IMUNITNÍ SYSTÉM HMYZU
BUNĚČNÁ IMUNITA HUMORÁLNÍ IMUNITA
-pohyblivé krevní buňky – hemocyty
(počet a aktivita hemocytů je modulována
humorálními faktory a neuroendokrinním
systémem)
- molekuly v hemolymfě
- antigenem indukované antibakteriální a
regulační faktory
- koagulace
- fagocytóza (oxidativní vzplanutí?)
- nodulace
- enkapsulace
- aglutininy
- koagulační kaskáda
- fenoloxidásová kaskáda
- baktericidní peptidy
- antimikrobiální faktory (lektiny,
hemolin)
- lysozym
stresové faktory
- prohemocyty
- plasmatocyty
- granulocyty
- spherulocyty
- oenocyty
- fagocytóza
- enkapsulace
- nodulace
- koagulace
Hmyzí hemocyty:
Imunitní reakce hemocytů:
podle Turner 1994
• gely vznikají polymerací akrylamidu a N’,N’-methylenbisakrylamidu
• SDS (sodium dodecylsulfát) se váže shodně na všechny proteiny
v poměru 1,4 g / 1g proteinu a předává jim silný záporný náboj
• mercaptoethanol - rozštěpí disulfidické můstky v molekulách proteinů
Elektroforéza SDS – PAGGE
(sodium dodecylsulfat polyacrylamide gradient gel electrophoresis)
• vertikální elektroforéza SE 600 (Hoefer Scientific Instruments)
• 5 % koncentrační gel a separační gel (14 x 10,5 cm) s gradientem
akrylamidu 7,5 – 20,0 %
• dělení proteinů probíhalo ve dvou gelech, každý z nich pro 15 vzorků
• standard (SDS-PAGE Molecular Weight Standard Broad Range,
Bio-Rad; 6,5 - 200 kDa)
• gely byly barveny stříbrem podle Kirkeby et al. (1993)
- videodensitometr GS-670 a software Molecular Analyst (Bio-Rad)
Vyhodnocování gelů:
Profilová analýza:
• kvalitativní:
MW jednotlivých proteinových frakcí hemolymfy
• kvantitativní:
poměr zastoupení jednotlivých proteinových frakcí
mezi samci a samicemi během vývoje
• rozdělené vzorky na polyakrylamidovém gelu
• absorbční křivka (osa x – vzdálenost od startu, osa y – optická hustota)
• tabulka s určenou molekulovou hmotností frakcí (MW) a plochou píku
Profilová analýza:
Bombyx mori (Lepidoptera, Bombycidae)
bulharský monovoltinní hybrid AS x KK
Bombyx mori – samice
S – standard; 1. - 9. den V. instaru; PR – prepupa 1. den;
Z – kukla začátek; S – kukla střed; K – kukla konec.
Z S K
Galleria mellonella (Lepidoptera, Pyralidae)
RESULTS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 S
ApoLpI 230 - 250 kDa
Storage proteins
72 - 84 kDa
45 kDa
ApoLp III 14 - 18 kDa
Protein Profiles
Fig. 1. Acrylamide gradient gel of proteins extracted from last instar larvae (samples 1-5) and
pupae (samples 6-9) hemolymph of G. mellonella. Samples with increasing concentration of boric
acid: 0.00 ppm (1, 6); 156 ppm (2, 7); 620 ppm (3, 8); 1250 ppm (4, 9) and 2500 ppm (5).
Main protein groups of proteins are described on the left margin as well as 45 kDa protein
fraction according to protein standards (S).
Aktivita lysozymu v hemolymfěAktivita lysozymu v hemolymfě
y = 7,245x + 88,087
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
lysozym mg/ml
radiální difúze v agaróze
Reactive oxygen metabolites
detection:
- chemiluminiscence
- spectrophotometry
- NBT test
- cytochrome c reduction
- fluorometry
- DHR 123 staining
- HE staining
- total radical-trapping antioxidative
potential (TRAP)
Entomopatogenní hlístovky (EPN)
třída: Nematoda (Nematoda)
řád: Háďata (Anguilata)
čeleď: Steinernematidae
Heterorhabditidae
• vyskytují se volně v půdě
• selektivita - výhradně entomopatogenní
• nízké teplotní optimum - do 20°C
• využívají se jako prostředek biologického boje
Entomopatogenní hlístovky (EPN)
METODY
1. Přirozená invaze EPN:
- larvy G. mellonella nebo larvy Amphimallon sp., Hoplia sp. + 25 EPN, 10% vlhkost
- inkubace 20 – 24 hodin za laboratorní teploty
- celkem bylo použito 70 ks G. mellonella, 23 ks Amphimallon sp. a 23 ks Hoplia sp.
NENENES. scarabaei
NENENES. glaseri
NENEANOH. bacteriophora
Hoplia sp.Amphimallon sp.G. mellonella
Enkapsulace: ANO / NE
A / přirozená invaze
B / injikace EPN
NEANONES. scarabaei
NENENES. glaseri
NEANOANOH. bacteriophora
Hoplia sp.Amphimallon sp.G. mellonella
Shrnutí:
Experimentální model – modulace imunity Drosophily
Gal4/UAS systémem řízená exprese genů
„driver line“ – specifický promotor určující místo a čas syntézy Gal4
• Gal4 – váže se na DNA a aktivuje transkripci
„responder line“ – Upstream Activating Sequences místem pro vazbu Gal4
• RNAi konstrukt – jeho transkripce je pod vlivem UAS
Duffy. Genesis, 34(1-2): 1-15, 2002.
Responder line Driver line
Transglutamináza má také imunitní funkci
• centrální enzym koagulační kaskády
• homolog Faktoru XIIIa obratlovců
• infekce H. bacteriophora, 100 IJ na larvu, 22 °C:
Wang et al. PLoS Pathogens, 6(2): 1-9, 2010.
Wang et al. PLoS Pathogens, 6(2): 1-9, 2010.
Transglutamináza má také imunitní funkci
transglutamináza
bakteriální povrchové
proteiny
látkové prokoagulanty
(např. hexamerin)
matrix koagulační zátky
(Fondue, FBP1)
pattern recognition proteins
• transglutamináza zprostředkuje zachycení baktérií prostřednictvím tvorby
koagulační matrix
• RNAi linie, PPL driver (cílem tukové těleso a slinné žlázy)
• H. bacteriophora, 25 IJ na larvu, 29 °C
Potřebné substráty transglutaminázy…
**
**
Eikosanoidy zprostředkují obranu proti infekci hlístovkami
• ovlivnění metabolismu kyseliny arachidonové pomocí inhibitorů biosyntézy
eikosanoidů (IBE)
• přímá aplikace pomocí nanoinjektoru Nanoject II (Drummond Scientific)
dexamethason (inhibitor PLA2)
esculetin (inhibitor 5- a 12-LOX)
indomethacin (inhibitor COX-1 a -2)
podle Stanley et al. Neotropical Entomology, 31(3), 341-350, 2002.
Eikosanoidy zprostředkují obranu proti infekci hlístovkami
* ** **
** ** **
** **
**
** ** ** **
• larvy Drosophily (w1118) injikované 50,6 nl IBE v PBS
• infekce H. bacteriophora, 100 IJ na larvu, 22 °C: