tvorby ATP •vodík:ferricytochrom c3-oxidoreduktáza (cytochrom c3-hydrogenáza)-membránově vázaná, reagující na úrovniubichinon-cyt.b přes cyt. C (Paracoccus denitrificans) •vodík:feredoxin-oxidoreduktáza (feredoxin-hydrogenáza). Vyskytuje se u řady fakultativně anaerobních bakterií (E.coli, P. vulgaris, …) Fototrofní bakterie Energetický metabolizmus fototrofních bakterií •Fotofosforylace - proces transformace energie světelného kvanta do energie makroergické vazby •Fototrofní mikroorganizmy • purpurové nesírné bakterie • heliobakterie • zelené sirné bakterie • purpurové sírné bakterie • cyanobakterie • halobakterie (bez bakteriochlorofylu) • Bakteriochlorofyl •a – purpurové (805, 830-890nm) •b – purpurové (835-850, 1020-1040) •c – zelené sírné (745-755) •cs – zelené nesírné (740) •d – zelené sírné (705-740) •e – zelené sírné (719-726) •g – halobakterie (670, 788) Bakteriochlorofyl Fotosyntetická jednotka • • Pigment vážící světlo (molekuly antén) Reakční centrum Excitová dráha Cyklická fosforylace Necyklická fosforylace H2S S H++H+ Fotosyntéza u sinic •na povrchu thylakoidálního váčku se nachází tzv. fykobilizómy •jsou to drobné útvary (které obsahují specifická barviva, zvaná fykobiliny (fykobiliproteiny) •v membráně thylakoidu jsou obsaženy chlorofyl a, a- i b- karoten a xanthofyly (echinenon, myxoxanthofyl, zeaxanthin) 523 allofykocyaniny (namodralé barvy) phycobilisome Fotosyntéza bez chlorofylu halobakterie •Pokud halobakterie rostou při nízké tenzi kyslíku mohou syntetizovat “červené“ skvrny v cytoplazmatické membráně - bakteriorhodopsin •Skvrny obsahují 7 bílkovinných molekul (α helix). Na jednu molekulu je připojen retinal •Bakteriorhodopsin (aldehyd vitaminu A) maximálně absorbuje při 570 nm Fotosyntéza bez chlorofylu halobakterie •Bakteriorhodopsin absorbuje maximální množství energie ze záření •Mimo bakteriorhodopsinu halobakterie neobsahují další “foto“ pigment •Tvorba energie není doprovázena tokem elektronů (protonový gradient) • ANABOLIZMUS BIOSYNTÉZA ANABOLIZMUS - BIOSYNTÉZA •Při anabolizmu je ke tvorbě molekulových komplexů a struktur z malých molekul využívána volná energie získaná v procesech katabolizmu •Procesy biosyntézy jsou regulovány tak, aby byla co nejefektivněji využíváno energie a stavebního materiálu •Katabolické a anabolické dráhy mají odlišné enzymy, kofaktory,donory vodíku a elektronů, regulaci, lokalizaci v buňce, … •Avšak řada enzymů se podílí na průběhu katabolických i biosyntetických drah • • ANABOLIZMUS - BIOSYNTÉZA •Fosfor ve formě fosfátu může být asimilován přímo •Anorganický dusík a síra musí být většinou před inkorporací do buněčného materiálu redukován •Autotrofové využívají v biosyntetických pochodech ATP a NADPH z fototrofie nebo oxidace anorganických látek pro redukci a inkorporaci CO2 do organického materiálu • Role ATP a promotivní síly v integračních procesech ANABOLIZMUS spotřeba energie KATABOLIZMUS tvorba energie substrát produkt makromolekuly a buněčné konstituenty ATP protonový gradient monomér Tok energie do hlavních typů syntéz TTP GTP CTP ATP CTP GTP UTP UTP CTP GTP DNA RNA bílkoviny lipidy poly- sacharidy ~ Konstrukce buněk buňka organely supramolekulové komplexy makromolekuly anorganické molekuly CO2, NH3, H2O, PO43- nukleotidy, aminokyseliny, cukry, mastné kyseliny monoméry nebo stavební bloky NK, proteiny, polysacharidy, lipidy membrány, enzymové komplexy jádro, mitochondrie, ER, .. Fixace CO2 při metabolizmu mikroorganizmů NADPH2-dependentní izocitrát malát Feredoxin-dependentní pyruvát ATP karbamyl-P PEP oxalacetát 2-oxoglutarát enzym+biotin+CO2 Komplex metylmalonyl-koA malonyl-koA oxalacetát Fixace redukcí Fixace aktivní CO2 Calvinův cyklus 6 ribulóza-1,5-diP 12 fosfoglycerová k. 12 1,3di fosfoglycerová k. 12 3-P glyceraldehyd glukóza-6P 2 fruktóza-1,6diP 2 xylulóza-5P 2 erytróza-4P 2 sedoheptulóza-1,7diP 2 ribulóza-5P 2 xylulóza-5P 6 ribulóza-5P 2 4 2 2 2 6 CO2 6 H2O 12 ATP 12ADP 12NADPH 12 NADP+ 12 Pi Nová dráha autotrofní fixace CO2 citrát oxalacetát malát fumarát sukcinát α-ketoglutarát izocitrát 2 H+ malát dehydrogenáza H2O sukcinyl-koA 2 H+ fumarát reduktáza fumaráza ATP ADP koA 2H+ koA 2H+ akonitáza ATP citrát lyáza ATP ADP koA acetyl-koA Chlorobium limicola, Hydrogenobacter thermophilus, Desulfobacter hydrogenopohilus CO2 CO2 (Litotrofové – nemají calvinův cyklus Fixace CO2 heterotrofy •Doplňování intermediátů Krebsova cyklu (anaplerotické reakce) • •fosfoenolpyruvát + CO2 • oxalacetát + Pi •pyruvát + CO2 + ATP • oxalacetát + ADP + Pi •pyruvát + CO2 + NADH+H+ • malát + NAD+ PEP-karboxyláza pyruvát karboxaláza biotin jablečný enzym Asimilace dusíku NH4 NH4+ NO3- N2 glutamát glutamin glutamát 2-oxoglutarát aminokyseliny pyruvát 2-oxoglutarát glutamát aminokyseliny alanin aminokyseliny + 2 [H+] + 2 [H+] + 2 [H+] ADP ATP redukce Asimilace dusíku •Redukce dusičnanů – asimilační redukce nitrátů (neprobíhá však stejně jako redukce nitrátů při anaerobní respiraci) •Inkorporace nevyžaduje dodání energie • probíhá u bakterií,řas a hub Asimilace dusíku •Redukce N2 (fixace molekulového dusíku) nitrogenázou Nitrogenáza může redukovat látky obsahující trojnou vazbu – acetylen, kyanid, azid Syntéza monosacharidů •Glukoneogeneze je využívána většinou mikroorganizmů • Jde o obrácenou glykolýzu (modré šipky naznačují průběh glykolýzy) Syntéza monosacharidů •Reduktivní cyklus trikarbonových kyselin CO2 CO2 Biosyntéza aminokyselin •Biosyntetické produkty jsou odvozeny z amfibolických drah •Anaplerotické fixace CO2 Syntéza lipidů a fosfolipidů CDP – cytidin difosfát přenášející protein triacylglycerol fosfatidyletanolamin Syntéza polysacharidů glukóza glukóza-6-P fruktóza-6-P pyruvát glykolýza uridin difosfoglukóza UDP-N-acetylglukózamin adenozin difosfoglukóza ADPG UDPG UDPNAc glykogen (u bakterií) glykogen (u savců) peptidoglykan UTP ATP Syntéza polysacharidů •Syntéza glykogenu •ADP-glukóza + (glukóza)n ADP + (glukóza)n+1 •Syntéza glykogenu vyžaduje přítomnost existující molekuly glykogenu (nejméně 4 monomery) •Za větvení je zodpovědný specifický větvící enzym Syntéza purinů a pyrimidinů Glykolýza glukóza glukóza-6-P 3-fosfoglycerová kys. pyruvát acetyl-koA Krebsův cyklus pentózy pentózo fosfátová dráha nebo Entner-Doudorofova dráha Purinové nukleotidy Pyrimidinové nukleotidy glutamin glycin asparagová kys. Syntéza peptidoglykanu baktoprenol pyrofosfát Shrnutí základních kroků biosyntézy Regulace metabolizmu Regulace metabolizmu •Regulační systémy buňky • ● Regulace syntézy enzymů – zajistit odpovídající poměr mezi rychlostí syntézy enzymů a rychlostí syntézy celkové buněčné bílkoviny • ● Regulace na úrovni aktivity enzymu – je vlastní pouze klíčovým enzymům metabolizmu • •Oba typy regulace ovlivňují “výkonnost“ dané metabolické dráhy • • Regulace syntézy enzymů •Indukce se uplatňuje především při katabolických procesech • Syntetizovány jsou pouze enzymy podílející se na využívání substrátu a to pouze v případě, že substrát je přítomen • • • A B C D substrát meziprodukt indukce s a b c d Regulace syntézy enzymů •Represe – je využívána především v anabolických procesech • Energeticky je výhodné, aby enzym nebyl syntetizovaný v době, kdy je přítomen jeho produkt • • • O P R S metabolit meziprodukt s r p o i represe Regulace syntézy enzymů Represe •Přítomnost konečného produktu v nadlimitní koncentraci,snižuje rychlost syntézy enzymu předchozího kroku nebo všech enzymů dráhy •Represe konečným produktem •Jestliže je však enzym nutný pro syntézu esenciální struktury buňky bude se syntetizovat nepřetržitě, ale jeho syntéza může být zpomalena Regulace syntézy enzymů Represe •Katabolická represe – pokud jsou v prostředí dva substráty. Buňka dává přednost energeticky výhodnějšímu substrátu. Tento substrát potom vyvolá represi enzymů, které jsou nutné pro využívání substrátu druhého (diauxie) Regulace na úrovni aktivity enzymu •Katalytická aktivita enzymů se může • ~ zvyšovat – působením pozitivního efektoru • ~ snižovat – působením negativního efektoru • ~ při inhibici konečným produktem – produkt snižuje aktivitu prvního enzymu • • O P R S konečný produkt meziprodukt s r p o i inhibice konečným produktem