Histochemická lokalizace kyselé fosfatázy metodou simultánní azokopulace (Beneš a kol. 1961 in Lojda a kol. 1979) Kyselá fosfatáza (AcP) = kyselá fosfomonoesteráza, ortofosfomonoester fosfohydroláza, 3.1.3.2 Enzym v kyselé oblasti katalyzuje hydrolýzu esterů ortofosforečné kyseliny s různými alkoholy a fenoly podle následujícího schematu: monoester o-fosforečné kyseliny + H[2]O AcP alkohol (fenol) + ortofosfát Kyselá fosfatáza navíc hydrolyzuje pyrofosfátové sloučeniny a působí jako transfosforyláza. Všeobecnými inhibitory jsou fluoridové a fosfátové ionty, naopak Mn^2+ ionty mohou enzym aktivovat, pH optimum je mezi 4 a 5. Kyselá fosfatáza je lokalizována hlavně v lysozomech. Existují též extra-lysozomální kyselé fosfatázy, které se vyskytují hlavně v ER a hyaloplazmě. Protože lysozomy se snadno zničí a kyselá fosfatáza zčásti není pevně vázána na strukturu, musí být zvláštní pozornost věnována předpůsobení pletiva. Aktivitu enzymu lze detekovat i na parafínových řezech, ale celková aktivita enzymu může být detekována jen na kryostatových řezech čerstvého pletiva metodou semipermeabilních membrán. K detekci aktivity kyselé fosfatázy lze použít azokopulace, Gomoriho srážecí reakce i indogenní metody. Univerzální metodou je simultánní azokopulace s naftol AS-BI nebo naftol AS-TR fosfátem jako substrátem a hexazonium-p-rosanilinem jako azokopulačním činidlem. Postup: A. příprava materiálu: 1. Odběr vzorků: nakrájíme přiměřeně velké segmenty kořenů a stonků - kořen kukuřice Zea mays, stonek kolopejky Kalanchoe blosfeldiana 2. Fixace vzorků: 4% formaldehyd v 0,05 M TRIS – HCl pufru, pH 7, 2. doba fixace 2 hod. (u citlivějšího materiálu 0,5 hod. na ledu při 0^oC). Pokud segmenty plavou na povrchu fixáže, infiltrujeme fixační směs při sníženém tlaku. 3. Oplach v 0,05 M TRIS – HCl pufru, pH 7,2 2 x 10 minut 4. Kryoprezervace: přenos vzorků do roztoků s rostoucí koncentrací sacharosy v 0,05 M TRIS – HCl pufru, pH 7,2 (3%, 5% a 7,5% sacharosa) 3 x B. Příprava kryostatových řezů 5. Zhotovení bločků: na vychlazeném bločku kryostatu zamrazíme základ média, na který přimrazíme segment, zakápneme stejným médiem a necháme dokonale zmrazit (7,5% sacharosa, želatina nebo TissueTec®). 6. Krájení řezů: při vhodném sklonu nože krájíme řezy přiměřené tloušťky a přeneseme je na podložní skla potažená chromovou želatinou (nebo na semipermeabilní membránu napnutou na skleněné epruvetě). 7. Sušení řezů na mírně vyhřáté ploténce pro zajištěna dokonalá adheze řezů. Řezy nalepené na podložní skla lze krátce skladovat v ledničce. C. Vlastní inkubace 8. a Inkubace řezů na podložním skle: přiměřené množství inkubačního média navrstvíme na řezy umístěné ve vlhké komůrce a necháme inkubovat. Doba inkubace: 30 – 60´ při 37°C, 1 – 2 hod. při RT nebo několik hodin v ledničce při 4°C). Při delší inkubaci za nižší teploty se vytváří reakční produkt jemnější granulace. 9. Oplach v destilované vodě 10. Postfixace: 4% formaldehyd v 0,05 M TRIS – HCl pufru, pH 7,2, (pro redukci bublinek v řezech) 2 - 4 hodiny 11. Oplach ve vodovodní vodě 12. Uzavření řezů do glycerol-želatiny (Při dehydrataci, obzvlášť při přechodu ze 100% EtOH do xylénu a uzavírání do pryskyřice dochází k eluci reakčního produktu a navíc barvivo není jasně lokalizováno. Proto se odvodnění nedoporučuje.) 13. b Inkubace řezů na semipermeabilní membráně: inkubační médium dvojnásobné koncentrace se smíchá se stejným dílem rozvařeného chladnoucího 1% agaru v 0,05 M TRIS – HCl pufru, pH 7, 2. Přiměřené množství inkubační směsi pipetujeme do epruvety na opačnou stranu semipermeabilní membrány. Po inkubaci se membrána oddělí od epruvety a provádí se stejné procedury jako u řezů přilepených na podložní skla. Příprava roztoků: 0,05 M TRIS-HCl pufr 1. zásobní roztok 0.2M TRIS (m.v. 121,14) 12,114 g do 500ml 2. zásobní roztok 0,1 N HCl (m.v.36,47) 4,16 ml do 500 ml pro pH 7,2: 250 ml 0,2M TRIS + 450 ml 0,1N HCl doplnit do 1000 ml destilovanou vodou 4% formaldehyd v TRIS / HCl pufru, pH 7,2 (8 ml 36% formaldehydu +64 ml pufru ) 3% sacharosa v TRIS / HCl pufru, pH 7,2 (3 g sacharosy do 97ml TRIS/HCl pufru) 5% sacharosa v TRIS / HCl pufru, pH 7,2 (5 g sacharosy do 95ml TRIS/HCl pufru) 7,5% sacharosa v TRIS / HCl pufru, pH 7,2 (7,5 g sacharosy do 92,5 ml TRIS/HCl pufru) Hexazonium-p-rosanilin Ostrost, s jakou jsou zobrazeny lysozomy na řezech, závisí především na koncentraci hexazotizovaného p-rosanilinu. Čím vyšší koncentrace, tím ostřejší je zobrazení lysozomů. Avšak s rostoucí koncentrací kopulačního činidla roste také žluté vybarvení pozadí řezů, hlavně po fixaci glutaraldehydem. Navíc při vyšší koncentraci hexazotizovaného p-rosanilinu je nebezpečí silnější inhibice kyselé fosfatázy. Pokud pracujeme s pletivy s vysokou aktivitou kyselé fosfatázy, doporučuje se vyšší pH inkubačního média a zvýšení koncentrace diazoniové soli pro zvýšení rychlosti azokopulace, i když získáme silnější žluté vybarvení pozadí. Naopak při nižším pH a nižší koncentraci diazoniové soli bude pozadí řezů čiré a místa s nižší enzymatickou aktivitou budou snadněji zobrazena, avšak místa s vysokou aktivitou budou zbarvena difúzně. Příprava hexazonium-p-rosanilinu roztok A bazický fuchsin (kvalita pro Schiffovo reagens) 400 mg rozpustit v destilované vodě 8 ml koncentrovaná HCl (36%) 2 ml míchat do rozpuštění a filtrovat roztok lze skladovat po měsíce při uložení v ledničce při 4°C roztok B 4% NaNO[2] roztok lze skladovat max. 1 týden při uložení v ledničce při 4°C. Těsně před použitím smícháme stejné objemy roztoku A a roztoku B. Pokud je barvivo dobré kvality, směs krátce po přidání dusitanu zežloutne. Hnědé zbarvení ukazuje na špatnou kvalitu barviva nebo na nedokonalou diazotaci, či ztrátu HCl. Výsledkem inkubace s takovou směsí jsou neuspokojivé výsledky (Lojda a kol. 1979). hexazonium p-rosanilin Inkubační médium naftol AS BI nebo AS-TR-fosfát 20 – 25 mg rozpustit v N,N-dimethylformamidu (DMFA) 1 ml pufrovaný hexazotizovaný p-rosanilin (nebo new fuchsin), pH5 – 5,5 (připraví se smícháním 2 ml hexazotizovaného-p-rosanilinu a 48 ml 2% acetátu sodného) 50 ml pečlivě zamíchat a po chvíli stání zfiltrovat Výsledek: Místa s aktivním enzymem jsou zbarvena červeně. Literatura: 1. Beneš K., Lojda Z. and Hořavka B. (1961): A contribution to the histochemical demonstration of some hydrolitic enzymes in plants. – Histochemie 2: 313 – 320. 2. Gahan P.B. (1984): Plant Histochemistry and Cytochemistry. – 301 pp., Academic Press London etc. 3. Lojda Z., Gossrau R. and Schiebler T.M. (1979): Enzyme histochemistry. A Laboratory manual. – 339 pp., Springer Verlag, Berlin etc.