Kapitoly z
neurofyziologie smyslo
Neurofyziologie
Ambice: Pochopení psychiky
• lov• ka a jejích poruch.
Molekulární neurov• dy
Neurofarmakologie
Zobrazovací metody
Optogenetika.
BouYlivý rozvoj:
Pam• e
Závislosti
Deprese
Neurodegenerativní poruchy
Lokalizace mozkových funkcí
(déjà vu, empatie atd.)
PYednostn• Yeaené problémy:
Brno: CEITEC
http://www.ceitec.cz/ceitec-
mu/vyzkum-mozku-a-lidske-
mysli/v8
Doktorské studium Neurov• dy
http://www.med.muni.cz/index.p
hp?id=599
Pracoviat• :
Nobel prices related to neuroscience
1901Wilhelm Conrad Röntgen (Germany) "in recognition of the extraordinary
services he has rendered by the discovery of the remarkable rays
subsequently named after him„
1904 Ivan Petrovich Pavlov (Russia) "in recognition of his work on the
physiology of digestion, through which knowledge on vital aspects of the
subject has been transformed and enlarged"
1906 Camillo Golgi (Italy) and Santiago Ramón y Cajal (Spain) "in
recognition of their work on the structure of the nervous system"
1914 Robert Bárány (Vienna) "for his work on the physiology and pathology
of the vestibular apparatus"
1932 Sir Charles Scott Sherrington (Great Britain) and Edgar Douglas
Adrian (Great Britain) "for their discoveries regarding the functions of neurons"
1936 Sir Henry Hallett Dale (Great Britain) and Otto Loewi (Great Britain) "for
their discoveries relating to chemical transmission of nerve impulses"
1944 Joseph Erlanger (USA) Herbert Spencer Gasser (USA) "for their
discoveries relating to the highly differentiated functions of single nerve fibres"
1949 Walter Rudolf Hess "for his discovery of the functional organization of the
interbrain as a coordinator of the activities of the internal organs"
1949 Antonio Caetano de Abreu Freire Egas Moniz "for his discovery of the
therapeutic value of leucotomy in certain psychoses"
1952 Physics: Felix Bloch (USA) and Edward Mills Purcell (USA) "for their
development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and
discoveries in connection therewith"
1961 Georg von Békésy (USA/Hungary)"for his discoveries of the physical
mechanism of stimulation within the cochlea"
1962 Francis Harry Compton Crick (Great Britain), James Dewey Watson
(USA) and Maurice Hugh Frederick Wilkins (Great Britain) "for their
discoveries concerning the molecular structure of nucleic acids and its
significance for information transfer in living material"
1963 Sir John Carew Eccles (Australia), Alan Lloyd Hodgkin and Andrew
Fielding Huxley (Great Britain) "for their discoveries concerning the ionic
mechanisms involved in excitation and inhibition in the peripheral and
central portions of the nerve cell membrane"
1967 Ragnar Granit (Sweden/Finland), Haldan Keffer Hartline (USA) and
George Wald (USA) "for their discoveries concerning the primary
physiological and chemical visual processes in the eye"
1970 Sir Bernard Katz (Great Britain), Ulf von Euler (Sweden) and Julius
Axelrod (USA) "for their discoveries concerning the humoral transmittors in
the nerve terminals and the mechanism for their storage, release and
inactivation"
1973 Karl von Frisch (Germany), Konrad Lorenz (Austria) and Nikolaas Tinbergen
(Great Britain) "for their discoveries concerning organization and elicitation of
individual and social behaviour patterns"
1977 Roger Guillemin and Andrew Schally for their discoveries concerning "the
peptide hormone production of the brain
1979 Allan M Cormack and Godfrey Newbold Hounsfield for the "development of
computer assisted tomography„
1981 Roger W. Sperry, for his discoveries concerning "the functional specialization
of the cerebral hemispheres"
1981 David H. Hubel and Torsten N. Wiesel, for their discoveries concerning "visual
system".
1991 Erwin Neher (Germany) Bert Sakmann (Germany) "for their discoveries
concerning the function of single ion channels in cells"
1994 Alfred G. Gilman (USA) Martin Rodbell (USA) "for their discovery of Gproteins
and the role of these proteins in signal transduction in cells"
1997 Jens C. Skou (Denmark) "for the first discovery of an ion-transporting
enzyme, Na+, K+-ATPase"
2000Arvid Carlsson, Paul Greengard and Eric Kandel for their discoveries
concerning "signal transduction in the nervous system
2003 Paul C. Lauterbur Sir Peter Mansfield for their discoveries concerning
magnetic resonance imaging
2004 Richard Axel, Linda Buck for their discoveries of odorant receptors and the
organization of the olfactory systém
2013 James E. Rothman, Randy W. Schekman and Thomas C. Südhof "for their
discoveries of machinery regulating vesicle traffic, a major transport system in
our cells".
http://nobelprize.org/medicine/laureates/1981/
2014 John O'Keefe, May-Britt Moser, Edvard I. Moser. „For their discoveries of cells
that constitute a positioning system in the brain".
Neurofyziologie
Studium nervových a doprovodných bun• k,
zposobu jak jsou sestaveny do funk• ních celko,
které vedou, zpracovávají, ukládají informaci a
zprostYedkují chování.
Smyslová neurofyziologie
Pro• studovat smysly:
Vrátka do v• domí, kontakt s vn• jaím sv• tem.
Ur• ují chování.
Používají obecné molekulární principy
signalizace.
Kapitoly z neurofyziologie
smyslů – výběr kapitol
Fyziologie membrán:
- klidový potenciál
- ak•ní potenciál
- iontové kanály
- aíYení signálo a synapse
Fyziologie smyslo:
- obecné principy
- •ich a chue
- hmat a sluch
- zrak a další smysly
Psychofyziologie:
- zpracování zrakové informace
- u•ení a pam• e
http://www.physpharm.fmd.uwo.ca/undergrad/medsweb/
http://entochem.tamu.edu/index.html
http://web.neurobio.arizona.edu/gronenberg/nrsc581/index.html
http://www.biol.sc.edu/~vogt/courses/neuro/neurobehavior.html
http://instruct1.cit.cornell.edu/courses/bionb424/links.htm
http://nelson.beckman.uiuc.edu/courses/neuroethol/
http://www.blackwellpublishing.com/matthews/default.html
http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/neurophysiology/index.html
Internet a n• co z jeho neomezené
nabídky:
http://www.hhmi.org/biointeractive/click/index.html
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/neurobiology.html
http://sites.sinauer.com/neuroscience5e/chapter01.html
http://sites.sinauer.com/neuroscience5e/animations01.html
Materiály, prezentace, metody.
Fyziologie nervových membrán:
Ye• elektrických potenciálo
Předávání a zpracování informací:
elektro - chemická spolupráce
Vztah chemické a elektrické Ye• i.
BuHky pou~ívají k pYedávání informací chemickou Ye•, jsou to chemické povely, které
ur•ují vývoj, metabolismus bun• k. Parakrinní, endokrinní. Na v• taí vzdálenosti u
mnohobun• • ných ~ivo•icho musela existovat dobYe fungující cirkula•ní soustava. Co je
starší? PYedpokládáme, ~e neuroendokrinní. I v ~ivo•ichovi s dokonalou cirkulací je
dole~ité povely posílat pYesn• k cíli, ale hlavn• rychle ...
…a to je úkolem nervové soustavy, pYesn• ji Ye•eno bun• k se vzruaivou membránou
(nervové a svalové). Jinak se ovšem neurony v zásad• neliaí, vyu~ívají stejné
mechanismy signálních kaskád jako jiné buHky. Chemické látky na synapsí nebo i mimo
synapse mají mo~nost ovlivHovat metabolismus neurono. Náa mozek není jen
soustavou elektrických spojo. Je to houba nasáklá hormonální polévkou.
Neurony se tedy chovají jako jiné buHky – závislé metabolismem na chemické polévce
kolem. PYevád• jí ale n• které chemické povely na elektrické signály.
To, co je pro vzrušivé membrány typické, je schopnost generovat ak•ní potenciály, ale
k t• m se sahá a~ tehdy, kdy~ u~ není tYeba ~ádnou informaci zpracovávat a je tYeba ji
poslat velmi rychle na ur•ité místo. Ak•ní potenciál je velmi odolný vo•i ruaení a tedy
nezpracovatelný. To, co se vymyslí, se pak jen vhodí do e-poaty a u~ to nelze vzít zp• t –
dokud to nenarazí na dalaí pYepojovací centrum v podob• synaptických propojení.
Pro vzrušivé membrány se schopností rychlého a zacíleného vedení informací k tomu
pYistupuje Ye• elektrických potenciálo, místních (aíYících se s velkým úbytkem jen v míst•
vzniku) anebo ak• ních, aktivn• znovu a znovu generovaných.
Membránový (klidový) potenciál
Znakem toho, ~e je buHka ~ivá, je mimo jiné to, ~e lze na její membrán• - mezi extra a
intracelulárním prostYedím - zm• Yit rozdílnou koncentraci rozných kladných a záporných
ionto, projevující se elektrickým nap• tím, které nazýváme klidovým potenciálem. Ten
je vlastní vaem ~ivým buHkám a pro v• tainu z nich trvalý a nem• nný, ale u n• kterých
typo bun• k (nervové, svalové), s tzv. vzruaivou membránou, existuje schopnost tento
klidový potenciál velmi rychle m• nit.
Gibbs-Donnanova rovnováha
This is the behaviour of charged particles in solutions separated by a semipermeable
membrane, which doesn't allow some of the particles to pass.
The equilibrium that results is a balance between the electrostatic forces and the
osmotic forces affecting these ions.
Dosledkem pouhého uv• zn• ní negativn• nabitých velkých molekul v buHce, napY.
proteino, je malý negativní potenciál.
Pokud se jeat• rozjede Na/K pumpa, ustavuje se nová rovnováha, která je op• t
kompromisem mezi elektrickými a koncentra•ními silami. Negativní nap• tí intracelulárn•
bude mnohem v• taí.
Finální situace
Na/K ATP-áza nabíjí membránu
Ouabain –
Inhibitor Na/K pumpy
` ípový jed rostlinného povodu
PYi otrav• se koncentrace srovnají a nap• tí zmizí
K+:
Na+:
INTRA (-) EXTRA (+)
KONCENTRACE
NÁBOJ
Rozdílné postavení ionto
RT [ion]e
Eion = ------ ln ---------
zF [ion]i
[ion]e
Eion = 61mV log ---------
[ion]i
RT PK[K+]e + PNa[Na+]e + PCl[Cl-]i
Er = -- ln ---------------------------------
F PK[K+]i + PNa[Na+]i + PCl[Cl-]e
Rovnovážný potenciál – pro daný iont
Nernstova rovnice
Goldman-Hodgkin-Katz rovnice
R – plynová konstanta
T – teplota
F – Faradayova k.
Dosadíte-li do rovnice gradient, vyjde Vám rov. potenciál
Kdyby v buHce nebyly ~ádné jiné ionty nebo by je membrána nepropouat• la a naopak
kdyby byla ideáln• propustná pro uva~ovaný iont, byl by celkový klidový potenciál
membrány roven práv• spo•ítaným rovnová~ným potenciálom pro daný iont.
Zjistíme, že rovnovážný potenciál iontu, který je nejlépe propustný, je ur•ující pro
celkový potenciál membrány a ~e pYítomnost apatn• propustného iontu vnáaí do
systému nerovnováhu, která mo~e být vyu~ita pYi vyvolávání velmi rychlých zm• n pYi
vzniku ak•ních potenciálo.
V rovnici vystupují koncentrace a propustnosti jednotlivých ionto. Vyplývá z ní, ~e iont
má tím v• taí vliv na membránové nap• tí, •ím je jeho permeabilita v• taí. Vysv• tluje se
tak chování membrány (depolarizace a hyperpolarizace pYi zm• n• propustnosti pro
daný iont).
Klidové membránové nap• tí Er tedy le~í mezi rovnová~nými nap• tími vaech ionto,
pYi•em~ pYísp• vek ka~dého iontu je vá~en jeho koeficientem permeability.
Klidové nap• tí se pohybuje okolo -90mV, což je hodnota souhlasící s klidovými
potenciály pro dobYe propustné ionty K+ a Cl-. Protože ovšem i Na+ ionty mohou v malé
míYe procházet, je skute•né Er mírn• menaí. Zatímco u dobYe propustných ionto K+ nebo
Cl- se ustavuje bez problémo dynamická rovnováha s nulovým •istým tokem, pYítomnost
apatn• propustného Na+ (100x menší propustnost než pro K+) vae m• ní, proto~e pro n• j
se rovnovážný stav ustavuje mnohem pomaleji a vnáaí sem nerovnováhu: cht• l by
dovnitY, ale nemo~e.
Síla, která ~ene iont pYes membránu se jmenuje driving force nebo hnací síla (Yídící
nap• tí). Tato síla je ur• ena rozdílem mezi stávajícím membránovým nap• tím Em a
rovnová~ným nap• tím Eion pro daný typ iontu. NapYíklad vtok kalciových ionto do buHky
by se zastavil, a~ by uvnitYbuHky stouplo kladné nap• tí na hodnotu rovnová~ného
nap• tí pro kalcium, tedy +130mV. Proto~e je ale uvnitYbuHky -90mV, je Ca2+ hnáno
dovnitYbuHky silou 130+90=220mV. Ke vtoku ovaem nedojde, proto~e propustnost
membrány pro tyto ionty je nepatrná. Podobn• hnací síla pro Na+ je 157mV, zatímco pro
dobYe procházející K+ jen 4mV. } e existuje vobec n• jaká hnací síla pro K+ je dosledek
mírného posunu Er do kladných hodnot v dosledku existující propustnosti pro Na+.
Je jasné, ~e kdyby neexistoval n• jaký mechanismus, který by obnovoval nerovnom• rné
rozlo~ení apatn• procházejících ionto, po delaí dob• by se ustavila rovnováha i pro n• ,
ale existují mechanismy, které nerovnováhu udr~ují, ovaem za spotYeby energie,
nejdole~it• jaím je Na K pumpa.
Existence nerovnováhy pro má zásadní význam pro vznik podrá~d• ní a vyvolání
nervového signálu. PYedávání informací nervovou soustavou mo~e probíhat jen proto,
~e mezi vn• jakem a vnitYkem nervové buHky existuje rozdíl potenciální energie pro Na
ionty, na jeho~ udr~ování je ovaem potYeba iontovým pumpám neustále dodávat energii
ve form• ATP (u n• kterých bun• k pYipadá na NaK pumpu až 70% celkové energetické
spotYeby).
Hnací síla = Driving Force
-90mV – (Rovnovážný potenciál)
Na: 157 mV
K: 8 mV
Ca: 219 mV !
Jen 6 kationto vn• navíc na pozadí 440.000 ionto ostatních je schopno nabít
membránu. Sta•í tedy pYemístit jen nepatrná mno~ství a potenciál se výrazn• zm• ní.
Sherwood
Ionty odpov• dné za vznik membránového potenciálu le~í v tenké vrstv• u membrány.
Po•et kationto, který je schopen pYechodem membrány zm• nit nap• tí o 100mV je
pouze 1/100.000 celkového po•tu kationto v cytosolu.
⇒ Sta•í tedy malá a rychlá zm• na k AP.
⇒ Jeden AP koncentrace nezm• ní.
Klidový potenciál
 Ulo~ená energie pro Yadu membránových
•strojo• (spYa~ený transport) signálo (Ca
signály, fertilizace vají• ka).
 V neuronech na generování, zpracování a
aíYení elektrických signálo:
 Ak• ní potenciál – vhodný pro dálkový,
nezkreslený a rychlý pYenos signálo
 Místní potenciál – vhodný pro zpracování,
syntézu, modifikaci informací
Klidový potenciál
Ak• ní potenciál
50. léta
http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/neu
rophysiology/index.html
Jak se dnes m• Yí a jak vypadá?
Informace, kterou pYenáaí, je zapsána do frekvence.
⇒ Bu• nevznikne vobec, nebo vzniká stále stejn• velký.
⇒ Vznikne pYi ur•itém stupni depolarizace
The Nobel Prize in Physiology
or Medicine 1963
"for their discoveries concerning the ionic mechanisms
involved in excitation and inhibition in the peripheral and
central portions of the nerve cell membrane"
Sir John
Carew
Eccles
Alan Lloyd
Hodgkin
Andrew
Fielding
Huxley
1/3 of the
prize
1/3 of the
prize
1/3 of the
prize
Australia United
Kingdom
United
Kingdom
Australian
National
University
Canberra,
Australia
University of
Cambridge
Cambridge,
United
Kingdom
London
University
London,
United
Kingdomb. 1903
d. 1997
b. 1914
d. 1998
b. 1917
Iontová hypotéza
Vzniku AP
Hypotéza, zvaná iontová, vysv• tlující tyto d• je na membrán• nervových a svalových
bun• k byla rozpracována a dokázána anglickými v• dci pozd• jaími nositeli Nobelovy
ceny Alanem Hodgkinem a Andrewem Huxleym sou•asn• s K. Colem a H. Curtisem v
USA v povále•ných letech, kdy zna•n• pokro•ily mo~nosti elektrotechniky, zejména v
konstruování citlivých elektronických obvodo. Jimi vyvinutá technika nap• eového
zámku (voltage clamp) umo~Huje ovládat membránový potenciál a sou•asn•
registrovat proudy tekoucí pYes membránu v dosledku jeho experimentálních zm• n.
Ob• skupiny pracovaly na obYích nervových vláknech sépie a pou~ily dv• podélné
kovové elektrody, z nichž jedna po zavedení do axonu umo~Huje Yízení membránového
potenciálu a druhá snímá proudy tekoucí pYes membránu. Metoda je postavena tak, ~e
se m• Yí hodnota proudu, který je nutno na membránu dodávat, aby bylo udr~eno ur•ité
um• le nastavené membránové nap• tí. Dodávaný proud kompenzuje iontové toky a
jeho velikost je tedy s nimi shodná
Hodkgkin & Huxley
nap•eový zámek, 1963.
Dodávaný proud kompenzuje
iontové toky tak, aby nap•tí
zostalo konstantní. Proud
je registrován.
Voltage clamp
Blokátory kanálo
Na – TTX (Tetrodotoxin) – „ucpe“ ústí kanálu
K – TEA (Tetraethyl amonium)
• tverzubec Tetraodon - fugu
Pro Na platí, ~e nap• tí -60mV je jeat• podprahové a nevyvolá ~ádný proud ionto. Po
pYekro•ení prahu, který je asi -50mV, vyvolá nastavení -30mV prudký vtok Na ionto do
buHky, který ovaem nemá dlouhého trvání. Tato doba influxu se zkracuje s tím jak
sni~ujeme negativní nap• tí sm• rem k 0mV.
Nastavíme-li nap• tí na membrán• dokonce na +60mV Na tok ionto se obrátí, proto~e
jsme se dostali nad rovnovážné nap• tí pro Na.
Pro K ionty je charakteristické, ~e s klesajícím membránovým nap• tím roste intenzita
jejich výtoku z buHky ven mnohem pomaleji než pro Na, ale zato trvá mnohem delší
dobu.
Z takto stanovených iontových proudo pYes membránu byl sestaven • asový prob• h
propustnosti membrány pro oba ionty.
B• hem vzestupné fáze Na propustnost zna•n• pYevýaí draslíkovou. Propustnost
membrány pro Na je závislá na nap• tí a s klesajícím záporným nap• tím na membrán•
roste. Tím ovaem jeat• více podpoYí vtok Na ionto a dalaí depolarizaci. Díky této
pozitivní zp• tné vazb• je dosa~eno pYekmitu nap• tí velmi rychle.
DYíve, ne~ vaak membránový potenciál mo~e dosáhnout rovnovážného potenciálu
sodíku, za•ne posobit samozavírací inaktiva•ní mechanismus a propustnost membrány
pro Na za•ne samovoln• op• t prudce klesat. Tento mechanismus je rovn• ~ pozitivn•
závislý na hodnot• depolarizace a má proto charakter negativní zp• tné vazby. Navíc se
již díky rostoucí depolarizaci zvýšila i propustnost pro K, která je tedy také negativn•
zp• tnovazebná, proto~e tlumí aktivující stimul.
K uniká z buHky ven a tím vrací potenciál nitra buHky do záporných hodnot sm• rem k
rovnová~nému potenciálu draslíku. Membrána tedy pYeala od stavu pYeva~ující K
propustnosti pYes pYeva~ující Na propustnost op• t k povodnímu stavu.
Ak•ní potenciál kanály
Propagace, Voltage clamp
Až 100.000 AP bez Na/K pumpy.
RT [ion]e
Eion = ------ ln ---------
zF [ion]i
[ion]e
Eion = 61mV log ---------
[ion]i
RT PK[K+]e + PNa[Na+]e + PCl[Cl-]i
Er = -- ln ---------------------------------
F PK[K+]i + PNa[Na+]i + PCl[Cl-]e
Rovnovážný potenciál – pro daný iont
Nernstova r.
Goldman-Hodgkin-Katz r.
Až 100.000 AP bez Na/K pumpy.
Koncentrace b• hem jednoho AP
zostávají tém• Ystejné.
K •emu jeat• voltage clamp?
Kdy~ je potYeba zamezit zp• tnovazebným d• jom závislým na
nap• tí.
Problém: Otevírají se Na nebo zavírají K kanály?
Zamknutí membrány vyaachuje nap• eov• sensitivní kanály a iontové toky jsou
dosledkem jen mechanické
manipulace!
Výsledek:
Rozné proudy pYes membránu po pohybech
cilií u rozných hodnot •zamknutého•
nap• tí.
Z polarity toko: Není to ani K ani jen Na, jsou
to neselektivní toky kationto.
Aby mohla být Na propustnost op• t prudce zvýaena, musí být pYi repolarizaci znovu
dosa~eno ur•ité minimální záporné hodnoty, co~ vaak vy~aduje ur•itý •as. B• hem této
doby - refrakterní fáze, která následuje t• sn• po podrá~d• ní ( asi 1ms), nelze vyvolat
dalaí ak•ní potenciál. Frekvence AP je tudí~ omezená.
NaK pumpa pouze pYipravuje a udr~uje podmínky pro vznik AP, tedy nerovnováhu Na a
klidové nap• tí, ale pYesuny ionto pYi podrá~d• ní jsou tak malé, ~e zablokujeme-li pumpu
napY. ouabainem, teoreticky mo~e být vyvoláno a~ 105 AP ani~ by bylo potYeba obnovit
povodní stav.
Elektrická vodivost membrány je pYekvapiv• závislá na potenciálu, který je na
membránu aplikován. Navíc se ukázalo, že membránové vodivosti pro ionty draselné a
sodné jsou rozné a na sob• nezávislé. Kinetiku aktivace a dezaktivace popsali H+H
systémem nelineárních diferenciálních rovnic, vaeobecn• známých jako HH rovnice.
Kanály a patch clamp
Kanály – prostYedek udr~ování integrity buHky a komunikace
Ne-neurální Yízení:
Hlídají objem, osmolalitu, pH, klidové nap• tí -> transport, signalizaci (Ca)
Bun• • nými receptory buHky •vidí• své okolí.
NS •vidí• jen to, co zasáhne funkci kanálo.
Vrátkované kanály nejsou jen na nervových buHkách !
 Leukocyty, stejn• jako rakovinové buHky mají nap• eov• vrátkované
kanály
 Parametium – trepka
 Rostlinné buHky
Nevrátkované – ur•ují klidový potenciál
Vrátkované – pYijímají signály a Yídí místní i ak•ní
potenciály – pYíjem a zpracování informace NS
Kanály – prostYedek udr~ování integrity buHky a komunikace
Kanály – typy vrátkování
Ligandem Yízené:
Ionotropní
transdukce – receptor pYímo
na kanálu
Ligand se vá~e extracelulárn•
(transmitter-gated)
Metabotropní
transdukce
 Intracelulárn•
 Ion gated
 Nucleotide gated
 Fosforylací Yízený
Struktura –
Transmembránové proteiny
Rekonstrukce podle vlastností
X ray krystalografie – prostorový vzhled proteino tvoYících kanály
Proteinový krystal – obsahuje i 109 molekul a mo~e pYitom zostat funk• ní
X ray krystalografie - vzhled
4 domény, 6 segmento
 Citlivý na nap• tí
 Selektivní
 Schopný inaktivace
Na kanál
Citlivý na nap• tí
Selektivní
Polární vodný obal zabraHuje
proniku pYes membránu
K iont nemo~e být stabilizován
jako Na a tak neprojde filtrem.
Selektivita K+ kanálu Streptomyces
Negativn• nabité AK lákají kationty. Z cytosolu se pór otevírá do vestibulu. To
umo~Huje K iontom zostat hydratované i v polovin• membrány. V úzkém selektivním
filtru Yada O tvoYí Yadu do•asných vazebných míst pro dehydratovaný K. O atomy
sout• ~í s vodními molekulami o vazbu na K. K musí ztratit svoj vodní obal a místo s
vodou interaguje s O.
Selektivita K+ kanálu Streptomyces
Menaí sodík nevstupuje, proto~e karbonylové kyslíky jsou pYília daleko na to, aby se
kompenzovala energetická ztráta odhození vodního obalu.
Schopný inaktivace
Schopný inaktivace
Proteáza intracelulárn• zruaila inaktivaci – musí být intracelulárn•
Také K kanál je schopen inaktivace, ale pozd• ji ne~ Na.
TYi stavy Na kanálu
Refrakterní fáze kanálu – omezení frekvence AP
Kanál musí projít fází repolarizované membrány aby byl znovu aktivovatelný
Ne vždy je kanál pórem mezi 4mi doménami.
Cl kanál je dimer, kde ka~dá podjednotka má svoj pór. Jsou asymetrické a
dohromady tvoYí selektivní filtr.
The Nobel Prize in Physiology or
Medicine 1991
"for their discoveries concerning the function of single ion
channels in cells"
Erwin Neher Bert Sakmann
1/2 of the prize 1/2 of the prize
Federal Republic of
Germany
Federal Republic of
Germany
Max-Planck-Institut für
Biophysikalische
Chemie
Goettingen, Federal
Republic of Germany
Max-Planck-Institut für
medizinische Forschung
Heidelberg, Federal
Republic of Germany
b. 1944
b. 1942
Patch Clamp –
Technika, která „vidí“
kanály pYi práci
Neher & Sackman
Ter•íkový zámek, 1991
Tepelné vibrace membrány a vibrace
kanálu.
Záznam koresponduje s fázemi AP
Animace patch clamp
Pravd• podobnostní d• j
Roderick MacKinnon, M.D., a visiting researcher at the U.S. Department of Energy's
Brookhaven National Laboratory, is a recipient of the 2003 Nobel Prize in Chemistry
'for structural and mechanistic studies of ion channels.‚
His research explains "how a class of proteins helps to generate nerve impulses – the
electrical activity that underlies all movement, sensation, and perhaps even thought.
The work leading to the prize was done primarily at the Cornell High Energy
Synchrotron Source [CHESS] and the National Synchrotron Light Source [NSLS] at
Brookhaven.
The proteins, called ion channels, are tiny pores that stud the surface of all of our
cells. These channels allow the passage of potassium, calcium, sodium, and chloride
molecules called ions. Rapid-fire opening and closing of these channels releases ions,
moving electrical impulses from the brain in a wave to their destination in the body."1
"Potassium channels act as both gateways and gatekeepers on cell membranes,
controlling the flow of ions and enabling brains to think, muscles to move, and hearts
to beat. Malfunctioning ion channels contribute to epilepsy, arrhythmia, and other
diseases."2
Roderick
MacKinnon and
Ion Channels
The Nobel Prize in Chemistry 2003
"for discoveries concerning channels in cell membranes"
"for the discovery of water
channels"
"for structural and mechanistic
studies of ion channels"
Peter Agre Roderick MacKinnon
1/2 of the prize 1/2 of the prize
USA USA
Johns Hopkins University
School of Medicine
Baltimore, MD, USA
Rockefeller University
New York, NY, USA; Howard
Hughes Medical Institute
b. 1949 b. 1956
Kanály a metody
mol. genetiky
Vápníková komunikace a Ca kanály
Calcium ions generate versatile intracellular signals that determine
a large variety of functions in virtually every cell type in biological
organisms (Berridge et al., 2000), including the control of
heart muscle cell contraction (e.g., Dulhunty, 2006) as well as the
regulation of vital aspects of the entire cell cycle, from cell proliferation
to cell death (Lu and Means, 1993; Orrenius et al., 2003).
In the nervous system, calcium ions preserve and, perhaps, even
extend their high degree of versatility because of the complex
morphology of neurons. In presynaptic terminals, calcium influx
triggers exocytosis of neurotransmitter-containing synaptic vesicles
(for review, see Neher and Sakaba, 2008). Postsynaptically,
a transient rise of the calcium level in dendritic spines is essential
for the induction of activity-dependent synaptic plasticity
(Zucker, 1999). In another cellular subcompartment, the nucleus,
calcium signals can regulate gene transcription (Lyons and
West, 2011). Importantly, intracellular calcium signals regulate
processes that operate over a wide time range, from neurotransmitter
release at the microsecond scale to gene transcription,
which lasts for minutes and hours (Berridge et al., 2003). Thus,
the time course, the amplitude, and, most notably, the local
action site in well-defined cellular subcompartments are essential
determinants for the function of intracellular calcium signals.
Neuron 73, March 8, 2012 ª2012 Elsevier Inc.
Ca metabolismus a vápníková komunikace, kanály
Vápníková signalizave in vivo
• asné geny spuat• né aktivitou neurono
Ca aktivita
Neurono
Fluorescen•ní
stanovení Ca
Ca v myokardu a jeho podíl
na tvaru AP
Ca v myokardu a jeho podíl
na tvaru AP
Jak m• Yit zm• ny intracelulárního vápníku
Intracelulární vápník je jakousi centrální veli•inou, na které závisí tém• Yvaechny bun• •né
regula•ní mechanizmy. Volného intracelulárního vápníku je v buHkách nepatrn• , a proto
sta•í pYidat (nebo ubrat) jen mizivé mno~ství, aby to vyvolalo okam~ité a hluboké zm• ny v
jeho koncentraci. O tom se v• d• lo ji~ dávno. Problém byl vaak v tom, ~e experimentální
sledování zm• n tak nízkých vápníkových koncentrací není zrovna jednoduché. V 80. letech
vyvinul Robert Tsien fluorescentní látky, zejména fura-2 a fluo-3, které m• ní své optické
vlastnosti v závislosti na pYítomnosti i nepatrných mno~ství vápníku. Nové látky pYinesly
pokrok ve dvou sm• rech. Zaprvé je není tYeba do bun• k slo~it• vpravovat. PYed pou~itím se
esterifikují, což jim dodá schopnost snadno prostupovat lipoidními membránami. Jakmile se
takto dostanou do buHky, vrhnou se na n• intracelulární esterázy, látka je hydrolyzována a
tím ztratí svoji lipofilní vlastnost. Zostane tedy uv• zn• na v buHce jako v kleci. Ta druhá
výhoda spo•ívá v tom, ~e jejich fluorescence je mnohonásobn• vyaaí, ne~ byla fluorescence
ekvorinu, tak~e pro úsp• aný pokus sta•í, aby byly v buHkách pYítomny v celkem rozumných
koncentracích. Prakticky probíhá sledování hladiny intracelulárního vápníku tak, že po
inkubaci s n• kterým z výae uvedených optických indikátoro jsou buHky umíst• ny pod
speciáln• upravený mikroskop, kde jsou stYídav• osv• tlovány dv• ma vlnovými délkami. Na
ob• vlnové délky odpovídá indikátor fluorescencí (s maximem obvykle kolem 540 nm). Vtip
je v tom, že na jednu vlnovou délku (v• tainou kolem 340 nm, zále~í na typu fluorescen•ní
látky) odpovídá hlavn• ta •ást látky, která vytvoYila s intracelulárním vápníkem komplex, pYi
druhé (obvykle 380 nm) odpoví zbytek, tedy ta •ást, která zostala volná. Zm• ny hladiny
vápníku poruaí rovnová~ný stav mezi látkou, která vytvoYila s vápníkem komplex, a tou,
která zostala volná, a tím se také m• ní m• Yená fluorescence. Tato metoda dnes umo~Huje
sledování zm• n vápníku b• hem rozných experimentálních postupo.
Kanály citlivé na jedy a anestetika
 Eter používán jako celkové anestetikum
(1846), nahrazen chloroformem,
(toxicita), N2O,
 Lidokain, Xylokain – lokální anestetikum,
blokuje Na kanály a brání vzniku AP
Iontové kanály a rakovinné metastázy
Rakovinné buHky projevující velkou schopnost metastázovat obsahují
v membránách zna•ný po•et sodíkových kanálo (Na+) Yízených nap• tím. Jestli~e
jsou sodíkové kanály zapojeny pYímo do metastázové kaskády, pak by po jejich
blokád• m• la schopnost vytváYet metastázy klesnout. Kdy~ se metastázujícím
nádorovým buHkám prostaty zablokují sodíkové kanály tetrodotoxinem, pohyblivost
bun• k klesne a také pYestanou vysílat výb• ~ky.
Druhou vlastností metastázujících bun• k je, ~e se na své cest• k novým místom
osídlení •probourávají• tkán• mi pomocí proteolytických enzymo. Vylu• ování enzymo
i jiných látek je v buHce •asto spojeno s depolarizací, vyvolanou otevYením
nap• eov• citlivých sodíkových a vápníkových kanálo. Tak se vylu• ují napYíklad
neurotransmitery v mozku i na periferii a zYejm• i n• které enzymy, které rakovinným
buHkám otevírají cestu k tvorb• metastáz. A práv• tetrodotoxin pomohl prokázat, ~e
u jednoho typu prostatických nádorových bun• k klesá vylu•ování exocyto po
zablokování sodíkových kanálo.
Zpomalí anestetika zhoubné bujení?
František Vysko•il
Publikováno: Vesmír 79, 312, 2000/6
V lidském genomu je n• kolik tisíc geno kódujících iontové kanály. PYes 150 jich
kóduje nap• eov• citlivé kanály.