Základy molekulární biologie Cvičení 4 Polymerázová řetězová reakce Transformace POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (POLYMERASE CHAIN REACTION) PCR •PCR umožňuje získat specifickou DNA sekvenci ve velkém množství •1983 Kary Mullis (1993 objev PCR oceněn Nobelovou cenou za chemii) •Metoda pro mnohonásobné zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace DNA (enzymatické syntézy) • •Replikace DNA in vivo vyžaduje mnoho enzymů •Replikace DNA in vitro vyžaduje pouze jeden enzym • http://loffit.abc.es/wp-content/uploads/2014/12/loffit-kary-mullis-04.jpg PCR • •cyklus: 1.Denaturace 2.Nasednutí primerů 3.Syntéza DNA PCR • pcr_0 PCR – Enzymatická syntéza •Jako templát slouží ssDNA, podle níž je syntetizován komplementární řetězec (PCR produkt - amplikon). Jako templáty pro syntézu mohou sloužit oba řetězce dsDNA, po předchozí denaturaci. •K zahájení reakce je zapotřebí primer, který se připojuje na komplementární úseky DNA (templát) •Primery - vymezí úsek DNA, který bude amplifikován • - poskytnou volné 3'-OH-konce k zahájení polymerace •K enzymatické syntéze PCR produktu dochází po připojení dvou primerů vázajících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3'-OH-konce směřují proti sobě. •Amplifikace DNA probíhá exponenciálně •PCR probíhá v zařízení zvaném termocykler, které je zkonstruováno tak, aby dokázalo během několika sekund zvýšit nebo snížit teplotu o několik desítek stupňů Celsia PCR – Složení reakční směsi •1. Templátová nukleová kyselina (DNA). •Množství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké: obvykle postačuje méně než 1 mg genomové DNA, • •Kvalita templátu ovlivňuje výsledek PCR. •znečištěný templát může obsahovat inhibitory PCR •Zdroj: mikroorganizmy, buňky z tkáňových kultur, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stěry, vlasy, atd… • •2. Primery. Syntetické oligonukleotidy o velikost 18 – 25 nt. •3. dNTP ve formě Na+ nebo Li+ solí •4. Mg2+ ionty tvoří rozpustný komplex s dNTP a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymeráza. •5. Termostabilní DNA polymeráza, která odolává teplotám až 98 °C. •Taq Thermus aquaticus (5`-exonukleáza) •Tth Thermus thermophilus (5`-exonukleáza) delší úseky •Pwo Pyrococcus woesei (3`-exonukleáza) PCR - Podmínky standardní PCR reakce 1.Počáteční denaturace DNA. Důležitá je kompletní denaturace templátu, obvykle postačuje zahřátí směsi na 2 – 5 min / 95 °C. V případě, že dojde pouze k částečné denaturaci, molekuly DNA velice rychle renaturují a to vede k nespecifické vazbě primerů a možným falešným výsledkům. 2.Denaturační krok (oddělení řetězců):94 – 95 °C / 20 – 45 s. Nedostatečně denaturovaná DNA neumožňuje přístup primerům, naopak příliš dlouhá denaturace snižuje aktivitu DNA polymerázy (~ 2 hod / 98 °C). 3.Připojení primerů (55 - 65 °C / 30 – 90 s) teplota určuje specifičnost a závisí na Tm primeru a templátu. Ta se optimalizuje v teplotním gradientu. 4.Prodlužování primeru (syntéza PCR produktu) probíhá při 72 °C /45 – 90 s. Taq DNA polymeráza syntetizuje DNA při této teplotě rychlostí cca 60 bází/s. Nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus. • • PCR se provádí se v termocyklerech, v 25 - 35 cyklech. • •5. Závěrečná extenze se provádí obvykle po posledním cyklu (72°C / 5 min) a slouží k dokončení syntézy a renaturaci jednořetězcových produktů Proces amplifikace podminky PCR •Pokud by na začátku byla ve vzorku pouze jediná molekula DNA, po 32 cyklech teoreticky dostaneme až 1 miliardu nasyntetizovaných molekul DNA Optimalizace složek PCR •DNA - pro standardní PCR se doporučuje následující množství DNA podle velikosti templátu: •lidská genomová DNA: 100 - 500 ng •bakteriální DNA: 1 – 10 ng •plazmidová DNA: 0,1 – 1 ng • • •Primery - sekvence a koncentrace primeru významně ovlivňuje výsledek PCR • •Optimální koncentrace je mezi 0,1 a 0,6 mM. •Nižší koncentrace vede k předčasnému vyčerpání primerů a snížení výtěžku. • • •dNTP - výsledná koncentrace se může pohybovat v rozmezí 50 – 500 mM (pro každý nukleotid) •Nejběžnější koncentrace dNTP je 200 mM. Při zvýšení koncentrace dNTP je třeba zvýšit koncentraci Mg2+ iontů. Optimalizace koncentrace MgCl2 v PCR reakci • Volné Mg2+ ionty ovlivňují aktivitu enzymu a zvyšují hodnotu Tm u dsDNA. •Pro dosažení nejlepšího výsledku vždy stanovujeme koncentraci Mg2+ experimentálně. •Optimální koncentrace může kolísat od 1 mM do 5 mM. •Nejčastěji používaná koncentrace je 1,5 mM (pro 200 mM dNTP). Optimalizace podmínek PCR reakce •DNA polymeráza •Obvyklá koncentrace je 0,5 – 2,5 jednotek / 50 ml. •pH •je dané reakčním pufrem, obvykle odpovídá pH 8,3 - 9,0. • Příklad složení pufru pro PCR: 10 mM Tris; pH 8.3 • 50 mM KCl • 1,5 mM MgCl2 •Přídatné látky mohou v některých případech ovlivnit účinnost a specifičnost PCR reakce. Jejich vliv se obvykle určuje experimentálně: •albumin z bovinního séra (BSA) (100 ng/50 µl) •dimetylsulfoxid (DMSO) (2- 10 % v/v) – redukce nespecifické vazby primeru •detergenty (Triton X-100, Tween 20) •Minerální olej – zabraňuje vypařování během reakce Optimalizace teploty •Teplota pro připojení primeru (annealing temperature) - zkr. Ta •Teplota používaná pro teplotní hybridizaci molekul primeru a matricové DNA in vitro. • •Orientačně lze vypočítat Ta podle vztahu: • Ta = 2(AT) + 4(GC) – 5 °C = Tm – 5 °C • •(AT je počet AT-párů a GC je počet GC-párů v sekvenci) • • Ta = 0.3 x(Tm of primer) + 0.7 x(Tm of product) - 25 Návrh primerů • •Netvoří sekundární struktury •Nejsou komplementární navzájem •Nemají více vazebných míst na DNA • •http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ Chybovost PCR •Taq polymeráza – chyba s frekvencí 2×10-4 • •problém při klonování DNA → mutace •buňka má opravné mechanismy •In vitro - použití dvojice DNA polymeráz, z nichž jedna má schopnost proofreading Multiplex PCR (mnohonásobná PCR) • stanovení několika mikroorganismů v jediné reakci Při použití více párů specifických primerů, dochází k amplifikaci více cílových sekvencí v jedné reakci. Využití metod PCR •Základní výzkum •izolace genů nebo jejich částí, sekvencování DNA, mutageneze in vitro, modifikace konců DNA, analýza (selekce) klonů z genových knihoven, příprava značených sond • •Aplikovaný genetický výzkum •prenatální diagnostika (dědičných chorob), detekce mutací v genech, studium polymorfizmu genů, populační genetika • •Využití v klinických disciplinách •detekce patogenních mikroorganizmů (baktérií, virů, prvoků, hub), identifikace onkogenů, typizace nádorů, stanovení pohlaví • •Využití v praxi •Archeologie, soudnictví, kriminalistika, potravinářství •