http://www.ibp.cz/labs/LC/
ODDĚLENÍ CYTOKINETIKY
BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV, AV ČR, v.v.i.
Vedoucí: prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc.
Prof. RNDr. Jiřina Hofmanová, CSc.
(Buněčná a molekulární fyziologie lipidů)
Mgr. Karel Souček, Ph.D.
(Růstové faktory v signálování nádorových buněk)
Doc. Jan Vondráček, Ph.D.
(Buněčná a molekulární toxikologie)
je zaměřen zejména na přenos buněčných signálů a
patofyziologické změny vztahující se
k nádorovým onemocněním (zejména kolonu a prostaty)
v kontextu mechanismů působení:
►lipidových složek výživy (esenciální vysoce nenasycené mastné
kyseliny - VNMK, butyrát z vlákniny)
► endogenních regulátorů růstu, diferenciace a apoptózy (rodina
tumor necrosis factor – TNF, tumor growth factor beta (TGFβ)
► environmentálních chemických org. látek (PAH, PCB, dioxiny)
► vybraných protinádorových léčiv (deriváty platiny)
http://www.ibp.cz/cs/oddeleni/cytokinetika/informace-o-oddeleni
VÝZKUM
ODBORNÉ ZAMĚŘENÍ
► Lipidové složky výživy v regulaci cytokinetiky
(polynenasycené esenciální mastné kyseliny (VNMK),
MK s krátkým řetězcem – butyrát) – J. Hofmanová, N. Straková
► Interakce lipidů a cytokinů
(rodina tumor necrosis factors-TNF - cytokin TRAIL,
mechanismy buněčné smrti)
A. Hyršlová Vaculová, J. Hofmanová
► Mechanismy účinků protinádorových léčiv (deriváty
platiny, regulace buněčného cyklu a buněčné smrti)
A. Hyršlová Vaculová
► Růstové regulátory v signalizaci nádorových buněk - K. Souček
(Tumor growth factor -TGF beta, úloha nádorového
mikroprostředí, epiteliálně mesenchymální přechod,
nádorové kmenové buňky)
► Mechanismy toxicity organických látek
(PAH, PCB) – J. Vondráček
Cell membrane
Jsou zkoumány
► procesy vedoucí ke změnám regulace
buněčné kinetiky (proliferace, diferenciace,
apoptózy) – složky přenosu buněčných signálů
(spec.membr.receptory- DR, kinázy – PI3K/Akt, ERK,
vnitrobun. receptory a tr. faktory – PPAR, AhR, AR, ER)
► důsledky interakce vybraných faktorů
● VNMK x butyrát, TRAIL
● TRAIL x Pt cytostatika
● PAH, PCB x TNF, MK
► rozdíly v odpovědi nádorových a
nenádorových buněčných populací
PARP
β -actin
buněčný cyklus
apoptóza
POPULACE NORMÁLNÍCH
(NETRANSFORMOVANÝCH)
BUNĚK
ONKOGENEZE
FÁZE:
INICIAČNÍ
(INITIATION)
PODPŮRNÁ
(PROMOTION)
„cell signalling“
cytokiny a růstové
modulátory vs. lipidy
klinická data,
matematické analýzy,
experimentální ověření
ONKOTERAPIE
PROGRESIVNÍ
FÁZE
(PROGRESSION)
POPULACE
TRANSFORMOVANÝCH
BUNĚK
VÝZKUMNÉ CÍLE A OBLASTI PRAKTICKÉHO VYUŽITÍ
ZÁKLADNÍ STRATEGIE
LIDSKÉ BUNĚČNÉ LINIE (in vitro)
 epiteliální buňky tlustého střeva (kolonu)
 buňky prostaty
 jaterní buňky
Myší modely
Metody oddělení cytokinetiky BFÚ AV ČR
● Speciální kultivace buněčných linií (in vitro metody)
● FACS - průtoková cytometrie (FACSCalibur BD, FACSVerse,
vysokorychlostní sorter FACS Aria Sorp II) – víceparametrické
analýzy, sortování
● Mikroskopie – fluorescenční, konfokální (Leica, Olympus)
● Fluorimetrie a kolorimetrie (FluoStar nebo Elisa reader)
● Polyakrylamidová a agarosová elektroforéza, western
blotting atd.
● RT-PCR - reverse transcription polymerase chain reaction,
reportérové vektory
● Buněčné transfekce, siRNA, overexpresní studie
● Experimentální zvířata (in vivo metody, in vivo imaging,
„knock out“ zvířata)
Široká škála metod pro detekci proliferace,
diferenciace a buněčné smrti (apoptóza, autofagie)
Používané metody
 Metody buněčné a molekulární biologie,
biochemie a analytické cytometrie
 Speciální kultivace buněčných linií
 Průtoková cytometrie (víceparametrové analýzy)
 Fluorescenční, konfokální mikroskopie
 Elektroforéza, western bloting
 Buněčné transfekce, siRNA, overexpresní studie
 Biochemické testy
 PCR, reportérové vektory…
 a mnohé další….
Hyršlová Vaculová A., 2015
FACSCalibur
Metoda průtokové cytometrie
Specifická barviva - intenzita fluorescence
Parametry odrážející chování buněčných populací
Fáze buněčného cyklu Exprese CD povrchových antigenů
Exprese a produkce vnitrobun. molekul
FACS ARIA SORP II
FACSCalibur
KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP LEICA
Metodologie využívají nejmodernější zařízení
Založení České společnosti pro analytickou cytometrii (ČSAC) v r. 2000
CÍL: propojení výzkumu, kliniky a praxe a napojení na mezinárodní aktivity
(Int. Soc. Analytical Cytometry, European Cytometry Network)
Konference s mezinárodní účastí: 2001, 2003, 2005, 2007, 2009, 2011, 2013
KONFERENCE s mezinárodní účastí
Analytická cytometrie VIII,
Olomouc 3. – 6. 10. 2015
http://www.csac.cz/
Oddělení živočišné fyziologie a imunologie
Ústav experimentální biologie, PřF MU
Výzkum, výuka, vědecká výchova
V ČR:
LF UP Olomouc, Výzkumný ústav veterinárního lékařství Brno, LF
MU Brno, ICRC, ÚEM Praha
V zahraničí:
- Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden
- Fac of Medicine, Univ. of Debrecen, Hungary,
- Inst. of Mol. Biol. and Ecology Fac. of Sci. Safarik Univ., Košice,
SR
- Johannes Gutenberg University, Mainz, Germany
- University of Wien
- University of Kentucky, USA
SPOLUPRÁCE
Výuka a vědecká výchova
na odd. cytokinetiky BFÚ
PřF MU PŘEDNÁŠKY a CVIČENÍ:
● Speciální metody fyziologie živočichů Bi5611c (2.r.)
● Moderní metody buněčné biologie Bi6725 (3.r.)
4.r.
● Fyziologie buněčných systémů Bi7070
● Genotoxicita a karcinogeneze Bi8110
● Zdravotní rizika Bi6871
● Molekulární fyziologie živočichů Bi6051
● Mechanismy buněčné smrti Bi8870
● Analytická cytometrie Bi9393
● Fyziologie působení farmak a toxických látek
TÉMATA BAKALÁŘSKÝCH, DIPLOMOVÝCH a DISERTAČNÍCH PRACÍ
Bakaláři: 2
Diplomanti: 9
Doktorandi: 8
Členství v oborových radách a komisích pro státní zkoušky a obhajoby (Mgr, RNDr, PhD)
LF UP Olomouc:
Vzdělávání doktorandů – kurzy a stáže
Buněčná a molekulární fyziologie lipidů
LIPIDY A JEJICH INTERAKCE V MECHANISMECH
ROZVOJE NÁDORŮ
Prof. RNDr. Jiřina Hofmanová CSc.
Oddělení cytokinetiky BFÚ AV ČR, v.v.i, Brno
Oddělení fyziologie a imunologie živočichů
ÚEB, Přírodovědecká fakulta MU Brno
hofmanova@ibp.cz
Anand P. et al., Pharmaceutical Research 2008
Vznik a rozvoj nádorů
genetické faktory + faktory vnějšího prostředí
Bioaktivní složky potravy
ovlivňují genetické a epigenetické děje
spojené se vznikem různých patologických procesů
Trujillo E., J Amer Diet Assoc., 106, 2006
??Podíl výživy stále diskutován???
Mnohostupňový proces karcinogeneze
INICIACE PROMOCE PROGRESE
MUTAGENY
RADIACE
VIRUSY….
GENOTOXICITA
NEGENOTOXICKÉ
KARCINOGENY
PRENEOPLASTICKÉ
ZMĚNY
INICIOVANÁ
BUŇKA
NORMÁLNÍ
BUŇKA
MALIGNÍ
NÁDOR
METASTÁZY
AKTIVACE PROTO-ONKOGENŮ
INAKTIVACE NÁDOROVĚ SUPRESOR. GENŮ
INAKTIVACE ANTIMETASTAT. GENŮ
GENOTOXICKÉ
+NEGENOTOXICKÉ
FAKTORY
DIETA
Zvýšený přísun kalorií (vysoký obsah tuků)
vs. snížený výdej
Nerovnováha (lipidového) metabolismu
Inzulinová rezistence
Diabetes
Lipidové složky výživy
Vznik kardiovaskulárních a
nádorových onemocnění
Orešič M. et al. Trends in Biotechnology 2008
Různá biologická úloha lipidů
TUKY (lipidy) NEJSOU POUZE ZDROJ ENERGIE !!!
Strukturální a regulační úloha s významným dopadem na
fyziologické funkce organismu
Úloha v patofyziologii - nádory
Aktivita proteinů
(přenašečů, receptorů)
Mediátory a modulátory
vnitrobun. signalizační sítě
Metabolická rovnováha
Zásobárna
energie
ODPOVĚĎ a
CHOVÁNÍ BUNĚK
rostl.oleje
rybí oleje
plankton, řasy)
dlouhé C řeztězce a 2 i více dvojných vazeb – savčí organismus je nedovede syntetizovat,
jsou přijímány s potravou podobně jako vitamíny
ESENCIÁLNÍ VYSOCE NENASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY (VNMK)
Řada n-6 a n-3
důležitý
poměr
v záp dietě
až 20:1
(1:1)
Ve všech stádiích rozvoje
uplatnění
bioaktivních složek výživy
stimulace či zástava progrese
Tammarielo AE and Milner JA J Nutr Biochem 21:77, 2010
Rozvoj nádorů kolonu
Multifaktoriální a komplexní etiologie
Genetické i epigenetické změny, životní styl, výživa
Epidemiologické, experimentální a dnes již i klinické studie
prokazují protektivní úlohu n-3 VNMK (plankton, rybí
olej) a
mastné kyseliny s krátkým řetězcem
BUTYRÁTU z vlákniny
V ZÁNĚTU I KARCINOGENEZI KOLONU
Psyllium
Přechod adenom x karcinom
fetální colon
FHC
adenom
AA/C1
RG/C2
adenocarcinom
HT-29
HCT-116
SW480
lymf.
metastáza
SW-620
Buněčné línie
Účinky VNMK a butyrátu
normální epitel
NCM460
Mikrobiální fermentace
vlákniny ve střevě
NEDOSTATEČNĚ JSOU STÁLE OBJASNĚNY
► MECHANISMY ÚČINKŮ SAMOTNÝCH MK
► JEJICH VZÁJEMNÁ SOUČINNOST
► INTERAKCE S ENDOGENNÍMI REGULÁTORY
BUNĚČNÉHO RŮSTU, DIFERENCIACE A SMRTI
C
N
FA
FA-CoA
FAT/CD36
AA (50μM)
Rostl. oleje
NaBt (3mM)
vláknina
DHA
Rybí oleje
DETEKOVANÉ PARAMETRY
(různý stupeň bun. organizace)
PLASMATICKÁ MEMBRÁNA
Struktura lipidů (lipid packing)
Transportní proteiny
průtoková cytometrie - FCM
Analýzy buněčných lipidů
Fosfolipidy, neutrální lipidy (LC-MS-MS)
Složení MK (GC-MS)
CYTOPLASMA
Akumulace lipidů (lipid droplets, FCM)
Produkce ROS – FCM
MITOCHONDRIE
Mit. membránový potenciál – FCM
Exprese apoptických proteinů (Western blot)
JÁDRO
Transkripční faktory, genová exprese (PCR)
PPRE
PPARs
Jádro
Proliferace Diferenciace Apoptóza
Plasmatická
membrána
Cytoplasma
Endogenní regulátory
TRAIL, TNFα,
anti-Fas
Receptory smrti
DR4, DR5
CD95
Mitochondrie
Lipid
droplets
Předpokládané mechanismy společného účinku PUFAs a butyrátu
(interakce s TRAIL)
TRAIL (DRs)
Na modelech buněk kolonu jsme prokázali
► příznivé účinky kombinace VNMK a butyrátu
u modelových buněk nádorů kolonu (antiproliferační a apoptické
působení, vč. některých mechanismů)
Hofmanová J. et al, Eur J Nutr 2005
Hofmanová J. et al. Mol Nutr Food Res 2009
► posílení účinků endogenních regulátorů apoptózy (cytokinů z rodiny TNF
indukujících apoptózu) a překonání rezistence působením mastných
kyselin (VNMK i butyrát)
Kovaříková M. et al. Eur J Cancer 2000
Kovaříková M. et al., Differentiation 2004
Hofmanová J. et al., Cancer Letters 2005
Vaculová A. et al, Cancer Letters 2005
Hofmanová J. et al. Oncology Reports 2008
Hýžďalová M. et al. Cytokine 2008
► významnou úlohu buněčných lipidů v těchto účincích
Hofmanová J. et al. J Nutr Biochem 2011
Nově: interakce VNMK a butyrátu s metabolismem a toxicitou
škodlivých látek životního prostředí
Mastné kyseliny zvyšují citlivost nádorových buněk kolonu
k apoptóze indukované cytokiny rodiny TNF
DHA selektivně posiluje apoptózu
indukovanou cytokinem TRAIL
(TNF-related apoptosis-inducing ligand)
Butyrát posiluje apoptózu indukovanou
cytokinem TNFα nebo TRAIL
FACSCalibur
Metoda průtokové cytometrie
Specifická barviva - intenzita fluorescence
Parametry odrážející chování buněčných populací
Fáze buněčného cyklu Exprese CD povrchových antigenů
Exprese a produkce vnitrobun. molekul
r. 1997
ME Surette, CMAJ 2008
DHA ???
● Rozdíly ve složení a metabolismu lipidů během vývoje nádoru (indikátor rizika)
● Odlišné změny lipidů po působení mastných kyselin
LIPIDOMIKA
●Rozdíly v citlivosti k fyziologickým regulátorům
● Rozdíly v odpovědi na terapii
Bougnoux P. et al, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2006
Lipidové rafty
LIPIDOMICKÉ ANALÝZY
(spolupráce s VÚVeL)
1) změny obsahu jednotlivých typů MK v celkových buněčných lipide
GC-MS
2) změny obsahu AA, resp. DHA v jednotlivých skupinách fosfolipid
PC, PS, PI, PE, SM a v neutrálních lipidech
LC-MS-MS
po působení AA, DHA, NaBt a kombinací AA/NaBt, DHA/NaBt)
u buněk FHC a HCT-116
O P
O
O
H2C
CH
H2C
OCR1
O O C
O
R2
OH
H
OH
H
H
OHH
OH
H
O
H OH
phosphatidyl-
inositol
AA
O P
O
O
H2C
CH
H2C
OCR1
O O C
O
R2
OH
H
OH
H
H
OHH
OH
H
O
H OH
phosphatidyl-
inositol
DHA
Srovnání lipidových profilů
linií z lidského kolonu
různého stupně nádorové
transformace
(„lipid fingerprint“)
KLINICKÉ VZORKY
Analýza epiteliálních buněk
izolovaných z nádoru a normální
tkáně kolonu u pacientů
(chirurgie FN Bohunice,
FN Olomouc)
Hledání lipidových markerů
(diagnostika, terapie)
ROZVOJ LIPIDOMIKY
Analytické metody
LC-MS-MS (lipidy)
GC-MS (mastné kyseliny)
Praktické aspekty poznatků
o působení mastných kyselin
Nejedná se o farmaka, součást stravy, poměrně vysoké dávky (0,5-2g)
VYUŽITÍ :
DIETETICKÁ DOPORUČENÍ
Zdraví a prevence chorob
Středomořská dieta
Funkční potraviny
Potraviny pro zvláštní lékařské účely
TERAPEUTICKÉ VYUŽITÍ – nutriční farmakologie
Imunomodulace, antikachektické účinky, kombinovaná terapie,
adjuvantní terapie, „disease specific nutrition“, nosiče léků
PARENTERÁLNÍ
A ENTERÁLNÍ VÝŽIVA
optimalizace složení
lipidových emulzí
Regulace smrti nádorových buněk
tlustého střeva a prostaty,
kombinovaná terapie jako účinná
strategie pro eliminaci nádorových buněk
(TRAIL + chemoterapie)
RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D.
Oddělení cytokinetiky
Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i.
Brno
Apoptóza
geneticky kontrolovaný komplexní proces programované
buněčné smrti, cílená sebedestrukce buňky
Zásadní význam ve vývoji a udržení homeostáza
mnohobuněčného organismu
Eliminace nepotřebných, poškozených, nebezpečných,
mutovaných či jinak pozměněných buněk za účelem
udržení homeostázy mnohobuněčného organismu
Hyršlová Vaculová A., 2015
Hlavní morfologické
znaky apoptózy
• bobtnání cytoplazmatické
membrány, integrita
membrány není porušena
• zmenšení velikosti buňky
• kondenzace a specifická
fragmentace jaderného
chromatinu
• udržení integrity
intracelulárních organel
• formace tzv.
apoptotických bodies
http://en.wikipedia.org/wiki/Apoptosis Hyršlová Vaculová A., 2015
 Aktivace specifických enzymů
 Proteázy – kaspázy, štěpení strukturně a funkčně
důležitých proteinů v buňce
 Nukleázy- specifická fragmentace jaderné DNA
 Aktivace/relokalizace specifických proteinových
regulačních molekul
 Nutné dodání energie ve formě ATP
 Změny symetrie membrán
Hlavní biochemické znaky apoptózy
Hyršlová Vaculová A., 2015
Apoptóza versus proliferace
 Pro udržení homeostázy organismu
je nutná dokonalá rovnováha mezi
procesy proliferace a apoptózy
 Porušení této rovnováhy má
dalekosáhlé důsledky, které se
odrazí na zdraví organismu
 Obzvláště nutné pro intenzívné
proliferující tkáně (krev, střevo…)
Hyršlová Vaculová A., 2015
(Walensky, 2006)
Deregulovaná buněčná smrt narušuje rovnováhu, resulting in
onemocnění – předčasná ztráta nebo nadměrné přežívání buněk
Hyršlová Vaculová A., 2015
Apoptóza a nádorová onemocnění
 Charakteristický znak nádorových buněk deregulace
apoptózy – omezení spontánní
apoptózy, rezistence k působení induktorů
apoptózy („chybný apoptotický program“)
 Nádorová onemocnění – nejvíce zkoumaný
typ onemocnění v souvislosti s defekty
apoptózy
 Strategie protinádorová terapie - cílené
spuštění apoptózy, eliminace nádorových
buněk, bez poškození okolní zdravé tkáně
organismu
Hyršlová Vaculová A., 2015
Cell death research field
(Melino, Vaux, 2010)
PubMed – papers:
Apoptosis – 288 798
Apoptosis and cancer – 126 549
03/2015
Protinádorová terapie
 Hlavní problémy současné protinádorové terapie:
 Omezená selektivita, výrazné poškození
zdravých tkání organismu
 Rezistence nádorových buněk
Využití selektivních induktorů vnější
apoptotické dráhy – velmi slibné, hlavní
kandidát – TRAIL (TNF related
apoptosis-inducing factor)
člen rodiny cytokinů tumor necrosis
(TNF) factors
Hyršlová Vaculová A., 2015
Aplikace TRAILu – atraktivní biologický
cílený přístup v protinádorové terapii
Výhodné vlastnosti – selektivita pro
nádorové buňky, nízká toxicita pro zd
Poslední dobou se ukazuje, že řada
nádorových buněk je rezistentní k
apoptóze indukované TRAILem
popis signálních drah TRAILu je proto
velmi důležitý pro pochopení
mechanismu působení a pro
správné zacílení protinádorové terapie
Hyršlová Vaculová A., 2015
Chemoterapeutické látky na bázi platiny
 platinová cytostatika úspěšně používána při léčbě
nádorových onemocnění více než 30 let, mechanismus
jejich biochemického účinku je však stále ne zcela
objasněn
 Cisplatina, oxaliplatina, karboplatina, nové deriváty…
 Většina těchto látek působí převážně na buňky, které
rostou a dělí se, což však nejsou jen buňky nádoru, ale i
buňky zdravých tkání
 Řada nežádoucích vedlejších účinků
 Omezení selektivita
Mechanismus působení – poškození DNA i jiných struktur buňky,
aktivace signálních drah buněčné smrti…
Hyršlová Vaculová A., 2015
Adamantylaminové Pt(II) a Pt(IV)
komplexy
Dvojmocné Pt(II)
(reaktivní s DNA)
čtyřmocné Pt(IV)
(s DNA nereaktivní)
Syntetizované F. Žákem a spol.,
PLIVA – Lachema
Zak et al., 2004, J Med Chem,
LA-9 LA-12
JM-216
(1. z řady
v klinickém
zkoušení)
Výhoda: lipofilní
redukce
Cisplatina (II)
V řadě případů se však ukazuje,
že monoterapie využívající
TRAIL je nedostačující – velká
šance ve využití
kombinované terapie –
TRAIL + chemoterapeutické látky
Hyršlová Vaculová A., 2015
(Calvino-Fernández et al., 2010)
Dvě hlavní dráhy aktivace kaspáz a
spuštění apoptózy
Bcl-2 family
proteins
TRAIL
Chemotherapeutic
drugs
Hyršlová Vaculová A., 2015
Apoptóza vs. léčba
nádorového onemocnění
 Možnost spustit apoptózu nádorové buňky
je základní podmínkou úspěšné
protinádorové terapie
 Řada nádorových buněk je však vůči
apoptóze rezistentní
 Je nutné objasnit mechanismy rezistence
a překonat ji
 nová léčiva, kombinovaná terapie
Hyršlová Vaculová A., 2015
Cílené spuštění apoptózy efektivní
a klíčová strategie
protinádorové terapie
Hyršlová Vaculová A., 2015
Význam našeho studia
 Snaha pochopit a popsat molekulární mechanismy,
které jsou zodpovědné za rezistenci nádorových
buněk k apoptóze a používané chemoterapii
 Najít nové účinné látky, které by zcitlivěly
nádorové buňky k apoptóze
 Popsat mechanismus působení těchto látek a
otestovat jejich účinky na buňkách nádorových a
normálních
 Využít výhod kombinované terapie a popsat její
efekty s ohledem na úspěšnou aplikaci v
protinádorové terapii
Hyršlová Vaculová A., 2015
Děkuji za pozornost!
Vaše dotazy, připomínky a zájem o
spolupráci směřujte na adresu:
RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D.
vaculova@ibp.cz
Oddělení cytokinetiky
BFÚ AV ČR v.v.i. Brno
Vše, co chcete vědět o lipidech
http://www.cyberlipid.org/
VZNIK LIPIDOVÝCH MEDIÁTORŮ (eikosanoidů) a jejich inhibice
INKORPORACE VNMK DO BUNĚK
► odráží složení a obsah VNMK v dietě
► n-6 a n-3 VNMK soutěží o
- stejné pozice v membránových fosfolipidech
- stejné metabolizující enzymy
INKORPORACE VNMK DO BUNĚK
► odráží složení a obsah VNMK v dietě
► n-6 a n-3 VNMK soutěží o
- stejné pozice v membránových fosfolipidech
- stejné metabolizující enzymy
Inhibice COX1/2:
nesteroid. antiflogistika (indometacin
ibuprofen,aspirin, coxiby )
Inhibice LOX: kys. nordihydroguiarová
Esculetin, MK-886
Klinické využití
Protizánětlivá a
protinádorová terapie
FOSFOLIPID