Histochemické techniky u rostlin Fixace Zalévání Krájení řezů Inkubace řezů Histologie a histochemie • původ názvu = z řečtiny: histos = tkáň logos = slovo, nauka • histologie - vědní disciplína, která se zabývá studiem mikroskopické stavby živočišných tkání a rostlinných pletiv • histochemie – chemické reakce na úrovni živočišných tkání a rostlinných pletiv • používají speciální techniky přípravy preparátů a mikroskop Fixace fyzikální – vymrazování chemická – fixativa koagulující (alkoholy, kyselina octová, kyselina chrómová, osmium - koagulace cytoplazmatických proteinů ničí jejich aktivitu a strukturu organel (např. mitochondrie) – fixativa nekoagulující – formaldehyd, glutaraldehyd - zachovávají aktivitu proteinů i organely (pro histochemii a EM) Fixace • zachování buněk a pletiv ve stavu co nejbližšímu k živému stavu • snížení strukturálních změn a změn chemického složení • strukturální proteiny a jiné sloučeniny se musí změnit na nerozpustné ve všech reagenciích, se kterými přijdou v průběhu celého procesu do styku • perfektní fixace = jen teoretická Histochemie histologická metoda užívaná k průkazu různých látek přímo v pletivech a buňkách • látkové složení • katalytická histochemie • imunohistochemie • lektinová histochemie • in situ hybridizace (ISH) Odběr materiálu • rychlý • pokud je nutná preparace – raději již ve fixáži • velikost vzorků přiměřená – pro rychlý průnik fixáže do celého objektu • volba segmentů podle plánovaného studia Formaldehyd • je plyn s bodem varu -21°C • používá se jako – vodný roztok plynu (37- 40%) formalín nebo – pevný polymer - paraformaldehyd • během skladování se zhoršuje kvalita formalínu vlivem tzv. Canizariho reakce, kdy vzniká kyselina mravenčí = prudké snižování pH – neutralizace, pufry • po primární vazbě na různé funkční skupiny se vytvářejí křížové vazby („kroslinky“) - dochází k zesíťování molekul proteinů = nekoagulační fixace Glutaraldehyd • bezbarvá kapalina štiplavého zápachu • je toxický a způsobuje vážné podráždění očí, nosu, krku a plic, bolesti hlavy, ospalost a závratě – pracovat v digestoři, dodržovat zásady práce s toxickými látkami! • používá se samostatně nebo ve směsi s formaldehydem • zesíťování bílkovin pletiva po fixáži GA je mnohem pevnější - způsobuje větší tvrdost pletiv Fixační směsi – FA (PFA) 4% formalín v 0,1M TRIS / HCl pufru, pH 7,2 (4 ml 36% formaldehydu +32 ml pufru ) • pufr pH 7,2: 0,2M TRIS 25 ml 0,1N HCl 45 ml doplnit destil. vodou do 100 ml • Doba fixace 2 hod. (u citlivějšího materiálu 0,5 hod. na ledu při 0oC) • Propírání fixáže a kryoprezervace 7,5 % sacharózou ve stejném pufru Kryostat – příprava řezů Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace Barvení in toto barvení celých objektů před zalitím a krájením řezů Barvení řezů řezy volné („free floating sections“) řezy přilepené na podložním skle • 1890 – Mayer: glycerol – bílek + fenol (thymol) • chromová želatina („gelatin and chrome alum“) • poly-L-lysin • podložní skla SuperFrost Ultra Plus® - není nutno používat adheziva • sušení na teplé ploténce Lepení řezů Látkové složení • ionty (Ca2+, Fe2+, Fe3+, Zn2+, Cu2+, Pb2+) • organické funkční skupiny • cukry, polysacharidy (škrob, celulóza, kalóza) • tuky • DNA, RNA • lignin Průkaz tuků • barví se barvivy rozpustnými v tucích • Sudan IV, sudanová čerň, olejová červeň, nilská modř • užívá se zpravidla fixace zmražením s následným krájením v kryostatu Důkaz DNA - Feulgenova reakce • hydrolýza 1N HCl – RNA se rozpustí – DNA hydrolyzuje částečně (odstraní se báze) • vznik aldehydových skupin • jejich následná reakce se Schiffovým reagens výsledek = nerozpustný červený reakční produkt Fluorescenční vizualizace DNA fluorescenční barvivo, které se silně váže na DNA může procházet přes intaktní membrány (= je toxické a mutagenní) může být použito pro barvení živých i fixovaných buněk často se používá pro barvení jader, detekci mykoplazmat a virové DNA v buněčných kulturách DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol Důkaz RNA • organely obsahující RNA se barví bazickými barvivy • např.: toluidinovou modří, methylenovou modří • RNA však není jedinou bazofilní látkou v pletivech tkáních - nezbytná negativní kontrola = kontrolní preparát inkubovaná ribonukleázou Cukry PAS (Periodic Acid – Schiff) - pozitivní látky: • polysacharidy(škrob, celulóza, kalóza, glykogen) • glykosaminoglykany/ mukopolysacharidy/ (hyaluronová kys., chondroitinsulfát) • proteoglykany • glykoproteiny(thyreoglobulin, kolagen) • glykolipidy(lipofuscin) Katalytická histochemie – lokalizace aktivity enzymů enzymy jsou katalyzátory většiny biochemických reakcí • zpravidla fixace zmražením nebo aldehydy Princip: • první reakce (histochemická): – enzym + substrát → reakční produkt • druhá reakce (vizualizační): – tvorba barevného nebo elektrondensního reakčního produktu Vždy nutnost kontrolních řezů (inaktivace, bez substrátu…) Katalytická histochemie – vizualizační reakce • precipitace s kationty kovů (Gomori) – vznik barevné nerozpustné soli Pb, Co • simultánní azokopulace – reakční produkt I. reakce (naftol) se převede na azobarvivo • indigogenní reakce – štěpení substrátu na indoxyl a jeho dimerace a oxidace na indigo • tetrazoliová metoda – redukce tetrazoliové soli na barevný formazan • spřažená peroxidázová reakce – oxidace DAB Klasifikace enzymů 1. hydrolytické enzymy (hydrolázy) – fosfatázy (hydrolyzují estery a amidy kyseliny fosforečné) • alkalické fosfatázy • kyselé fosfatázy • glukoso-6-fosfatázy • adenosin trifosfatázy – karboxylester-hydrolázy • nespecifické esterázy • lipázy • cholinesterázy – glykosidázy • kyselé -glukosidázy -glukosidázy -galaktosidázy • kyselé–-galaktosidázy -glukuronidázy • disacharidázy – peptidázy – sulfatázy 2. transferázy 3. oxidoreduktázy a. oxidázy i. cytochrom c oxidáza ii. peroxidázy b. dehydrogenázy i. koenzym-independentní dehydrogenázy 1. sukcinát dehydrogenáza 2. glycerol-3-fosfát-dehydrogenáza ii. tetrazolium reduktázy iii.koenzym-dependentní dehydrogenázy např. glutamát dehydrogenáza, malát dehydrogenáza, laktát dehydrogenáza… 4. lyázy Klasifikace enzymů Gomoriho průkaz aktivity kyselé fosfatázy (precipitace s kationty kovů) • řez pletivem + inkubační médium se substrátem štěpeným enzymem (např. glycerofosfát sodný) • uvolnění fosfátových iontů • jejich reakce s dusičnanem olovnatým výsledek: elektrodenzní precipitát Pb3(PO4)2 Indigo Indigofera tinctoria Indigofera sumatrana Isatis tinctoria dnes již vyráběné synteticky pro vlastní barvení řezů se nepoužívá, ale v histochemii jsou často používány tzv. indigogenní metody, při kterých je indigo výsledným produktem reakce detekce aktivity -glukosidasy: substrátem pro enzym je 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl--D-glukopyranosid kryostatový řez listem tabáku po inkubaci v médiu se substrátem tloušťka řezu 30m Indigogenní metoda 1. krok = štěpení substrátu enzymem 2. krok = dimerace a oxidace na indigo Indigogenní metoda histochemické lokalizace aktivity β-glukosidasy Zm-p60.1 substrát: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glukopyranosid transgenní tabák se Zm-p60.1 netransgenní kontrola inkubace celé rostlinky, kultivace 28 DAS na MS s t-Z Chmelík et al. 2010 Imunohistochemie • slouží k průkazu tkáňových či buněčných antigenů pomocí vazby mezi antigenem a protilátkou • antigeny = proteiny, glykoproteiny, proteoglykany • protilátky = sérové proteiny – imunoglobuliny (jsou vytvářeny plazmatickými buňkami) • v imunohistochemii se nejčastěji používá třída IgG Protilátka – imunoglobulin IgG skládá se ze čtyř polypeptidových řetězců spojených disulfidickými můstky: 2 identických lehkých řetězců a 2 identických těžkých řetězců vazebná místa pro receptory Epitopy • = specifické místo antigenu, na které se váže protilátka, (antigenní determinanta) • většina antigenů má více epitopů, které vyvolávají při imunizaci vznik skupiny různých protilátek (polyklonálních), namířených proti jednotlivým epitopům Monoklonální protilátkaPolyklonální protilátka Přímá metoda FITC TRITC Texas Red Cy3 Cy5 phycoeryt. HRP ALPase značení protilátky epitop Ab univerzálnější (různé primární protilátky (Ab1) reagují s jednou sekundární protilátkou (Ab2) citlivější FITC TRITC Texas Red Cy3 Cy5 phycoeryt. HRP ALPase Nepřímá 2-stupňová metoda Ab1 Ab2 Montáž řezů • nabarvené řezy je ještě potřeba zakonzervovat na podložním skle - říkáme „zamontovat“ • 1844 - J.E. Purkyně roku a jeho žák Oschatz popsali svoji metodu montování tak, že nabarvený řez prostě potřeli lakem. Užívali tzv. kopálovou pryskyřici, získanou z tropických stromů, ale znali již i kanadský balzám. Jejich preparáty z té doby jsou stále v dobrém stavu. • kanadský balzám se užívá dodnes, ale používají se i syntetické pryskyřice Odkazy na zajímavé stránky http://www.bristol.ac.uk/vetpath/cpl/histmeth.htm protokoly imunohistochemie http://www.ihcworld.com/antibody_staining.htm protokoly barvení pro pletiva zalitá v pryskyřici http://www.ebsciences.com/staining/orcein.htm encyklopedie http://en.wikipedia.org/wiki/Staining