Jméno:                                                                                  Datum:

Téma 12: Testování bakteriální a houbové kontaminace kultur explantátů


Přítomnost latentních mikroorganismů v kultuře in vitro ovlivňuje její růst a vývoj, množitelský
koeficient i aklimatizaci.

Při kultivaci na klasických médiích používaných pro explantáty se kontaminace mikroorganismy nemusí
vždy hned projevit. Často se kontaminace manifestuje až po dlouhodobé kultivaci. Segmenty listů,
kořenů nebo prýtů pěstovaných kultur se proto při testování inkubují na různých selekčních médiích,
které jsou pro rozvoj mikroorganismů příhodnější.

Testování infekcí v in vitro kulturách je nutné i pro certifikaci těchto kultur, která je
požadovaná při prodeji nebo výměnách.

Bakteriální kontaminaci kultur testujeme na širokospektrém médiu LW = Leifert and Waites Sterility
Test Medium (Leifert et al. 1989) nebo na médiu B523 (Viss et al. 1991).


Materiál:

Segmenty kultur prýtů africké fialky (Saintpaulia ionantha Wendl.), orchidejí (Potinara hybr.),
nodální segmenty bramboru (Solanum tuberosum L.), karafiátů (Dianthus sp.) a apod.


Média:

            LW testovací medium = MS médium + B5 vitamíny 2,2 g.l^-1, masový extrakt 7,0 g.l^-1, ,
         pepton 4 g.l^-1, NaCl 2,0 g.l^-1, glukosa 5 g.l^-1, sacharosa 15 g.l^-1, kvasniční extrakt
10           g.l^-1,     0,8% agar

testovací medium B523 = kaseinhydrolyzát 8 g.l^-1, MgSO[4] . 7 H[2]O 0,15 g.l^-1, K[2]HPO[4] 2
g.l^-1, kvasničný extrakt 4 g.l^-1, 1% sacharosa, 0,8% agar

kontrola = MS médium: makro a mikroelementy MS, vitamíny B5, 2% sacharosa, 0,6% agar, pH 5,7


Postup:

1.    Vyjmi prýty sterilní pinzetou z kultivační lahve a polož je na sterilní Petriho misku
v aseptických podmínkách laminárního boxu.

2.    Odděl apikální segmenty prýtů a inokuluj je do udržovacího média pro další kultivaci.

3.    Rozřež zbylé prýty na jednotlivé nodální segmenty a tenké řezy.

4.    Do agarového B523 média zanoř segment (řez), pomalu jej vytáhni, polož na povrch media a
misku uzavři. Tímto postupem se inokulují i spodní vrstvy media s nízkou koncentrací O[2], která
podporuje růst některých anaerobních mikroorganismů.

5.    Stejným způsobem inokuluj i kontrolní misku s udržovacím MS médiem.

6.    Popiš misky s odpovídajícími segmenty, disky a apikálními segmenty prýtů.

7.    Inkubuj inokulované Petriho misky ve tmě při 22-30˚C po dobu 3 týdnů.

8.    Po inkubaci vyhodnoť kontaminace sledovaných kultur.


Hodnocení:

V následujících týdnech kontroluj čistotu kultur.

Kolonie na povrchu pevného média nebo halo v médiu indikují přítomnost kultivovatelných
mikroorganismů v kultuře.

Porovnej projevy kontaminace odpovídajících testovaných kultur na testovacím a MS médiu.

Zapiš výsledky do protokolu.


Literatura:

Leifert C., Waites W. M. et Nicholas, J. R. (1989): Bacterial contaminants of micropropagated plant
cultures. - J. Appl. Bact. 67:353-361.

Leifert C. et Cassels A.C. (2001): Microbial hazards in plant tissue and cell cultures. - In Vitro
Cell. Dev. Biol. - Plant 37:133-138.

Viss P.R., Brooks E.M. et Driver J.A. (1991): A simplified method for the control of bacterial
contamination in woody plant tissue culture. - In Vitro Cell Dev. Biol. - Plant 27: 42-  .