Co jsou kmenové buňky7/ - buňky schopné vlastní obnovy (sebeobnova) - buňky schopné dávat vznik jiným typům bunék (schopnost diferenciace / rozrůzňovaní) ffcrontiatcd S á l Undiflérentlated \fÍ^J~stem cel 2 Functional cells Testis {Spermatogenesis, significant spontaneous Bone marrow oeJI death) (Haemopoiesis-broad pluri potentiality) Large intestine Small intestine (limited pluripotentialitly) Epidermis (keratopoiesis) Tongue stem celí 1 2 3 4 5 6 8 10 j 12 j Cell divisions 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 4096 Amplification 50 33 20 11 6 3 1.5 0.4 0.1 0.02 Number of stem cells as a % of total proliferative cells Kmenové buňky tvoří jen zlomek buněk dané tkáně/organismu ! Ir tang-term short-term multlpotent commits d re pop Lilting repopultirtg progenitor progenitor precursors mature cells stem cells stem cells cells cells (CPC) (LTHSC) fST-KSC) (MPC) Functional Cells Kmenové buňky v dospělém organismu další tkáně -f % - ■¥ r " —-~__ r- f -_ Proč nás kmenové buňky tak zajímají? □ „neomezený" zdroj nových buněk pro regeneraci tkání = > nezbytné pro zachování homeostážy = > zajímavé pro transplantace a buněčnou terapii mocné" kmenové buňky vznik a relaps nádorových onemocnění poruchy ve schopnosti regenerace, růstu,.. Co nás na kmenových buňkách zajímá? Jejich původ během ontogeneze, jak vznikají? ectoderm nervous tissue/NSCs skin/skin SCs bone marrow and blood/HSCs and MSCs muscle and bone/tissue SCs lung, liver, and pancreas/organ specific SCs esophagus, stomach, intestine/intestinal SCs Původ hematopoetických/krvetvorných kmenových buněk Co nás na kmenových buňkách zajímá? Jaké vnější a jejich vnitřní faktory regulují jejich existenci? aut&^é oarakrinně působící faktory diferenciace & proliferac Vnější faktory zodpovědné za zachování kmenových buněk diferenciace roliferace Diferenciace = rozrůzňování => vznik jiných typů buněk Proliferace = dělení buněk => zvyšování počtu buněk Dorsal endoderm RA (Wnt suppressed, Shh suppressed) Hex Hnf6/OC-1 Ptfla Activin Pancreatic lineages Foxal, Foxa2 Hnf6/OC-1 Hlxb9, Ptfla Ventral Dorsal Pancreatic progenitors Pdxl, Ptfla Hes1, Rbpj Sox9, Cpa1 FGF10 lsl1, Ngn3 NeuroD, Insml Endocrine progenitors Ptfla, Rpbjl Acinar cell Pancreatic duct Ghrelin Mafa, Pdx1r Hlxb9 Pax4, Pax6, lsl1 Nkx2.2, Nkx6.1 Pancreatic polypep. Niche (Naveiras, 2006) Verifikace kmenových buněk * sebeobnova x schopnost diferenciace ❖ specifické znaky/markery a vlastnosti (vývojově specifické> ❖ sebeobnova - nesmrtelno iferenciace in vitro 'mbryonální kmenové buňky (ES - embryonic stem cell) Ep i b last i Vnitřní buněčná masa i Blastocysts 1 ■>- Hypoblast Embryonální tkáně Zárodečný ektoderm ^ Zárodečný eptblast Zárodečný mezodenn Primitivní proužek Alantoický ektoderm Zárodečný entoderm Extraembryonál ní entoderm Žloutkový vak Extraembryonální tkáně Trofoblast Cytotrofoblast Syncytiotrofoblast Gilbert 1997 / Bílek 2004 Model pro studium vzniku a zachování somatických kmenových buněk Model pro studium vzniku a zachování somatických kmenových buněk v našich experimentech kultivace iferencované buňky indukce ES buňky * s geneticky modifikovanými faktory podezřelýmy z regulace fenotypu somatických kmenových buněk četnost vzniklých somatických kmenových buněk jejich vlastnosti (fenotyp a potenciál pro další diferenciaci) Laboratoř Protilátky - Ab = antibody - produkt plasmatických buněk (zralé B-lymfocyty) - bílkovina/protein, 4 proteinové řetězce, 2 lehké a 2 těžké "v V- ^ , -y ^ I - rozpoznání cizorodého materiál - antigénu I = > regulace imunitních/obranných reakcí I - detekce antigénu ve výzkumu Wk - antigén - látka na kterou je protilátka se ES schopná specificky navázat I - imunogen - struktura schopná I vyvolat tvorbu protilátek ^* I )noklon< - monoklonální x polyklonální = > dle původu (jeden nebo více klonu produkujících buněk) - primární x sekundární x terciální = Antibody J Úloha protilátek v organismu Naluro Rcviows | MJcroblology Hematopoiesis from Pluripotent Stem Cell www.eBioscience.com © 2012 eBioscience I Polyklonální protilátky - původem z více klonů Monoklonální protilátky - původem z jediného klonu!!! Western blot Develop at autorad i og - Blotting tank Proteins transferred to nitrocellulose sheet (blot) Detection in Western Blots Enzyme-conjugated ■ Secondary Antibody Primary Antibody Detection Signal (colori metric or chemiluminescent) Enzyme Substrate Target Protein Membrane Containing Transferred Protein Diagram 2: Illustration of detection in Western Blots. r Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci (M 10 fánt? trferffô&n!Vtt&A£w * SF f SF S+RA ŕ S S+RAŕ SF SF+fíA / S >r *flA f SF senjľi-i-ťtiee semrn-íree w semrn +RA serum ^ serum +RA serum-free ^ serum-f ree + RA semrn ^ semrn-free +RA semrn-free ^ 6 days H-CAM pill-tubulin Cytoker&tin Endo-A i' CO to to — X. to CO —— (0 (0 —I— « CO ■z. 1 3 í' Non-differentiated S-tRA r S SF I SF S+RA ŕ SF * ** -V : _ SF+RA i S_ SF-tRA ŕ SF Afinitní chromatografie + imunoprecipitace purif ikace a separace látek'' hledání partneru v komplexech molekul _ e+iirlinm c+mil^+iir»w m/\ a komplexu molekul ELISA techniky,... AnnLiOtfy □&B-X bi«in antibody binding Anťgen Protilátky jsou komerčně dostupné... Miltenyi Biotec