PCR





Složení PCR reakce:

destilovaná voda                15,5 ul

10x PCR pufr                       2,5 ul

10mM směs dNTP                  1 ul

20uM forward primer              2 ul

20uM reverse primer               2 ul

100 ng plazmidové DNA         1 ul

Taq polymeráza (5U/ul)          1 ul

celkem                                    25 ul

Průběh PCR reakce:


1. 94^OC – 2 minuty

2. 94^OC – 30 s

3. 55^OC – 30 s

4. 72^OC – 30 s

5. bod 2-4 opakuj 30x

6. 72^OC – 7 minut

7. 10^OC – 1 minuta



Při pipetování PCR směsi se obvykle postupuje tak, že nejprve se zhotoví směs všech složek (mimo
plazmidové DNA) spočítaná pro všechny vzorky + negativní kontrolu (PCR reakce bez plazmidové DNA)
+1, přičemž jednotlivé složky se pipetují ve výše uvedeném pořadí. Jednotlivé vzorky plazmidové DNA
se napipetují do 0,5ml zkumavek a přidá se k nim odpovídající množství PCR směsi. Zkumavky s PCR
směsí se poté umístí do termocykléru a spustí se daný program.



Pozn. Taq polymerázu a dNTP je třeba při pipetování uchovávat na ledu.