Polymerázová řetězová reakce
doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.
bartosm@vfu. cz
Přírodovědecká fakulta MU, 2013
Obsah přednášky
1) Co je to PCR, princip, jednotlivé kroky
2) Technické provedení PCR
3) Fyzikální faktory ovlivňující PCR
4) Chemické faktory ovlivňující PCR
Polymerázová řetězová reakce
Dnes nejrozšířenější metoda molekulární biologie
Kdo za to může ?
Princip PCR
Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction - PCR) umožňuje selektivní zmnožení (amplifikaci) určité oblasti DNA v podmínkách in vitro; a
to procesem, který připomíná replikaci DNA in vivo
nově syntetizovaný řetězec
DNA matrice
Komponenty PCR
PCR probíhá v cyklech
denaturace annealing
1. PCR cyklus
1. denaturace (92-96°C)
dsDNA
2. annealing (45-72°C)
primární produkty
3. extenze (72°C)
/
Primární produkty nás nezajímají!
2. PCR cyklus
sekundární produkty
Jenže sekundární produkty nás taky
nezajímají
3. PC R cyklus
A teď se podívejte, jak rychle se amplikony
tedy
mnozí amplifikují.
Další cykly
iiiiiiiiiiiiiiiiiiii
....................
iiiiiiiiiiiiiiiiiiii
....................
iiiiiiiiiiiiiiiiiiii h
.................... ^ _
iiiiiiiiiiiiiiiiiiii
^^^^ iiiiiiiiiiiiiiiiiiii
....................
iiiiiiiiiiiiiiiiiiii
....................
Z každé molekuly amplikonu vznikají dvě nové Počet amplikonu vzrůstá geometricky
„Zázrak" amplifikace
> Každý amplikon je složen ze dvou řetězců = dvě matrice, které se v dalším cyklu zase zdvojí
> Počet amplikonu extrémně vzrůstá oproti počtu primárních a sekundárních produktů
> Po několika cyklech už amplikony v reakčních produktech naprosto dominují
> Primární a sekundární produkty tvoří jen minoritní složku ve výsledných produktech PCR
Množení a mplikonu
Cyklus č.	Primární	Sekundární	Amplikony	Celkem (proX=1)
0	0	0	0	1
1	2	0	0	2
2	2	2	0	4
3	2	4	2	8
4	2	6	8	16
5	2	8	22	32
Obecně	2x	x(2n-2)	(2n-2n)x	(2n)x
X = počet matríc na počátku, n = počet cyklů
Množení amplíkonů - pověst o vzniku šachové hry
Výtěžek PCR
Cyklus č.	Primární	Sekundární	Amplikony	Celkem
10	2	18	1 004	1 024
20	2	38	10 485 438	1 0242
30	2	58	~ 1.1 x 109	1 0243
40	2	78	~ 1.1 x 1012	1 0244
50	2	98	~ 1.1 x1015	1 0245
r
A teď" nás čeká šílené počítání! ©
Výtěžek PCR - příklad
Kolik cyklů PCR musíte použít, aby bylo možno detekovat amplikony o velikosti 500 bp vzniklé z jedné kopie dsDNA ?
Zařízení (transluminátor) detekuje 5ng DNA.
Výtěžek PCR - řešení
Musí proběhnout alespoň 34 cyklů
Řešení je uvedeno v samostatném souboru
ve Wordu
Délka a specifičnost amplikonů
je dána pozicí primerů na cílových sekvencích DNA-matrice
ACTACGCAAGCATAGTAA
T TAGC T AC C AAAGC AT AG
„Syntéza DNA probíhá jen ve směru 5'^ 3". Tak to příroda
stvořila! Tedy primery musí začínat 5-koncem a končit 3'- koncem. Na 3'- konci je OH skupina, ke které se připojuje vstupující
Narůstání nukleotidového řetězce
o
Primer forward
> musí svým 3- koncem směřovat „dovnitř" budoucího amplikonu
> je komplementární ke „spodnímu" řetězci
> ale má sekvenci „horního" řetězce
TGATGCGTTCGTATCATT
AATCGATGGTTTCGTATC
forward
AC TACGCAAGCATAGTAA
T TAGC T AC C AAAGC AT AG
Primer reverse
> musí svým 3- koncem směřovat „dovnitř" budoucího amplikonu
> je komplementární k „hornímu" řetězci
> ale má sekvenci „dolního" řetězce
ACTACGCAAGCATAGTAA . , T TAGCTACCAAAGCATAG
POZOR !!!
Primery se zapisují ve směru 5*3'5 tedy 5 - konec nalevo a 3 - konec napravo
Platí to jak pro primer forward (kde je to jednoduché), tak pro primer reverse - podívejte se na další snímek, jak to dopadne !!!
Jak zapsat primery „na papír"
Ačkoli na schématu leží primery takto:
TGATGCGTTCGTATCATT .......................................AATCGATGGTTTCGTATCI
forward
reverse
ACTACGCAAGCATAGTAA....................................... TTAGCTACCAAAGCATAgI
Napsat „na papír" je musíte takto
forward
reverse
A co když se spletu ?
Podívejte se, co se stane
Když napíšete primer reverse takto
reverse
> syntéza z obou primerů bude probíhat ve stejném směru
> nebude docházet k amplifikaci
TGATGCGTTCGTATCATT
forward
AC TACGCAAGCATAGTAA
T TAGC T AC C AAAGC AT AG
Když napíšete primer reverse takto
reverse
> polymerace z takového primem nemůže probíhat, řetězce nejsou antiparalelní
forward
AC TACGCAAGCATAGTAA
T TAGC T AC C AAAGC AT AG
A teď" zase nějaká otázka! ©
Návrh primem - příklad
Napište sekvenci primerů, které by mohly amplifikovat vyznačenou část daného úseku dsDNA
- znáte sekvenci jen jednoho z řetězců
- primery pište ve směru 5 - 3'
5 TGA TGC AAA GTT CGC TCA GGT ACG ATT CCC AAA TGT GGA GCT TAG TCG ATG ATG GGC AAA TCT GTG ATT ATC CGA CGT CCC ATG TGC GTC AAA TGC CGT AGG ACC CTA TTT TGA CGT CCT GCT GGT ACG CAT CAT CCC TGG TGA CGT CCT ACG TGC TGC GCT CGC ACG ATG CGT ACG AAC
GCT CGT CGG - 3 '
Jak dlouhý bude vzniklý amplikon ?
Návrh primerů - řešení
Primer forward
AAA GTT CGC TCA GGT ACG -
Primer reverse
CGT ACG CAT CGT GCG AGC -
Amplikon bude mít délku 171 bp
Vlastnosti primem i
> zodpovědné za specifičnost PCR
> délky 14 až 40 nukleotidů
> obsah G+C od 40% do 75%
> primery by měly být navrženy tak, aby se jejich
cílové sekvence nacházely v konzervativních oblastech sledovaného genomu
> 3 - konce jednoho primem by měly obsahovat
takové sekvence nukleotidů, které nejsou komplementární k sekvencím druhého primem
> pokud z primem vznikají tzv. dimery, znesnadňuje to annealing
Vlastnosti primem II
> žádné palindromy
> žádné sekundární struktury
> ne nebalancované rozložení domén bohatých na G/C aA/T
> použití sekvencí oligo (dT) a poly (dC) ve struktuře primerů nemá na jejich funkci vliv
> 5 - konec primeru je méně citlivý k modifikacím
^reštrikční místa, GC-svorky, sekvence promotoru
> koncentrace v rozsahu 0,1 -1,0 |iiM
Technické provedení PCR
Termocyklery
^mikroprocesorem kontrolované zařízení, které obsahuje kovové reakční bloky vyhřívané a chlazené polovodiči (Peltierova pumpa), vodou, vzduchem nebo mikrovlnami
< -
9 m'
Termocyklery dokáží automaticky rychle měnit teplotu v reakčních blocích mezi třemi základními teplotami PCR cyklu
Vlastnosti termocyklerů
1) Vysoká přesnost teploty v reakčním bloku, uniformita a reprodukovatelnost teplotního profilu v reakčním bloku
2) Uniformita a srovnatelnost teplotních profilů mezi jednotlivými reakčními bloky
3) Minimální „přestřelování" teplot při zahřívání a nebo chlazení
4) Vysoká reprodukovatelnost jednotlivých amplifikačních cyklů
Co se děje uvnitř termocykleru ?
Konec reakce
| 3,5
=5, 2'5
E 2
+- 1,5 O
>o 1
o
Q. 0,5
Výsledek PCR
záznam z elektroforézy v agarózovém gelu
100 bp ladder
Faktory ovlivňující PCR
Faktory fyzikální
1) Počáteční denaturace
2) Připojení primerů
3) Syntéza nukleotidových řetězců
4) Počet cyklů
5) Závěrečná extenze
Faktory chemické
1) Množství Taq polymerázy
2) Reakční puf r
3) Množství dNTP
4) Primery
5) Objem PCR reakce
6) Kvalita DNA
Fyzikální procesy ovlivňující PC R
Počáteční denaturace
> jednorázové zahřátí PCR směsi na teplotu 94-96X po dobu přibližně 3-5 minut
> dokonalá denaturace genomové DNA a odbourání všech struktur, které by bránily připojení primerů k cílovým sekvencím
> následné připojení primerů je velmi efektivní
> nesmí být příliš dlouhá - poškození řetězců DNA a ničení Taq polymerázy
Horký start
> denaturace po dobu 10-15min,
> termolabilní komplex s jiným proteinem
> rekombinantní připojení haptenů
> vosk na rozhraní PCR směsi a Taq poly m e rázy
> Taq polymeráza zalitá v agaróze ve víčku PCR zkumavky
Připojení příměrů - annealing
> rozhodující pro specifičnost
> připojení primerů závisí na teplotě, době annealingu, koncentraci matrice, koncentraci primeru
> vysoká teplota = primery se nepřipojí
> nízká teplota = vznikají nespecifické produkty
Ta = (počet G+C) x4 + (počet A+T )x2
Gradientovy termocykler
45°C Ta 65°C
Záznam z gradientového termocykleru
Syntéza nukleotidových řetězců
> probíhá při 72°C
> pro fragmenty o velikosti do 500bp se doporučuje ne delší než 20s
> pro fragmenty do 1,2 kbp asi 40s
> rychlost Taq polymerázy činí 150 připojených nukleotidů/sekundu
Počet cyklů
> analytická PCR - ne více než 40
> nejčastěji 25-35 cyklů
> vyšší počet cyklů vznik nespecifických artefaktů
> vyčerpávání komponent reakce
> degradace polymerázy i DNA
Například při vyčerpání primerů se zbývající nukleotidy účastní syntézy nespecifických produktů, které vznikají po vzájemném annealingu již vzniklých amplikonů a výsledkem jsou delší amplifikační produkty vytvářející „šmouhy" na elektroforetickém gelu
Závěrečná extenze
> slouží k dokonalému dosyntetizování všech produktů
> probíhá po dobu 5-15 min. při 72°C
> poté je možné produkty amplifikace uschovat a následně analyzovat
Chemické procesy ovlivňující PCR
1) Množství Taq polymerázy
2) Reakční pufr
3) Množství dNTP
4) Primery
5) Objem PCR reakce
6) Kvalita DNA
Množství Taq polymerázy
> 0,5-2,5 jednotky, což odpovídá 25-125 fmol enzymu
> zvýšená koncentrace Taq polymerázy v reakci snižuje specificitu
> v současné době je k dispozici řada různých Taq polymeráz a jejich směsí
> vysoká termostabilita a přesnost začlenění správného nukleotidu do struktury DNA (tzv. fidelity)
> fidelity je závislá na koncentraci volných Mg2+ a nukleotidů, na správném vybalancování podílu nukleotidů, na pH a podílu poškozené DNA v reakci
Reakční puf r
> kofaktor Taq polymeráz = ionty Mg2+ ve formě MgCI2 nebo MgS04
> Koncentrace Mg2+ se pohybuje v rozmezí 0,5-5,0 m M (1,5 m M)
> lonty ovlivňují aktivitu enzymu, zvyšují Tm dvoušroubovicové DNA a tvoří rozpustné komplexy s nukleotidy, což je proces nutný k inkorporaci nukleotidů do DNA
Množství dNTP
> závisí na délce amplifikačních produktů
> koncentraci Mg2+
> koncentraci primerů
> nastavení teplotního profilu reakce
> Tím, že se nukleotidy vážou na Mg2+, snižují hodnotu Ta
> Do struktury DNA jsou v podmínkách in vitro účinně začleňovány při koncentracích kolem 10 uM, což jsou ale hodnoty nižší, než ty, které se používají při PCR (100-200 uM)
Objem PCR reakce
> ovlivňuje výsledek v míře menší než faktory uvedené doposud
> objemy reakčních směsí 20 až 100 ul
> PCR v kapilárách - reakční objemy až 10 ul
Kvalita DNA
> jedním z rozhodujících faktoru
> přítomnost řady látek, které ovlivňují průběh PCR
> Čistota DNA ovlivňuje zejména citlivost
> V řadě případů působí jako negativní faktor už pouhé zmrazení vzorku, přičemž zvlášť negativní je jeho opakované zamražování a rozmrazování
> PCR je kompletně inhibována látkami jako jsou heparin, EDTA, porfyriny a jim podobné sloučeniny a ionty HxP04n\
> homogenita vzorku a množství DNA vložené do reakce.
Shrnutí
1) Co je to PCR, princip, jednotlivé kroky
2) Technické provedení PCR
3) Fyzikální faktory ovlivňující PCR
4) Chemické faktory ovlivňující PCR
PCR před a po
Kde si můžu přečíst více? www.farmakogenomika.cz
A ještě něco pro ty, kteří rádi
počítají
Příprava příměrů - příklad
V jakém množství rozpustíte lyofilizovaný vzorek primerů, aby jeho koncentrace byla 100uM ?
Vzorek obsahuje 138,6 ug primeru
Molekulová hmotnost tohoto primeru
(o délce 18 nukleotidů) je 5 119
Příprava příměrů - řešení
ve 271 yl
Použití primerů - příklad
Jaké množství primeru ze zásobního roztoku 100uM napipetujete do PCR reakce o objemu 20ul jestliže chcete do reakce dát 10pmol primeru ?
Použití příměrů - řešení
1M roztok.........1mol částic / litr (1umol částic / ul)
1mM roztok......1nmol částic / ul
1uM roztok......."Ipmol částic / ul
100 p M roztok.......lOOpmol částic /ul
10pmol částic.....0,1 ul