Hybridizace doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2013 Obsah přednášky 1) Způsoby provedení hybridizace 2) Hybridizace v roztoku 3) Příprava značených sond 4) Hybridizace na pevném povrchu 5) Southern ův přenos 6) Fluorescentní in situ hybridizace literatura Tentokrát se musíte spolehnout na základní literaturu + odkazy na odborné publikace uvedené v přednášce Hybridizace > reasociace dvou jednořetězcových DNA nebo RNA, pokud mají jejich sekvence úplně nebo částečně komplementární báze ..........i i i I I I I I I I I I I I I I I I I I i i i i i i i i i i i i i i........ j > nemyslí sejí ale spojování jednořetězců, které byly součástí téže molekuly) = renaturace Hybridizace je založena na schopnosti NA denaturovat a renaturovat pH ^ PH dvojšroubovice DNA denaturace renaturací se obnoví na jednoduché řetězce dvojšroubovice DNA (po narušení nukleotidových (znovu se spojí nukleotidové páry) párů) © Espero Publishing, s.r.o. Co to je denaturace DNA > oddělení komplementárních vláken DNA působením vysoké teploty (90-100°C), extrémních hodnot pH nebo denaturačních činidel (formamid, močovina) > Při denaturaci se zvyšuje absopce světla při vlnové délce 260 nm (tzv. hyperchromní efekt) > Je to důsledek změny v uspořádání bází Co to je hyperchromní efekt > Spojené řetězce snižují absorbanci > Při denaturaci absorbance stoupá o 30-40% > Řetězce drží pevně pohromadě dokud se nedosáhne Tm, pak se duplex rychle rozpadá Temperature, "C http://members.tripod.com/arnold_dion/RecD NA/Fig1-7.gif Co to je renaturace DNA > opětná tvorba dvou řetězcových struktur z jednořetězcových polynukleotidů za vhodných připojovacích („annealing") podmínek > nastává při pomalém ochlazování (65°C) roztoku teplem denaturované DNA > nenastává při prudkém ochlazení roztoku denaturované DNA > při renaturaci se mohou tvořit hybridní molekuly DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA > rozsah renaturace odpovídá rozsahu komplementarity sekvencí Faktory ovlivňující tvorbu hybridů > teplota > koncentrace solí > stupeň komplementarity > délka fragmentů DNA RNA strand DNA strand Nucleic Rcid Hybridization Využití hybridizace > test komplementarity sekvencí (ve směsi mnoha molekul DNA budou hybridizovat jen ty, které jsou dostatečně komplementární) > detekce molekul DNA a RNA, které jsou komplementární k jakékoliv izolované nukleové kyselině > vyhledávání sekvencí v genových knihovnách > vyhledávání sekvencí v cytologických preparátech > charakterizace sekvencí > mapování genomu > při polymerázové řetězové reakci Typy hybridizací > hybridizace v roztoku > hybridizace na pevném povrchu > hybridizace in situ (FISH) - mapování chromozómů a specifických lokusů > DNA, RNA arrays Hybridizace v roztoku Samotná se téměř nevyužívá, většinou spojená s další detekční technikou > S1 mapování (detekce exonů a intronů hybridu DNA/mRNA) > Denaturační gradiendová gelová elektroforéza (DGGE) > Heteroduplexní analýza S1 mapovaní Význam pro mapování složených genů ^%AS^S^n^ hybrid ,^V\v^S1^clease ^Hi Páry CG drží více pohromadě než páry TA \ HegMVieaHng ot angle strands \ hurnodiipion h«1e«x)uplex heteroduplax homodmtex 1 Mr-tnng beharvtouf Denaturing gradem gel wťm m/m (b) I lna easing dtKwiTiiraiit M«l*roduptam» Hornovi uptexes Podobně funguje TGGE Analýza heteroduplexů > Molekuly dsDNA vznikají z řetězců, které pocházejí z různých zdrojů > Výsledné struktury nejsou 100% komplementární, z toho plyne označení heteroduplex > Obsahují smyčky a bubliny v oblastech, kde se sekvence DNA liší > Struktury lze pozorovat mikroskopicky -heteroduplexní mapování Podívejte se na heteroduplexní mapování v základní učebnici Analýza heteroduplexů Heteroduplexy se pohybují pomaleji než homoduplexy Wlld Typ* ioooooo0dooooooc loooooofooooooet Mi i/ HotjKoAjplaxfts dup*** Analýza heteroduplexů Homoduplexy a heteroduplexy lze rozlišit i kapilární elektroforézou Temperature Modulated Heteroduplex Analysis Widtypfi Mutant Hsíeroduptexss Hornod telexes fMHUH 5-1 mV 4 5 5 Retention tims (mih) Hybridizace na pevném povrchu > Probíhá na speciální membráně > Vzorek se nanáší přímo na membránu = tečková hybridizace (dot blot) > Vzorek se rozdělí na gelu a pak se přenese na membránu = Southernův přenos (Southern blot) > Základem hybridizace je obvykle značená sonda o známé nukleotidové sekvenci Blotting = přenos > Southern blotting (Dr. Edwin Southern) = DNA > Northern blotting = RNA > Western blotting = proteiny > southwesternový přenos - proteiny vázající se na DNA (sondou je DNA) > north wester nový přenos - proteiny vázající se na RNA (sondou je RNA) K čemu se využívá Southernův přenos > Identifikace přítomnosti genu v materiálu vůbec > Identifikace genu za účelem jeho klonování > Využívá se tam, kde je dostupné pouze malé množství vstupního materiálu nebo je vysoké pozadí Příprava hybridizačních sond Sondy radioaktivně značené > Nick translace > Vyplnění jednořetězcových konců > Nahodilé značení > Zpravidla se využívá radioaktivní fosfor 32P Sondy fluorescenčně značené > Značení biotinem > Značení digoxigeninem > Značení křenovou peroxidázou > Citlivější, bezpečnější, dnes už používané častěji Nick translation Posun jednořetězcového zlomu DMaü pApGpCpTpApCpGpApCpGpCpTpApTpT pTpCpGpApTpGpCpTpGpCpGpApTpApA Pancreatic DNasel OOl -f- 6X0 GM H pApG CpTpApCpGpApCpGpCpTpApTpT PTpCpGpApTpGpCpTpGpCpGpApTpApA I 1.5' 3' exonuclease \ E. coh DNA 2. 5' 3' polymerase / polymerase I dATP. dCTP-» " dGTP, oTTP T t" TT*?? pApGpCpTpApCpGpApCpGpCpT ApTpT PTpCpGpApTpGpCpTpGpCpGpApTpApA www.ncbi.nlm.nih.gov Zopakujme si: Klenowův fragment > syntéza ve směru 5 - 3' > exonukleázové odbourávání ve směru 3 - 5' > tam, kde se neodbourává primer > sekvenování, značení DNA 5' 3' Značení konců nukleových kyselin A) 5 0: □ 3 B) t AATTCC Gc f> AATTCC TTAAGC n 5' AATTCC Polynucleotide kinase □ 3' galo/-tofl DMA J Digest with restriction nuclease to give 5' overhangs (e.g. EcoRI) □ G 3' □ CTTAA 5' 1 Klenow DNA polymerase d ATP- dTTP D GAATT 3' □ CTTAA 5 Restriction nuclease cleavage at internal site to give different sized fragments T T H GAATT TTAAGI-= * • Purify D CTTAA Purify Key: T Labeled nucleotide www.ncbi.nlm.nih.gov Nahodilé značení „random primer DNA labeling" = prostřednictvím náhodných hexanukleotidů 5' 3 — I Denature and anneal in presence of mixture of random hexanucleotides 5 3' 3' 5 Klenow subunit of DNA polymerase __„j; -j, dATR dCTP -+ dGTP. dTTP 3<ř 5< i 1 i 1 1 .T TT_T T T T iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii i 5' f Labeled nucleotide www.ncbi.nlm.nih.gov Značení bíotínem Lze využít všech tří základních postupů > Nick translace > Vyplnění jed no řetězcových konců > Nahodilé značení biotin-dUTP 11111111111 ........... 11111111111 ........... značeni 4 4 detekce avidinem s fluorescenční značkou <- hybridizace 11111111111 11111111111 11111111111 11111111111 11111111111 11111111111 Praktická aplikace značení sond Příprava sond pro diferenciaci kmenů M. a. paratuberculosis Celkem 3 sondy detekující části inzerční sekvence \S900-inzerční sekvence specifické pro M. a. paratuberculosis l Psřl-1045bp \S900 Celková sonda - 958bp Sonda 1 -412b Sonda 2 - 303b Základní kroky při přípravě sond > Amplifikace specifických fragmentů PCR > Purifikace amplikonů > Značení sond peroxidázou > Kontrola koncentrace sondy Značení sondy dsDNA povaření a ochlazení komplexy peroxidázy pozitivně nabité Značení sondy peroxidáza se váže k DNA špatně glutaraldehyd peroxidáza se váže k DNA kovalentně Detekce peroxidázou značené sondy H202 detekční reagencie 1 o matricová DNA značená sonda 02" + H20 zesilovač o luminol detekční reagencie 2 NH2 IH2 + světlo o o Postup při Southernově přenosu 1. rozdělení fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou 2. denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonový filtr („blotting") 3. inkubace filtru se značenou jed n o řetězcovou sondou: hybridizace sondy s komplementární sekvencí imobilizovanou filtru 4. odmytí nenavázané sondy 5. detekce navázané sondy - vizualizace hybridů Southern blotting fragmenty DNA na elfo gelu filtrační papír r denaturace NaOH membrána přenos DNA z gelu na membránu otisk DNA na membráně inkubace se značenou cDNA vyvolání RTG filmu Southern blotting stoh papírových ručníků (AI neznačen* DNA rozštěpená reštrikční nukleézou odstranění mtrocelulosového papíru s pevná navázanou DNA nitrocelulosová membrána gel značené DNA různé velikosti slouží jako standardy agarosovy gel FRAGMENTY DNA JSOU ODDĚLENY ElEKTROFOREZOU NA AGAROSOVEM GELU mycf houba alkalický roztok ODDĚLENÉ FRAGMENTY DNA PŘENESENY NA NITR0CELUL0S0VOU MEMBRÁNU ZNAČENA DNA-SONDA JE HYBRIDIZOVANA S ODDĚLENOU DNA zalepený plastický sáček označená DNA-sonda v pufru OZNAČENA DNA-SONDA HYBRIDIZOVANA S KOMPLEMENTÁRNÍM PRUHY DNA JE ZVIDITELNĚNA AUTORADIOGRAFlI (El proutky značených standardů značené proujky z pokusu © Espero Publishing, s.r.o. Způsoby přenosu („blottingu") > kapilární přenos > elektroforetický přenos > vakuový přenos Kapilární přenos Elektroforetický přenos Vakuový přenos Fluorescentní in situ hybridizace fluorescence in situ hybridization (FISH) Metoda sestává ze tří základních kroků > Fixace vzorku na mikroskopickém sklíčku > Hybridizace značené sondy k homologickým fragmentům na genomové DNA > Enzymatická detekce hybridů sonda-cílová sekvence > Sondy radioaktivně značené > Sondy fluorescenční: rychlejší, silnější signál, simultánní diferenciace různých cílů Ukázky FISH fluorescence in situ hybridization FISH v mikrobiologii > Umožňuje detekci i nerostoucích bakterií > Sonda je druhově specifická a míří zpravidla ke genu pro 16S rRNA > Metoda je vhodná pro fylogenetické, ekologické, diagnostické a environmentálni studie > Kombinuje preciznost molekulární biologie s mikroskopickým pozorováním > Je možno pozorovat výskyt bakterií v kontextu s morfologickou charakteristikou napadené tkáně > Citlivost až jediná bakterie, metodicky mimo PCR Typický FISH protokol 4 základní kroky 1) Fixace a permeabilizace vzorku 2) Hybridizace 3) Promývací kroky -odmytí nenavázané sondy 4) Detekce značených buněk mikroskopicky nebo průtokovou cytometrií Charakteristika sond Dlouhé 15 až 30 nukleotidů Fluorofor Barva Excitace Emise Alexa 488 zelená 493 517 Cy3 červená 552 565 Cy5 červená 649 670 DAPI modrá 350 456 Fluorescein zelená 494 523 Rodamin červená 555 580 TAM RA červená 543 575 Texas red červená 590 615 Zodpovězte otázku Jak dlouhá musí být minimálně sonda, aby našla jedinou specifickou sekvenci v bakterii, jejíž genom má velikost 4,0 x 106 bp? 4,0 x 106 = 4X ln(4,0x106) = Xln(4) X = ln(4,0x106)/ln(4) X = 11 Jak označit sondu? Přímé značení koncové značení 3'- koncové značení Jak označit sondu? Nepřímé značení Reportérova molekula V 4 digoxigenin Značení enzymem v 4 HRP Jak označit sondu? Nepřímé značení - polyribonukleová sonda Dvě hlavní oblasti využití FISH v mikrobiologii > Analýza vzorků potravin > Studium biofilmů • ♦/ fy i * - • - v " • ■ - v 1«1 1 • Green fluoresáng cefts {£. ooíi) Yeltow íluc-rescing oells (K. pneunvntae) Redfluoresoing oeJb (P. aĚrvgmosa) Moced Positive Varianty FISH ACM-FISH ■ e-FISH ■ QD-FISH armFISH ■ Fiber-FISH ■ Rainbow-FISH CARD-FISH ■ Flow-FISH ■ Raman-FISH catFISH ■ Fusion-Signal ■ ReD-FISH CB-FISH FISH ■ Reverse-FISH CO-FISH ■ Halo-FISH ■ RING-FISH COBRA-FISH ■ Harlequin-FISH ■ RNA-FISH COD-FISH ■ Immuno-FISH ■ RxFISH COMBO-FISH ■ LNA-FISH ■ Split-Signal FISH Comet-FISH ■ M-FISH ■ T-FISH Cryo-FISH ■ ML-FISH ■ 3-D FISH D-FISH ■ PCC-FISH ■ Zoo-FISH DBD-FISH ■ PNA-FISH ■ Q-FISH BioTechniques 45:385-409 (October 2008) Další čtení Bottari B (2006): Application of FISH technology for microbiological analysis: current state and prospects. Appl Microbiol Biotechnol (2006) 73:485-494 http://www.nottingham.ac.Uk/biosciences/divisions/food/r esearch/projects/foodmicrobiology.aspx http://www.rapidmicrobiology.eom/news/1431h22.php Vybrané aplikace hybridizačních technik v mikrobiologii > Poly m orf ismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) > Ribotypizace > Metoda reverzní hybridizace > Metoda spoligotypizace A více se dozvíte v 5. ročníku Shrnutí 1) Způsoby provedení hybridizace 2) Hybridizace v roztoku 3) Příprava značených sond 4) Hybridizace na pevném povrchu 5) Southern ův přenos 6) Fluorescentní in situ hybridizace