logo_mu_cerne.gif Ekotoxikologické biotesty Půdní biotesty Doc. RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. logo_mu_cerne.gif Úvod logo_mu_cerne.gif Půdní biotesty nTesty s půdními organismy nMatrice je půda (solid phase) n nCíl: chránit půdu a půdní biotu před účinky chemických látek a dalšími stresory n nProč? Půda je nepostradatelná složka přírody, základna pro růst rostlin, zásobárna živin, počátek a konec potravních řetězců a cyklů prvků, filtrační a dekontaminační zóna Photo: organic soil logo_mu_cerne.gif Proč ekotoxikologické testy ? nCHEMICKÉ ANALÝZY samotné NEDOKÁŽOU postihnout reálné riziko pro živé organismy: n1) reálná expozice se liší podle biodostupnosti toxických prvků a látek v dané situaci, n2) jde vždy o směs toxikantů, která působí jinak než jednotlivé toxikanty zvášť n3) Negativní vlivy matrice samotné bez ohledu na obsah toxikantů na živé organismy či interakce vlivu matrice s efekty toxikantů n4) spektrum analytických metod (tedy i limitních hodnot) je omezené a ve vzorku mohou být přítomny neanalyzované významně toxické látky. n logo_mu_cerne.gif Proč testy kontaktní (půdní) ? nÚčinky na půdní organismy exponované v pevné matrici nelze zcela extrapolovat z testů akvatických n nDo hry vstupuje významně osud kontaminantu v půdním prostředí, vliv na reálnou biodostupnost pro půdní organismy n nNezanedbatelné vlivy samotné matrice (např. nevhodné fyz.- chem. vlastnosti, kombinace s toxicitou) Dnešní znalosti působení kontaminantů v půdním prostředí naznačují, že rizika pro receptory v půdním prostředí lze jen velmi těžko predikovat z výsledků akvatických testů výluhů, které neposkytují relevantní informaci pro scénář expozice organismu v pevné matrici. Hlavním důvodem jsou aspekty biodostupnosti, kterým je věnována kapitola 6. Přesto v legislativě kolem biocidů i chemických látek najdeme spíše převahu testů akvatických a v legislativě odpadů zatím půdní testy kontaktní povahy chybí docela a to i na úrovni EU. Taková je situace i přesto, že již bylo představeno mnoho testovacích systémů využívajících organismů, které jsou klíčové pro funkci půdního ekosystému logo_mu_cerne.gif Důsledky expozice v pevné matrici nPevné matrice jsou dosti heterogenní nObsahuje vždy všechny tři fáze PEVNOU, KAPALNOU (pórová voda) a PLYN (vzduch) nPřítomnost pevné fáze zejména má významný vliv na OSUD a CHOVÁNÍ chemické látky nV závislosti na vlastnostech látky, vlastnostech půdy a čase dojde k DISTRIBUCI látky v půdě, případně vzniku SPECIÍ nStěžejním procesem je SORPCE a důsledkem je klíčový faktor půdních testů (eko)toxicity – BIODOSTUPNOST nTo vše má fatální důsledky pro výslednou toxicitu a riziko nDůsledkem je i ztížená extrapolace mezi půdami, z akvatických testů na půdní a z laboratorních testů na reálnou situaci Půdní prostředí má svá specifika, především … … důsledkem je prostorová distribuce a výskyt různých forem – vázané, rozpuštěné, sekvestrované v nanopórech apod. U kovů je pak velmi výrazná SPECIACE Biodostupnost hraje klíčovou roli v ekotoxikologii půdních organismů logo_mu_cerne.gif Schéma expozice v půdním prostředí Vstup POLUTANTU ORGANISMUS Polutant v organismu Metabolismus, eliminace, efekty POLUTANT v půdě prostorově distribuován a v různých formách EXPOZICE je funkce: osudu polutantu v půdě + vlastností organismu (morfologie, fyziologie, ekologie ...) logo_mu_cerne.gif Které vlastnosti matrice jsou kritické nObsah organické hmoty – OM, TOC nObsah jílovitých částic (ø < 10 µm) nKationtová výměnná kapacita npH nVlhkost nStruktura půdy nČas soil logo_mu_cerne.gif Využití půdních biotestů při ochraně půd nZakotvení v legislativě = PROČ mají půdní biotesty své místo na slunci n nDo teď zejména při hodnocení nebezpečnosti chemických látek a pesticidních přípravků n nSilný nárůst zájmu o využití biotestů při hodnocení komplexních směsí jako jsou odpady, kal ČOV, sedimenty, komposty, hnojiva apod. n nVelký potenciál biotestů při hodnocení kvality půd např. před a po remediaci, při inventůře kontaminovaných ploch apod. logo_mu_cerne.gif Dostupné standardní postupy půdních biotestů logo_mu_cerne.gif Půdní potravní síť vs dostupné biotesty A-3 Earthworms, Enchytraeids logo_mu_cerne.gif Standardy půdních metod - ISO ISO Logo Půdní mikroorganismy logo_mu_cerne.gif Standardy půdních metod - ISO ISO Logo Suchozemské rostliny logo_mu_cerne.gif Standardy půdních metod - ISO ISO Logo Půdní bezobratlí logo_mu_cerne.gif Standardní metody OECD nhttp://www.oecd.org/document/40/0,3746,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html n Organisation for Economic Co-operation and Development logo_mu_cerne.gif Standardy půdních biotestů – US EPA 16 http://www.epa.gov/ocspp/pubs/frs/home/draftguidelines.htm logo_mu_cerne.gif EPPO standards 17 Scheme for the environmental risk assessment of plant protection products logo_mu_cerne.gif Přirození nepřátelé škůdců z řad členovců, kteří jsou standardizováni ve směrnicích IOBC, BART, EPPO (Samsøe-Petersen, 1990) Crop Type of natural enemies Examples1 Cereals Polyphagous predators Pterostichus cupreus+* Bembidion lampros+ Tachyporus hypnorum Aleochara bilineata+ Linyphiid spiders+ Lycosid spiders+ Chrysoperla carnea+ Aphid-specific predators Coccinella septempunctata+ Episyrphus balteatus Eupeodes corollae+ Aphid parasitoids Aphidius spp.+* Vegetables Polyphagous predators As for cereals Aphid parasitoids Aphidius spp.+ Diaeretiella rapae+ Lepidopteran parasitoids Trichogramma cacoeciae+° Orchards Predatory mites Typhlodromus pyri+* Amblyseius potentillae+ Aphid-specific predators As for cereals Lepidopteran parasitoids As for vegetables Polyphagous predators Anthocoris spp.+ Orius sp.* Glasshouses Predatory mites Phytoseiulus persimilis° Whitefly parasitoids Encarsia formosa° Aphid-specific predators As for cereals (except syrphids) Aphidoletes sp. Aphid parasitoids As for vegetables Leaf miner parasitoids Dacnusa, Diglyphus Opius+ logo_mu_cerne.gif Organizace spojené s půdními testy nOECD = Organization for Economic Cooperation Development nISO = International Standardization Organization nUS EPA = US Environmental Protection Agency nSETAC = Society for Environmental Toxicology and Chemistry nIOBC = International Organisation for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants nEPPO = European and Mediterranean Plant Protection Organization nASTM = American Society of Testing and Materials nANSI = American National Standards Institute nCEN = European Commitee for Standardization nAFNOR = Association Francaise de Normalisation nEEC = European Economic Community nWHO = World Health Organisation nBBA = Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft nOPPTS = The Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances (EPA) nBART = Beneficial Arthropod Regulatory Testing logo_mu_cerne.gif Výběr testů do procesů hodnocení rizik nOptimální vlastnosti půdního testu jsou: n nstandardizovatelnost, opakovatelnost, variabilita npraktická proveditelnost, cena, rychlost ncitlivost nvypovídací hodnota, použitelnost pro ochranu ŽP nekologická relevance n n n(samozřejmě platí vlastně i pro všechny další biotesty) logo_mu_cerne.gif Příklad: sada testů z Vyhlášky 257/2009 Sb. nPřed testy s roupicemi a vyššími rostlinami jsou reprezentativní vzorek sedimentu i reprezentativní vzorek referenční půdy (půda, na kterou má být sediment použit) vysušeny při laboratorní teplotě, zhomogenizovány a přesáty přes síto 2 či 4 mm. nPro testy inhibice nitrifikace je referenční půdou nekontaminovaná půda splňující požadavky ISO 15685 (2004) a jak sediment tak referenční půda jsou vzorkovány, zpracovány a skladovány v souladu s ISO 10381-6 (2009): v přirozené vlhkosti, přes 2 mm síto, uchování v 4 °C maximálně dva týdny. nPřed testováním se hodnocený sediment smíchá s půdou v objemovém poměru 1:3, který vychází z maximálního povoleného poměru výšky použitého sedimentu a orničního profilu v vyhlášce. Potworms (Enchytraeids doerjesi) Example of light coloured springtail (Folsomia candida) Nitrifying bacteria isolated from landfill leakage ISO 16387 (2004) ISO 11267 (1999) 11269-1 (1993) ISO 15685 (2004) všechny koncentrace kompost logo_mu_cerne.gif Ekologická relevance testů n ntestované druhy by měly reprezentovat relevantní funkční skupinu ntest má respektovat ekologii organismu nsledované odpovědi by měly být ekologicky relevantní a indikovat stav a funkci organismu (přežití, růst, reprodukce, přijímání potravy a mobilita) npři sledování reprodukce by měla expozice pokrývat většinu životního cyklu nabiotické a biotické faktory by měly v testu být podobné jako v habitatu nexpoziční cesty by měly napodobovat reálné expozice nbiodostupnost kontaminantu by měly být podobná jako v reálu nkoncentrace by měly být environmentálně reálné (u půdy obecně pro všechny látky lze jako maximum dát 1 g/kg půdy) logo_mu_cerne.gif Ekologická relevance organismů nhrají klíčovou roli ve fungování půdního ekosystému nvyskytují se v řadě ekosystémů ve vyšší abundanci nlehce použitelné v polních i laboratorních podmínkách ndostávají se do kontaktu s polutanty njsou dostatečně citlivé na stres n n n nProblém ekotoxikologie obecně: nv testech použiji organismy A (z celé řady důvodů), ale cílové organismy v systému jsou B è jaký je vztah výsledků pro A a B ? nPříklad: Eisenia fetida – nejznámější půdní test n Go to fullsize image logo_mu_cerne.gif Druhy žížal Pic1 octaedra_adult_img08 fetida_adult_02 Eisenia fetida – žije v kompostu !! Dendrobaena octaedra Aporrectodea caliginosa caliginosa_adult_08 rubellus_adult_08 Lumbricus rubellus terrestris_adult_010 Lumbricus terrestris logo_mu_cerne.gif Základní koncepce půdních biotestů logo_mu_cerne.gif Koncepce půdních biotestů logo_mu_cerne.gif Půdní biotesty - koncepce nJde o prospektivní přístup k HODNOCENÍ EKOLOGICKÝCH RIZIK nCÍL: Určit, jaká koncentrace chemické látky v půdě je bezpečná nK tomu slouží soubor půdních ekotoxikologických testů a následně metodika hodnocení ekologických rizik Dose Response [USEMAP] logo_mu_cerne.gif Půdní biotesty - koncepce 1.Testuje se chemická látka è koncentrační řada, např. 1, 10, 100, 1000 mg Cd / kgsuché půdy 2. 2.Testuje se materiál typu kontaminovaná půda, sediment, kal ČOV apod. è koncentrační řada vzniká „ředěním“ s referenční půdou, např. 10, 20, 40, 80, 100 % kalu s čistou půdou IN00647_[1] IN00647_[1] IN00647_[1] Dose Response logo_mu_cerne.gif Example of light coloured springtail (Folsomia candida) Proč testy kontaktní ? ntesty výluhů nelze simulovat toxicitu pevných vzorků Èerná skládka výluh 1:10 sdilution IMG_4025 produce_ph05 kontrolní půda odpad smíchání v různých poměrech PROČ ? à reálná BIODOSTUPNOST à integrován EFEKT MATRICE Zatímco postup testování odpadů založený na provedení výluhu odpovídá filosofii ochrany vodního prostředí, neříká nám prakticky nic o rizicích, která odpad představuje po aplikaci na půdy. Důvodem je, že vodný výluh se týká pouze mobilní frakce kontaminantů, ale z kontaktních testů je známo, že biodostupné organismům jsou i další frakce, například labilně vázaná, či asociovaná s organickou hmotou, kterou se živí. Z opačného důvodu jsou naprosto nevyhovující pro zhodnocení rizika odpadů chemické analýzy celkového obsahu polutantů. V případě organických polutantů jde o organický extrakt a v případě kovů o lučavku, které nadhodnocují biodostupnou, tedy potenciálně rizikovou frakci kontaminantů. Odpad ohodnocený pouze podle celkového obsahu kontaminantů jako rizikový tak nemusí po aplikaci na půdu představovat významné riziko a nakládání s ním jako s nebezpečným odpadem představuje i zbytečné ekonomické výdaje. Jde o analogii přílišné remediace kontaminovaných půd podle celkových obsahů látek a ne založené na zhodnocení rizika. logo_mu_cerne.gif Testování toxicity tuhé matrice logs Abbruch_reliktische_Bausubstanz-3 Halde-2 Grasbrook 010 produce_ph05 Go to fullsize image logo_mu_cerne.gif Biotesty jako nástroj hodnocení kvality tuhé matrice nExistují ISO normy určující výběr testů n nISO 15799 (2003): Guidance on the ecotoxicological characterization of soils and soil materials nISO 17616 (2008): Guidance on the choice and evaluation of bioassays for ecotoxicological characterization of soils and soil materials logo_mu_cerne.gif Biotesty jako nástroj hodnocení kvality tuhé matrice logo_mu_cerne.gif Expoziční systémy nChemikálie smíchána s půdou nArtificiální půda (OECD, ISO) nReálná půda (LUFA 2.2 či jakákoliv jiná) n nAplikace na povrch těla nInjekce nAplikace na přijímanou potravu n…… Go to fullsize image Go to fullsize image Implanting a VIE tag into an earthworm logo_mu_cerne.gif Expoziční cesty v pevném vzorku nIngesce a orální vstup npotrava a půdní částice - organismy konzumují minerální a organickou hmotu - významná expoziční cesta pro sorbované chemikálie; kontaminanty se mohou bioobohacovat - např. v houbách, které konzumují chvostoskoci; významná cesta pro členovce nDermální vstup nz půdy, z půdního roztoku - zejména organismy vrtající v půdě (žížaly a roupice), které mají tenkou kutikulu a jsou v kontaktu s půdou a pórovou vodou; lze modelovat výsledky i z testů v akvatickém prostředí při doplnění modelu distribuce látky mezi půdní roztok a sorpci na částice = tzv. Equilibrium partitioning theory (EqP) n nDýcháním nnejsou téměř žádná data Go to fullsize image Potworms (Enchytraeids doerjesi) logo_mu_cerne.gif Artificiální půda n10% Suchá a jemně namletá rašelina n20% Kaolinitový jíl obsahující minimálně 30% kolinitu n70% Křemenný písek jemný obsahující minimálně 50% zrn o velikosti 0,05 – 0,2 mm n0,3 – 1% Uhličitanu vápenatého, který je přidán tak, aby výsledné pH bylo 6 ± 0,5 kunstgrond logo_mu_cerne.gif Artificiální vs reálná půda: n n IMG_4025 Artificial soil has been used in soil ecotoxicity tests from 1980’. The main reason was to standardize the conditions in the laboratory test, because it was well known from the beginning, that soil properties have crucial impact on the toxicity of the tested compound. Thus, artificial soil was developed with the advice of pedologists to overcome the variability between different soil types and it is supposed that it has an adsorptive capacity resembling typical loam soil. It is supposed that the results can be extrapolated to natural soils (as I will show on the next slide). The composition is silica sand (50-200µm) as 70%, kaolin clay (97% kaolinite with a particle size < 40 µm) - 20%, sphagnum peat (<2mm) - 10%. pH is adjusted by CaCO3. Moisture content is used usually about 50% on the weight basis. It was several times stressed that one natural component (the peat) is often difficult to handle since its properties can vary a lot. Also kaoline clay can vary. We see that this soil has relatively high amount of organic matter when compared with e.g. arable natural soils, and also it is the question, if the kaolinite clay is really example of environmentally realistic clay. logo_mu_cerne.gif Složení artificiální půdy je předmětem výzkumu vesselsready logo_mu_cerne.gif LUFA standardní půdy (http://lufa-speyer.de/) nLandwirtschaftliche Untersuchungs und Forschungsanstalt Speyer npřírodní půdy je potřeba před testy ošetřit: defaunace, úprava vlastností nCena: 4 EUR za 1 kg + doprava German logo_mu_cerne.gif European reference soil set (IRMM-443-EUROSOILS) DCJLDPCA3F1QYSCAH805H6CAEL5TDMCA8JT8AKCA0KVGBLCAN1JH6LCA31S8QPCA1EXDIUCAHADAVDCA1UAUT2CARQ5I7VCA90V OMVCALMVVOCCA5NUVOZCACKVXU9CAVK52A4CAB33M1SCAEPPR24 GCYO94CAYQ9IGACA3HBAPKCA0O4IJHCAR6GTB5CAQ3U804CALJ7V2NCAPFRVJGCA9IMO19CAJJ6E26CAPKA5JDCAT8BVB6CATFK 64GCAZLE1HECAXIJ313CA3FNLEXCAC6L6XKCAZGB79LCAVIY0IY LCZK42CA4DWKLDCA2Z4XENCAKKKRNFCA7F5QFFCAY1OLMCCAVBXAYLCABWLX6WCA0D7VUWCA6292ORCAO0IVC7CAOF76DHCAGB4 JWSCALQJU8ECAZMZKBGCAVRDGA9CAG7JJRECAQJFJW5CA65D5IZ OH9Z77CAI0ZPOSCADMHMQHCAY1N8ORCA4L1YM2CA782G0FCAMAU4PMCAKTGG8DCASQY6WXCAWEDONGCAYLV7Q9CATJ4B1CCA3EP LAQCACYSSFWCA6IKG6BCAJVS9XJCAITWBCCCASYVSN1CAPXS9IZ R8HMLGCAY68EEBCAW8P60PCAJ6QMEMCAT5VWJFCAIGN80KCAXTFWIICAB007ZICAQJF6JUCA1L56Y7CATM42EWCAR77CDBCAOOM L33CAEPOEM3CAK11HJPCAJ24U08CAROC9L5CASZR3TFCAJF6JWN TRG2YLCAWVWGSOCAPGFRMYCA7XLGIMCAJZZOG8CAI0IV3MCAASHZH0CAEK0J3CCAY7SJM5CA85Q3DPCA48LM7SCA8GFBOYCA0VA FDVCA71OTD9CAMEPKFUCAFHJ8Q4CARG9TF9CAGNPIJFCATVN1QM XQ0C8LCAS8TXAKCAJBPMA3CAF2RV44CACFSL3QCABR6S93CAES5JJ1CA1G5UGZCAW92XUWCA5HR6OFCAFMNNS2CAQUPHKFCA6MP 0AUCAPKDV3DCAVUFCOACA8ZT1NACAMT8EFDCAXJ73WPCAK820Z6 ZEVCH8CAFQNWG6CA817WZOCA5BGPDRCA8BTVSQCALF6KT4CA7PW8HDCACHCZK4CAHVOFUWCAX3OQ6RCACAEZOBCA2J3FW4CAZ1K P9SCAY3AWHMCALXF9CECARIT2CRCAPFXCTKCA3NXA10CARYN4UZ 4SYFWJCAB5E5XDCASG6EUGCAUHDFTXCA3UNNVRCA6WX3HRCAF4W1AZCAA57HX8CAXEGXGKCA2AZ29ACA2GI80WCAX8ANC0CAPL9 KSCCAFPJRNECAX2YQE6CAP53HZ7CAYLUS48CAAXK0A9CAZPCP7B 4TW8KMCAT6X9B9CA9I9PT5CAZ22YV4CAFEMJDSCAJN1QTWCACO7IEVCADI4FC8CAOP5HCGCAK88D0CCATDYUI9CAJJL10XCAG4S CVVCA3REFWNCAK9MUPBCA2L8L4UCAN4143PCA57G1N9CANL580B 07TIAMCAW8NFY8CAX4DN07CAHWCQUECAYTGKM2CA2HQB9UCAZCZ1X0CA2PBZE0CAE7M42JCA6RUSB0CAEMH53XCAMJHYS4CA60I V3LCANR8WTMCAEXH3UPCADZLAT7CA83UJUYCASBGER0CAD8XXUF 8GLM5NCAFPEN0XCAP803H8CATWEA9SCA7YK65XCAY3A8ZDCAN2IAUACA1KH0NWCAJUI5S7CA4YT72ZCA738MPBCA19P6CXCAYZX CFWCAJJ3PKNCALB7BZYCAWS5IM5CAQ0W0WUCANFU0OYCARCL566 BRB4R4CAN33GGICA8CL3TSCA3RLC5XCAWLCYIVCABTZL7WCA2O1G5WCAB4TUKICAA54GCDCAMKENOVCA8ZXJFOCASJY86TCAASZ 5JNCAOZTYHACA9MKBYRCA6AFGIDCAWHZ8QSCAGYVOESCAJWALFD logo_mu_cerne.gif Dávkování látek do půdy ncílem je HOMOGENITA expozice testovanou látkou n nve vodě rozpustné npro přídavek využita destilovaná voda, kterou současně adjustujeme potřebné ovlhčení půdy, přičemž by jejich koncentrace v přidávané vodě neměla přesahovat 50% saturační koncentrace nnerozpustné ve vodě 1.suspendovány ve vodním roztoku pomocí nosiče, který není toxický, je rozpustný ve vodě (aceton, etanol, arabská guma) a je volatilní 2.rozpuštěny v organickém rozpouštědle, které není toxické a rychle se odpaří n V předchozích případech lze aplikovat: 1.do malého množství (1-10%) jemného křemenného písku; po odpaření rozpouštědla je tato směs přidána do půdy a promíchána 2.přímo do vzorku půdy (suchý či vlhký) s následným odparem a promícháním n Ve všech případech je nutno zařadit kontrolu na nosič respektive na rozpouštědlo nnerozpustné ve vodě ani ve vhodném rozpouštědle nlze smíchat přímo s křemenným pískem (2,5g písku na 20g půdy) Go to fullsize image logo_mu_cerne.gif Testovací design obecně nMladí ale dospělí jedinci (většinou 10) jsou exponováni chemikálii (či kontaminované zemině) smíchané s artificiální půdou v nádobkách ze skla či inertního materiálu (+ potrava) n nPředběžný test - hledáme rozmezí používaných koncentrací (ředící faktor 10; 0,1 - 1000 mg/kg); mortalita hlavní endpoint hodnocený po krátké době (např. 2 týdnech) n nFinální test - výstupem je funkce závislosti účinků na koncentraci testované substance (jemnější škála; nejlépe s faktorem 2); hodnoceny přežití dospělců (mortalita - akutní test) a počty juvenilů (reprodukce - reprodukční test) n nNOEC design – méně koncentrací, ale více opakování – např. 5 koncentrací po 5 opakováních a kontrolní varianta (bez chemické látky, na rozpouštědlo apod.) nEC/LC design – více koncentrací, méně opakování – regresní metody logo_mu_cerne.gif Půdní biotesty s mikroorganismy logo_mu_cerne.gif Testy s půdními mikroorganismy Soil sampling Storage Pre-incubation (7 days) START Substance application Negative control Positive control 7th day 14th day 21st day 28th day Microbial parameters 10 g per replicate aerobic conditions 60% WHC; 22°C; dark OECD 216 (2000) Soil Microorganisms, Nitrogen Transformation Test OECD 217 (2000) Soil Microorganisms, Carbon Transformation Test ISO 14238 (1997) Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes logo_mu_cerne.gif Požadavky na půdu npřirozená půda, která je vybrána tak, aby byla citlivá vůči kontaminaci a splňovala tzv. "nejhorší scénář", tj. maximální expozici mikroorganismů polutantu v této půdě: n více než 70% písku n pH 5,5 - 7,0 n Corg 0,5 - 1,5% n Cbio/Corg více než 1% (dostatečné oživení) n kationtová výměnná kapacita vyšší než 70 mmol/kg n nv historicky známé době nekontaminovaná (adaptace společenstva) n nAlternativy: nvzhledem k možnosti přítomnosti resistentních mikroorganismů v reálném společenstvu existují postupy, kdy je do sterilizované přirozené půdy inokulována specifická kultura mikroorganismů (Pseudomonas putida, Bacillus cereus) è plynulý přechod k "solid phase testům (SPT)“ toxicity s prokaryoty logo_mu_cerne.gif Endpointy v mikrobiálním testu nStandarně pouze mineralizace dusíku a uhlíku jako produkci CO2 a sumy minerálních forem dusíku (NH4+, NO2-, NO3-) n nLze ale stanovit i další parametry: nMikrobiální biomasu nSubstrátem indukovanou respiraci nEnzymatické aktivity nKinetiku mineralizace C a N nAmonifikaci, nitrifikaci nDiverzitu n nVýstupy: NOEC, LOEC, LC50, EC50, IC50 ... logo_mu_cerne.gif Stanovení mikrobiální biomasy nFumigačně-extrakční metoda ISO 14240-2 1997 Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method logo_mu_cerne.gif Bazální a potenciální respirace 64 Bazální respirace Potenciální respirace ISO 14240-1 1997 Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method ISO 16072 2002 Laboratory methods for determination of microbial soil respiration logo_mu_cerne.gif Hodnocení mineralizace dusíku 101 ISO 14238 1997 Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes logo_mu_cerne.gif Krátké testy toxicity s půdními mikroorganismy – SIR kinetika 92 93 A) Testování kontaminovaných půd B) Testování chemikálií ISO 17155 2002 Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves logo_mu_cerne.gif Krátké testy toxicity s půdními mikroorganismy – Oxidace amoniaku nJde o míru nitrifikace = první krok nitrifikace nSNA = short term nitrification assay nPAO = potential ammonium oxidation n n n npůda inkubována v roztoku síranu amonného nchlorečnan sodný inhibuje oxidaci dusitanu npo 6 hod stanovení NO2- n 102 ISO 15685 2004 Determination of potential nitrification and inhibition of nitrification - Rapid test by ammonium oxidation logo_mu_cerne.gif Půdní biotesty s bezobratlými logo_mu_cerne.gif Žížaly v ekotoxikologii nžížaly jsou asi nevíce a nejdéle ekotoxikologicky užívaný představitel půdní fauny n nVýhody a důvody: ncelý vývojový cyklus probíhá v půdě - typický geobiont nzkonzumují velká množství půdy (vysoká expozice potravou a akumulace kontaminantů) nmají velmi úzký fyzikální kontakt s půdou (expozice pokožkou) nmají výrazné bioakumulační a biokoncantrační charaktery (jejich analýzou posuzujeme vliv delšího časového období) = patří mezi tzv. makrokoncentrátory nvysoký a významný podíl na tvorbě půdy, dekompozičních procesech, půdní úrodnosti nklíčové postavení v přenosu polutantů v potravních řetězcích nvýskyt téměř ve všech půdách ve vysokých počtech i váhách nosvědčené, zavedené v laboratorních testech (nenáročný chov) nsnadno se identifikují v reálných vzorcích (díky velikosti) logo_mu_cerne.gif V různých testech různé endpointy nMortalita nReprodukce nZměny váhy nBehaviorální změny nMalformace nFyziologické změny nSnížení imunity nAktivity enzymů nBiochemické markery nGenotoxicita n…. logo_mu_cerne.gif n Eisenia Eisenia Cycle Eisenia fetida nVýhody nStandardní druh nSnadná kultivace velkých počtů nKrátký životní cyklus logo_mu_cerne.gif Chov žížal nNevýhoda těchto jinak perfektních testů: nároky na prostor, čas n nboxy 50×50×15 cm s těsnícími víky nmédium 1:1 směs kravího či koňského hnoje a rašeliny npH cca 7 nnekontaminovaná amoniakem či močí npokud vše jde dobře za 6 týdnů až 1000 žížal (na 20 kg směsi): týdně 2-5 kokonů s cca 4 juvenily na kokon nv optimálních podmínkách je dospělá za 2-3 měsíce n nkulturu lze také získat ve vermikompostovacích firmách n nSynchronizace kultury: nzačne se s kokony, za 3-4 týdny se vylíhnou, za 7-8 týdnů dospějí (20°C) logo_mu_cerne.gif E. fetida akutní test v půdě ndospělci E.f. jsou chovány 14 dní v artificiální půdě obsahující kontaminant (500 g půdy) npřed finálním testem provádíme test hledající rozmezí koncentrací nkontaminace se udává v mg/kg; doporučené koncentrace jsou 0.1, 1, 10, 100, 1000 ndávkování (rozpustné × nerozpustné × pevné ... klasika) nvyšší koncentrace než 1000 mg/kg nejsou environmentálně relevantní a nemá smysl je testovat nna 1 koncentraci 1 nádoba v předběžném testu a 4 nádoby ve finálním testu nnádoba má 10 jedinců (dospělci: clitellum, váha 300 - 600mg, věk 2-12 měsíců, rozdíly ve věku by neměly být vetší než 4 týdny) nkontinuální osvětlení (400-800lx) zabezpečuje setrvání jedinců celou dobu v půdě nmortalita a váha po 7 a 14 dnech (nereagují na jemný mechanický stimul) se převede na LC50 ndoporučuje se užití referenční látky - chloracetamid (LC50 mezi 20 a 80mg/kg) nkontrola - mortalita méně než 10% a úbytek váhy menší než 20% ISO 11268-1 1993 Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate logo_mu_cerne.gif E. fetida reprodukční test nv nádobách 1-2L s povrchem 200cm2, vrstvička asi 5-6cm (500-600g) AS npotrava 0,5g hnoje na jedince a na týden ndo nádoby 10 dospělců n1 týden předinkubace; předběžný test; finální test n20°C; 16:8 400-800lx; krmení 5g sušeného hnoje týdně npo cca 4 týdnech mortalita, zvážení, spočítají se kokony + juvenilové; oddělají se dospělci nkokony se inkubují další čtyři týdny - extrakce juvenilů ručním tříděním nvýsledky jsou váha dospělců a počet juvenilů na dospělce nKONTROLA musí mít cca 30 juvenilů/dospělce; koeficient variance pro reprodukci <30% a mortalita dospělců po 4 týdnech by neměla být větší než 10% nREFERENČNÍ LÁTKA je doporučován carbendazim; má mít statisticky významný efekt v koncentraci 1-5 mg/kg ISO 11268-2 1998 Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 2: Determination of effects on reproduction logo_mu_cerne.gif WHC vesselsready controlwithworms wormsweighing wahingwormsJPG Příprava půd Měření WHC půd Ovlhčená AS rozvážená do testovacích nádob Výběr 10 reprezentativních adultů z chovu a jejich omytí Zvážení jedinců Přídavek 10 adultů do nádoby na test drysoils Reprodukční test logo_mu_cerne.gif wormssearching wormsweighing bottomofvessel Prohlídka nádob (známky aktivity) Zhodnocení mortality Zvážení žížal trolleywithworms Nádoby během testu v kontrolované místnosti Reprodukční test logo_mu_cerne.gif waterbathS juvenileszoomedS juvpicking cocoonsievingS cocoonsearchontray cocoonsinthehand Po cca 20 min juvenilové na povrchu Vodní lázeň s narůstající teplotou 40ºC až 60ºC Přesátí půdy Sbírání a počítání Počítání Ruční třídění kokonů Reprodukční test logo_mu_cerne.gif logo_mu_cerne.gif Příklad hodnocení pesticidů logo_mu_cerne.gif Earthworm Avoidance Test Guideline: ISO/DIS 17512 (draft) Species: E. fetida / E. andrei Substrate: LUFA St. 2.2 standard soil Duration: 1 - 2 days Parameter: Behaviour of the worms Test vessels: Dual chamber DSC07739 logo_mu_cerne.gif Testy s roupicemi nRelevance: nModelový organismus půdních destruentů nRoupice zastávají podobné funkce jako žížaly a v některých systémech je nahrazují nRealistická expozice – obývají horní vrstvičku půdy n nPraktické výhody testů při srovnání s prostorovými, časovými a finančními náklady testů na žížalách: n4-6 týdnů oproti 8 týdnům n20g půdy oproti 1/2 kg nMalé ale dobře manipulovatelné nMalý a snadný chov (není potřeba hnůj) n logo_mu_cerne.gif Enchytraeus albidus vs crypticus §E. albidus: 15 – 40 mm §E. crypticus je mnohem menší (5 - 10 mm) §praktické problémy - potřeba barvení §ALE dá se bez problémů kultivovat ve velkém na agaru §vzhledem ke kratší generační době ho získáme velké počty v krátké době (E.a. 33 dnů × E.c. 8 dnů) n logo_mu_cerne.gif Chovy roupic nV půdě (E. albidus, E. crypticus) či na agaru (E. crypticus) nSubstrát může být artificiální půda, přírodní půda, či zahradní zemina, či směs např. 1:1 nSubstrát musí být defaunizován (opakované zmražení a roztání), nesmí obsahovat polutanty a mít vhodné vlastnosti (zejména pH) a přesátý přes 2 mm nKrmení – autoklávované mleté ovesné vločky nV chovu musí být přístup vzduchu a optimální vlhkost nIndikátory nevhodného substrátu: roupice pohybující se pouze po povrchu, či snažící se uniknout z nádoby, nevyskytující se juvenilní jedinci apod. nCyklus (18 °C): kokon obsahuje průměrně 5 - 15 vajíček; po 1-3 týdnech se vylíhnou juvenilní jedinci, kteří dospívají cca po 3 až 6 týdnech n2 x týdně kontrola vlhkosti a krmení logo_mu_cerne.gif Chovy roupic Image14 grindal_worm IMG_3421_1 IMG_3464 IMG_3357_1 logo_mu_cerne.gif Test na reprodukci roupic – 1. část nJe možno provádět se dvěma druhy E. albidus a E. crypticus nInertní nádobky a v každé 20g půdy pro E.a. a 10 g pro E.c. nPodmínky testu: optimální teplota (max 20 °C), vlhkost (40 - 60% WHC), osvětlení (perioda 16:8, 400-800 lux) n10 dospělých jedinců (opasek s tečkami vajíček) do každé nádobky nKaždý týden s vyjímkou prvního týdne po odstranění dospělců je přidávána potrava (cca 1,2 mg ovesných vloček na g půdy). nMortalita – po 2 týdnech (E.c.) či 3 týdnech (E.a.) se spočítají dospělci a odstraní se z půdy nPozorování morfologických změn lze provádět na petriho miskách: nJedinci jsou asi 12 hodin necháni na miskách v chladu, čímž dojde k vyčištění trávící soustavy. nJedinec je přemístěn do kapky vody na podložní sklíčko nPozorování začíná na 100× zvětšení a detailní studium externích a interních struktur provádíme při 400× zvětšení. logo_mu_cerne.gif Test na reprodukci roupic – 2. část nPo odstranění adultů se inkubuje pouze půda s kokony (bez potravy) nPo dalších 2 týdnech (E.c.) či 3 týdnech (E.a.) se hodnotí reprodukce - fekundita, pro extrakci juvenilních jedinců nMetoda mokré extrakce (fixace etanolem a barvení 1% bengalskou červení po 12 hodinách) n nKontrola v testu (bez aplikace chemikálie i nosiče) má vykazovat následující parametry: nmortalita dospělců méně než 20% na konci testu nrozmnožení nejméně 25 juvenilních jedinců na 10 dospělců (pro E.c. je zo 300 až 500) nkoeficient variance pro počet juvenilů méně než 50% n nPozitivní kontrola - referenční látka - carbendazim (1,2±0,8mg/kg by mělo vyvolat EC50) logo_mu_cerne.gif Postup testu s E. albidus 019 024 027 032 031 ISO 16387 (2004): Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) - Determination of effects on reproduction and survival OECD test 220 (2004): Enchytraeid Reproduction Test logo_mu_cerne.gif Timetable IMG_3446_1 IMG_3370 IMG_3465 IMG_3364 logo_mu_cerne.gif Avoidance test s E. albidus 24 hodin 1 2 3 Ø 8,4 cm 4 5 WORM0_3.JPG (27190 bytes) 10 dospělců 10 opakování 2 x 10 g půdy Hledání živých roupic v obou polovinách odpad artificiální půda Např. testování odpadů logo_mu_cerne.gif Bioakumulační test s máloštětinatci logo_mu_cerne.gif Testy s chvostoskoky nekotoxikologicky dlouho využívané organismy - první test na filtračním papíře byl již v roce 1956 s DDT n nVýhody: ndobře prostudovaná skupina půdních bezobratlých nekologická relevance nširoce rozšířené, abundantní v půdách nlehce vzorkovatelní nlze je chovat v laboratoři nrelativně rychlý životní cyklus s vysokou reprodukcí n nnejčastěji užívaným druhem je Folsomia candida nomnivor (řasy, bakterie, prvoci, detritus) nlehká kultura npartenogenetická povaha neposkytuje příliš ekologicky relevantní obrázek n ni další druhy: Folsomia fimetaria, Isotoma viridis, Onychiurus armatus, O. quadricellatus, Orchesella cincta, Tullbergia granulata isotsp01 logo_mu_cerne.gif Postup testu s F. candida nKultivace nna petriho miskách či jiných nádobách, kde je na dně štuková sádra (pH 6,4) a aktivní uhlí (pH 6-7) smíchané v poměru 8 až 10 ku 1, 100g směsi + 60-100g vody = dostatečná vlhkost; uhlí pohlcuje exkrety ntmavé pozadí umožňuje pozorování n20-22°C; 70-80% rel. vlhkost vzduchu; 400-800lx npotravou jsou kvasnice párkrát týdně npo 8 týdnech je nutné přemístit do nové misky (tím se spouští ovipozice) n nSynchronizace nshluk vajíček se přemístí do nové nádoby; po 48h. odstranit zbylá vajíčka a krmí se juvenilové nnebo čerstvě vylíhlí jedinci se dají do nové nádoby a po nakladení vajíček se odstraní dospělci n nmanipulace pomocí exhaustoru dechového či automatického logo_mu_cerne.gif Folsomia candida 005 008 logo_mu_cerne.gif Test s F. candida n30g AS + na počátku 2mg sušených kvasnic + 10 jedinců F.c. (10-12 dní staré) a těsně zavřít nádobky npo 28 dnech (případně po době, než se vylíhnou potomci z vajíček nakladených dospělci) se sleduje přežití a potomstvo (F1) nflotační metoda na konci pokusu nendpointy jsou reprodukce (produkce vajíček), růst, změny v chování, přežití nREFERENČNÍ LÁTKA: Betanal plus (160g/L Phenmedipham) či E605 forte (507,5g/L Parathion) efekt na reprodukci 100-200mg první látky a 0,1-0,18mg druhé nVALIDITA TESTU: v kontrole ne více než 20% mortalita a minimum 100 juvenilů na jednu testovací nádobu logo_mu_cerne.gif 021 Folsomia candida 023 024 028 031 NS4 ISO 11267 (1999). Soil Quality - Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants OECD (2009): Collembolan Reproduction Test. Proposal of the new guideline logo_mu_cerne.gif Testy s hlísticemi LHlístice jsou de facto vodní organismy – žijí v pórové vodě LNesnadná extrapolace na reálné podmínky JVelmi rychlé testy – krátký životní cyklus JHlístice jsou nejpočetnější půdní bezobratlí JExistují varianty s půdou jako matricí n nCaenorhabditis elegans, Panagrellus redivivus, Plectus acuminatis n logo_mu_cerne.gif Caenorhabditis elegans chov a test J3 stage P.redivivus body1a ASTM: E2172-01 Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity Tests with the Nematode Caenorhabditis elegans nC. elegans se chová na agarových plotnách s nárůstem E. coli nNutné jsou aseptické techniky a opatrné zacházení nNěkolik medií – NGM – Nematode Growth Medium, LB – agar, K – roztok apod. nPo 1-2 měsících se přesazuje na nové plotny nPři nedostatku potravy se vyvinout tzv. Dauerovy larvy logo_mu_cerne.gif C. Elegans test nProtože testovací organismy by měly být stejné věkové a váhové kategorie, použije se synchronizovaná kultura nematod: ošetření kultury roztokem chlornanu a hydroxidu sodného (SAVO) - vajíčka rezistentní, dospělce usmrtí; pak cca 3-4 dny staré hlístice n npřipraví se varianty půd ve větších objemech; poté na petriho miskách (Ø 3,5) menší navážky + testovací organismy (10 jedinců) n npo 24h. pokusu (20°C ve tmě) se provede speciální extrakce (Ludox® - koloidní suspenze) + centrifugace; nematoda jsou na povrchu supernatantu - přemístíme je na petriho misku s médiem a počítají se mrtví jedinci (bez pohybu při dráždění); spočítá se LC50 n nkontrola pro validitu měření by měla mít 80% výtěžnost nematod z půdy a v kontrole 90% přežívání n npokud je test delší než 24h. musíme zajistit potravu - inokulum E.coli n logo_mu_cerne.gif Postup 082 nKontaminovanou půdu lze připravit předem nNutný je kvalitní mikroskop nTento test je méně ekologicky relevantní než ostatní půdní testy: n - hodně vodné fáze n - krátké trvání n = rychlý screeningový test logo_mu_cerne.gif Testy s prospěšnými členovci nexistuje pojem "užiteční členovci", spojen s ochranou před účinkem pesticidů na necílové organismy, například na pavouky, hmyz a roztoče které jsou přímo prospěšné, neboť v ekosystémech fungují proti škůdcům (predátoři a parazité škůdců) n nexistuje skupina IOBC (International Organisation for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants) - připravila cca 30 testů v 3 stupňovém schématu hodnocení rizik (vychází z testů BBA a spolupracuje s BART) n ncca 6 testů na blanokřídlých n4 testy na broucích n2 testy na dvoukřídlých njeden na síťokřídlých njeden na plošticích n3 na roztočích njeden na pavoucích njeden na patogenní houbě logo_mu_cerne.gif Půdní biotesty s vyššími rostlinami logo_mu_cerne.gif Testy s vyššími rostlinami nvelké množství – obtížná přehlednost ndřívější testy zaměřené na klíčivost semen a elongaci kořene jsou označovány jako poměrně necitlivé a málo relevantní pro ekologii npro relevantnější interopretace byly vyvinuty testy vícegenerační s možností studia subletálních účinků n nNejpoužívanější endpointy n 1.Klíčivost semen (půdní roztok) - nerelevantní 2.Elongace kořene (půdní roztok či půda) 3.Růst sazenic 4.Produkce biomasy 5.Životní cyklus (změny hmotnosti, počet květů, semen ..) 6.Enzymatický test 7.Fyziologické testy (fotosyntéza, respirace) logo_mu_cerne.gif nsemena jsou exponovány v substrátu (křemenný písek), půdě toxické látce či přímo v kontaminované půdě z terénu a po 5 dnech se sleduje klíčivost - direct test nrelativně necitlivý: semeno má bariéry pro vstup látky a energeticky je soběstačné, látka ho nemůže stresovat npostupy se v detailech liší, někdy bývá přímo spojen (US EPA) se sledováním délky kořene njindy se ale vliv na délku kořene sleduje jako nepřímá expozice v roztoku n Test inhibice růstu kořene Sinapsis alba n72 hodin jsou semena vystavena roztoku látky (+kontrola) n20°C; 5ml roztoku na petriho misku; 30 semen na misku; tma nstanoví se délka kořene a počet vyklíčených semen hypokotyl délka kořene Testy klíčivosti a elongace kořene logo_mu_cerne.gif Test růstu kořene nISO 11269-1(1993): Soil quality -Determination of the effects of pollutants on soil flora – Part1: Method for the measurement of inhibition of root growth nrozšířená se salátem Lactuca sativa nPRINCIP: Měří se délka kořenů předklíčeného salátu v kontrole a zkoušeném vzorku po 5 dnech inkubace. Ekotoxicita vzorku je stanovena jako statisticky významný rozdíl v délce kořenů zkoušeného vzorku ve srovnání s kontrolou, popř. se stanoví hodnota EC50 z koncentrační (ředící) řady. logo_mu_cerne.gif Podmínky zkoušky •Teplota: 24°C ± 2°C •pH: 6,0 – 8,0 •doba expozice: 120h ± 2h •množství vzorku: 200 až 300 g vlhkého vzorku na zkušební nádobu •počet zkoušených semen – 15 předklíčených semen v jedné zkušební nádobě •počet paralelních stanovení: 3 až 5 •ostatní podmínky - bez osvětlení logo_mu_cerne.gif Postup - detaily lPředklíčení semen - na vrstvě filtračního papíru zvlhčené demineralizovanou vodou po dobu 36h až 48h, při laboratorní teplotě bez regulace osvětlení. Pro zkoušku se vybírají naklíčená semena s kořínkem, který je kratší než 2 mm. n IMG_0215 logo_mu_cerne.gif Postup - detaily •Do nádoby se naváží 200 až 300 g zkoušeného vzorku nebo kontroly se známou sušinou, zvlhčeného na hodnotu 70% ± 5 % WHC •pravoúhlá síť např. 5 x 3 bodů •do jamek asi 1 cm hlubokých se pinzetou rovnoměrně rozmístí po 15 naklíčených semenech kořínkem směrem dolu •semena se k zemině přitlačí, zeminou se nezakrývají a takto připravené nádoby uzavřené víčkem se umístí do termostatu s teplotou 24°C ± 2 °C bez přístupu světla •po 5 dnech se salát šetrně oddělí od vzorku a změří se a zaznamenává délka kořenů ve zkoušeném vzorku a v kontrole s přesností na 1 mm n logo_mu_cerne.gif Postup salát setý n IMG_0196 IMG_7022_al IMG_7021_al IMG_7034 logo_mu_cerne.gif Vyšší rostliny IMG_0511 IMG_0499 IMG_0502 IMG_0819 IMG_0825 ISO 22030 (2005): Chronic toxicity in higher plants plant01.jpg (54.086 Byte) logo_mu_cerne.gif Využití při registraci pesticidů logo_mu_cerne.gif Půdní ekotoxikologie vs biotesty nNení soubor půdních ekotoxikologických biotestů nPomáhá POROZUMĚT složitým vztahům mezi chemickými látkami, půdou a půdními organismy látka půda biota logo_mu_cerne.gif Půdní ekotoxikologie vs biotesty nChceme určit, jaká koncentrace chemické látky v půdě je bezpečná n n n n n n nChceme určit, jaké efekty a proč mají chemické látky a jejich směsi v půdách určitých vlastností v určitých podmínkách a jaké to bude mít důsledky a proč. n Funkční biotesty pro proveditelné hodnocení rizik Porozumění komplexní problematice