trpaslici 03 miRNA siRNA snRNA snoRNA shRNA gRNA piRNA ØHistorie objevu ØNekódující malé RNA v buňce ØCo to je RNA interference ØMechanismus RNA interference ØsiRNA a miRNA, biogeneze, shody, rozdíly ØÚloha miRNA v ontogenetickém vývoji ØpiRNA, aRNA a další … ØVyužití RNAi ve farmacii ØRNA interference u prokaryot ØNovinky ØObjeveny v roce 1998 u Caenorhabditis elegans ØNobelova cena v roce 2006 (Andrew Fire a Craig Mello, University of Kansas, USA) 1159856183 V té době o DNA, natož o RNA nikdo nic nevěděl ØRich Jorgensen a kolegové vložili gen produkující pigment do petunií ØMísto silné pigmentace se objevily rostliny variegované a dokonce bílé ØJorgensen pojmenoval tento fenomén "cosuppression” Napoli et al., Plant Cell, 1990 Ø7SK snRNA (ovlivňuje transkripci u člověka vazbou na elongační faktory) ØSRP RNA (ovlivnění translace, jsou součástí SRP “signal recognition particle”) Øsoučást telomerázy (úloha při replikaci) ØXIST RNA (inaktivace X chromozómu) ØgRNA (úloha při editaci RNA) ØmicroRNA (miRNA) ØsiRNA siRNA RNA interference = posttranskripční umlčování genů, tzv. „gene silencing“ miRNA shRNA (short hairpin) piRNA Øje komplementární k primárnímu transkriptu a vazbou na něj jej inhibuje Øpřepisuje se z pozitivního DNA-řetězce C C T A A G T G C A A G G A T T C A C G T T - + C C T A A G T G C A A UCA CG UU mRNA G G A T T C A C G T T AGUGCAA antisense RNA hybridní RNA AGUGCAA C G T A G C A T A A C A G U G siRNA miRNA Ø přímý vliv Ø transport virovými částicemi Jev RNA interference koliduje s koncepcí transkripčních faktorů Transkripční faktory sice spustí vlastní transkripci, ale interferující RNAi rozhodnou o tom, které transkripty budou použity Primitivní imunitní systém Obrana buňky proti virové infekci Virus = dsRNA Buňka detekuje dsRNA = POZOR, může to být VIRUS ! Vzniklý mechanismus obrany proti virům byl následně adaptován u eukaryotických buněk, u kterých slouží jako regulační mechanismus rychlého zablokování translace u aktuálně „nepotřebných“ transkriptů Byla RNAi evoluční fenomén vedoucí k mnohobuněčným? To umožňuje ontogenetický vývoj Denli AM and Hannon GJ, Trends in Biochemical Sciences, 2003 Komplex DICER Komplex Argonaute transgenní dsRNA prekurzor miRNA In vitro syntéza dsRNA virová dsRNA transposonová dsRNA heterochromatinová dsRNA tvorba hetero-chromatinových domén štěpení mRNA inhibice translace degradacemRNA ØsiRNA Ømetylace sekvencí v promotoru Transkripce ØsiRNA, miRNA, piRNA Ødegradace mRNA Øinhibice úprav mRNA Øzablokování translace Øaktivace interferonu ? Posttranskripční procesy transkript delší sekvence dsRNA (stovky bp) štěpení na krátké úseky (24 až 26 bp) vazba na promotor metylace inhibice transkripce vazba k 3´- konci mRNA degradace dsRNA stabilizace dsRNA ! Objeveny jen u rostlin, živočichů a hub pri-miRNA (stovky až tisíce bp) Øvětšinou transkripce z oblastí, kde nejsou geny strukturní Øale i uvnitř intronů nebo exonů Økoordinovaná transkripce s hnRNA pri-miRNA (100s-1000s bp) odštěpení okrajů a vznik pre-miRNA (70 bp, vlásenka) RNA polymeráza II RNáza III - DROSHA export do cytoplasmy úprava na dsRNA = miRNA/miRNA* (21 bp) RNáza III - DICER degradace miRNA* akce miRNA mirna biogen siRNAs nebo miRNA je inkorporována do „RNA-induced silencing complex“ (RISC) Na základě homologie siRNA nebo miRNA k mRNA způsobí RISC komplex degradaci této mRNA gen pro miRNA-155 (pre-miRNA-155) zralá miRNA-155 interakce miRNA-155 s cílovou sekvenci Øobojí regulují expresi ØsiRNA má původ v dsRNA ØsiRNA často souvisí s cizorodou RNA (obvykle virovou) a je 100% komplementární ØmiRNA pochází z molekul ssRNA, která formuje vlásenkové dsRNA struktury ØmiRNA reguluje post-transkripční genovou expresi siRNA ØdsRNA Øochrana před viry a transpozony Øochrana před nadprodukcí Øzpůsobují degradaci cílových molekul Øabsolutní komplementarita s cílovou sekvencí miRNA ØssRNA (vlásenky) Øregulace ontogeneze a vývojových procesů Ønezpůsobují degradaci, jen blokádu translace Økomplementarita s cílovou sekvencí není absolutní Øvznikají činností RNA polymerázy II živočichové rostliny Rostliny Živočichové Nachází se: intergenové oblasti intergenové oblasti, introny Shluky miRNA: vzácné běžné Mechanismus působení: mRNA-štěpení represe translace Místo vazby na mRNA: otevřený čtecí rámec 3′- konec ambion1 ROSTLINY ŽIVOČICHOVÉ KVASINKY, ROSTLINY, živočichové degradace mRNA regulace translace regulace transkripce ØRegulace přesmyku exprese genů z mateřské mRNA do mRNA zygoty (viz. skripta) ØIndukce imunitní odpovědi u rostlin 1)Po ataku pseudomonádami transkripce specifických miRNA (miR393) 2)Ty inhibují expresi receptorů pro auxiny a tím auxinové signální dráhy 3)To vede ke snížení citlivosti k bakteriální infekci Existuje ale i alternativní systém mimo miRNA ØPůsobí jako signál během časných vývojových fází. Tento signál se zapamatuje i pro pozdější vývoj prostřednictvím na RNAi závislých epigenetických mechanismech jako je například tvorba heterochromatinu. ØU rostlin se miRNA podílejí na funkci meristému, vzniku orgánové polarity, vývoji vaskulárních struktur, vývoj květu a odpovědi na hormonech. ØTéměř polovina transkripčních faktorů je cílovou molekul miRNA. nematostella Øobjeveny v myším spermatu Øvyskytují se u obratlovců i bezobratlých Øtvoří komplexy s Piwi proteiny Øpůsobí na ontogenezi (nejsou-li transkribovány nevznikají spermatické buňky) Øtransportují miRNA k cílovým sekvencím !!! Ødélka 26 až 31 bp Øin silico analýzou bylo popsáno 52 934 kandidátních molekul piRNA u myší, 52 099 u člověka a 47 024 u krys Øvznikají z několika málo clusterů mimo genové oblasti jako ssRNA Ømodulují transkripci ? Øpodílejí se na skladování RNA v procesních tělískách ? Øspekuluje se též o jejich možném podílu na přenosu dědičné informace jinými mechanismy než je replikace DNA ? Ømohou působit na úrovni histonů, DNA nebo RNA ? Ømožná štěpí cílové sekvence nebo mění strukturu chromatinu ? ? ØAnalýza funkce genů ØNové genové terapie ØNové antivirové vakcíny ØTransgenní organismy s dočasně vyblokovanou funkcí určitého genu ØPoužití iRNA nespadá pod nakládání s GMO ØPoužití kazet produkujících iRNA ale ano ! 1)Primárně - RNAi jako antivirové látky, blokují replikaci virového genomu a expresi virových genů. Nejčastěji uvažovaným cílem RNAi terapie je virus HIV. 2)Kontrola genové exprese ovlivňováním epigenetických změn v lokální struktuře chromatinu. 3)Předpokládá se, že 35% až 70% lidských genů je přepisováno do transkriptů hnRNA, které podléhají alternativnímu sestřihu. Defekty v procesu alternativního sestřihu vedou k řadě onemocnění. RNAi by mohla být použita k zablokování defektně sestřižených struktur a v důsledku toho k inhibici exprese defektního genu. 4) RNAi mohou být zacíleny proti genům, které jsou spojeny s metabolickými poruchami. Například v léčbě diabetes mellitus typu II, kde centrální roli v rezistenci k inzulínu hrají poruchy signalizace v důsledku změn v expresi genů. 5) Genové „knock-outy“ v genomu původce malárie, Plasmodium falciparum, mohou sloužit ke studiu jeho životního cyklu a k vyhledávání nových terapeutických cílů, kromě toho, že terapeutikem by mohly být samotné RNAi. ØPopsány v listopadu 2006 skupinou z „University of California, San Francisco, USA“ ØTento jev byl pro vědeckou komunitu překvapivý, protože ho po objevu siRNA, miRNA, piRNA aj., už nikdo nepředpokládal ØNejedná se přitom o nepřímý účinek spočívající ve vypnutí genu, což ve svých důsledcích vyvolá aktivaci genu jiného, ale o vliv přímý ØMechanismus účinku RNAa ale doposud nebyl objasněn – novinky v listopadu 2007! ØRNAi vypínají geny zpravidla na dobu 5 až 7 dnů, RNAa aktivuje geny na dobu 13 dnů Odbourávání mRNA Stabilizace sekvence ARE vede k indukci genové exprese ! miR369 chrání sekvence ARE a tím degradaci mRNA ! General scheme of messenger RNA decay pathways. (A) The regulation of gene expression involves the control of mRNA degradation at the post-transcriptional level. mRNAs containing an AU-rich element (ARE) in their 3' untranslated region (UTR) undergo rapid ARE-mediated mRNA decay (AMD) in resting cells. Stabilization of ARE-containing mRNAs by various stimuli contributes to the induction of gene expression. (B) Quality control mechanisms activate mRNA degradation. mRNAs that contain a premature termination codon (PTC) are recognized and specifically degraded by the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway. (C) The basic mRNA decay machinery in the cytoplasm initially removes the poly(A) tail through the activity of deadenylating enzymes. Subsequently, the mRNA can be further degraded from the 3' end by a complex of 3'–5' exonucleases known as the exosome. Alternatively, the mRNA is decapped at the 5' end, and the 5'–3' exonuclease Xrn1 proceeds to degrade the body of the mRNA. Autoři článku vyslovili předpoklad, že regulace translace prostřednictvím částic microRNP osciluje mezi represí a aktivací v závislosti na fázi buněčného cyklu Vasudevan et al. (2007): ScienceXpress, November 29, 1-4 Øv proliferujících buňkách reprimují translaci Øve fázi G1/G0 (která často předchází diferenciaci) translaci aktivují 1) Jako léčivo mohou být využity samotné RNAa 2) To, že malá interferující RNAi může působit nejen jako negativní ale i pozitivní regulátor znamená, že při jejich použití se musí zvažovat hledisko nejen očekávaného vlivu na terapeutický cíl (ve smyslu negativní regulace), ale také možné vedlejší účinky na geny jiné (ve smyslu jejich možné aktivace) Sheilagh Molloy (2007): First evidence of prokaryotic RNAi? Nature Reviews Microbiology 5, 329. První zmínka v roce 2007? CRISPR Brouns et al. (2008): Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes, Science 321, 960-964 ØVyužívá interní „antivirové“ sekvence začleněné v obrácených repeticích (CRISPR) ØCRISPR = clusters of regularly interspaced short palindromic repeats ØPo transkripci této sekvence dochází k jejich postupnému štěpení Cas proteiny ØVýsledné produkty interferují s nukleovou kyselinou vstupujícího viru V roce 2008 byl popsán RNAi analogický systém určený k degradaci virových NA Ke konci roku 2008 byly CRISPR popsány u asi 40% sekvenovaných eubakterií a téměř všech archeí Všechny obsahují krátké repetice o délce 24 až 48 nukleotidů a mezerník o přibližně stejné délce Marraffini a Sontheimer (2008): Science 322, 1843 - 1845 repetice mezerníky Edgar (2007): BMC Bioinformatics 8:18 Marraffini a Sontheimer (2008): Science 322, 1843 - 1845 Mezerník v oblasti CRISPR kóduje crRNA Sekvence crRNA je homologická ke genu nickase, který se vyskytuje téměř ve všech konjugativních plasmidech rodu Staphylococcus Vazba crRNA k nickase brání konjugaci a transformaci plasmidů K interferenci dochází na úrovni crRNA-DNA, nikoli crRNA-mRNA CRISPR ve svém důsledku brání šíření rezistence k antibiotikům Horizontal gene transfer (HGT) in bacteria and archaea occurs through phage transduction, transformation, or conjugation, and the latter is particularly important for the spread of antibiotic resistance. Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat (CRISPR) loci confer sequence-directed immunity against phages. A clinical isolate of Staphylococcus epidermidis harbors a CRISPR spacer that matches the nickase gene present in nearly all staphylococcal conjugative plasmids. Here we show that CRISPR interference prevents conjugation and plasmid transformation in S. epidermidis. Insertion of a self-splicing intron into nickase blocks interference despite the reconstitution of the target sequence in the spliced mRNA, which indicates that the interference machinery targets DNA directly. We conclude that CRISPR loci counteract multiple routes of HGT and can limit the spread of antibiotic resistance in pathogenic bacteria. P. Horvath et al., Science 327, 167-170 (2010) Obr. 3: Interference CRISPR. Systémy CRISPR/Cas mohou být zacíleny na DNA nebo RNA. Interferují s viry, plasmidy, profágy nebo jinými sekvencemi nesenými na chromozómu. Fig. 3 CRISPR interference. The CRISPR/Cas systems may target either DNA or RNA to interfere with viruses, plasmids, prophages, or other chromosomally encoded sequences. Brouns, SJJ (2012): Science 337: 808-809 A)Nukleáza Cas9 rozpoznává cílovou sekvenci prostřednictvím crRNA a tracrRNA B)Procesu štěpení se účastní celkem 5 Cas proteinů; Cas3 je nukleáza a helikáza All-in-one nuclease.(A) Cas9 requires a crRNA and tracrRNA to recognize invader DNA sequences by hybridizing the guide section of the crRNA to one strand of the target DNA to form an R-loop. The flanking motif is critical for this process and may facilitate DNA duplex unwinding and strand invasion by the crRNA. Target DNA is then cleaved by both nuclease domains of Cas9. (B) Cascade-like complexes contain a single crRNA and up to five different Cas proteins. Identified invader DNA sequences are progressively unwound and cleaved by the action of the recruited nuclease and helicase Cas3 (11, 12). pasRNA = promotor associated RNA Buratowski (2008): Science 322, 1804-1805 Nukleozom2 3-4 DNA 1 Transkripčně aktivní je oblast mezi nukleozómy Krátké RNA vznikají transkripcí v obou směrech transkripce hnRNA ØpasRNA je vlastně jednoduchou antimediátorovou RNA Øvzniká současně s transkripcí hnRNA Øsyntetizuje je RNA polymeráza II ØpasRNA porušuje koncept promotoru ? ØProč existují promotory, když dochází k expresi více než 90% ? ØJsou dosud nepoznané promotory na 3´- konci transkripční jednotky ? ØJedná se o abortivní transkripci z nespecifických promotorů ? ØVytvořil jsem na základě modelu replikace DNA ØTranskripce a replikace RNA jsou evolučně starší než replikace DNA ØReplikace DNA obsahuje prvky replikace RNA jako evoluční relikt ori ori 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 5´ 3´ 3´ 3´ 5´ směr pohybu replikační vidlice DNA- gyráza helikáza SSB-proteiny RNA-primer, DNA primáza Okazakiho fragment vedoucí řetězec opožďující se řetězec DNA-polymeráza III TATA TATA 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 5´ 3´ 3´ 3´ 5´ po směru transkripce RNA polymeráza II hnRNA B-Okazakiho fragmenty RNAi typu PROMPT, promotor-associated RNA trpaslici 03 trpaslici 03 trpaslici 03 Vycházím ze včerejších informací ve Science (19. prosinec 2008), kde se články popisující „nově objevené“ druhy RNAi téměř snaží vymazat koncepci PROMOTORU. Pořád spekulují, jak mohou antimediátorové RNA vznikat bez existence promotorů na 3´- konci transkripční jednotky, spekulují o abortivních transkripcích vznikajících jako byprodukt standardní transkripce, apod. Napadlo mne, že malé antimediátorové RNA mohou vznikat stejně jako Okazakiho fragmenty při replikaci. Prostě tak, jak se komplex RNA polymerázy II naváže na starý dobrý promotor a začne transkripce „kontinuálního řetězce“ (hnRNA) tak tentýž komplex (v obrázku je to samozřejmě namalováno nepřesně – to i u té replikace, ale lépe to neumím) zahajuje postupně syntézy „B‑Okazakiho fragmentů“ (můj termín!), tedy prekurzorů interferujících RNAi. Myslím, že v tomto modelu nemusíme promotor zavrhovat (Bez promotorů by neexistovalo genové inženýrství ! Vždyť s nimi všichni pracujeme!) a máme model pro expresi jak vlastního strukturního genu, tak i jeho hlídačů. Model jsem nazval „semidiskontinuální transkripce“. Je i evolučně zajímavý, protože vlastní replikaci DNA odvozuje od evolučně staršího systému založeného na RNA, který už v sobě obsahuje kontinuální i diskontinuální syntézu nových řetězců. Takže žádná nutnost syntézy ve směru 5´- 3´, protože to DNA polymeráza jinak neumí, ale zase jen evoluční relikt z dob RNA říše! I když ta nutnost směru je obsažena už v té původní RNA koncepci. Samozřejmě, že to vzbuzuje další otázky, např. jak vlastně probíhá samotná replikace dsRNA? MCj04344070000[1] ØDlouhé interferují molekuly RNA (lncRNA) ØInterference při vývoji mozkové tkáně ØSouhra transkripčních faktorů a RNAi ØNové enzymatické funkce RNA lncRNA jsou předpovězené B-Okazakiho fragmenty Evolution and Functions of Long Noncoding RNAs 02 Ch.P. Ponting et al., Cell 136, 629-641 (2009) Figure 2. Possible Origins of lncRNAs (A) A protein-coding gene (left, pink) acquires frame disruptions and is transformed into a functional noncoding RNA (right, blue) that incorporates some previous coding sequence. The Xist lncRNA originated by undergoing a metamorphosis from a previous protein-coding gene while incorporating transposable element sequence. (B) Following a chromosome’s rearrangement, two untranscribed and previously well-separated sequence regions are juxtaposed and give rise to a multi-exon noncoding RNA. A dog noncoding RNA (supported by ESTs BM537447, C0597044, and DN744681) appears to have arisen following such a lineage-specific change. (C) Duplication of a noncoding gene by retrotransposition generates either a functional noncoding retrogene or a nonfunctional noncoding retropseudogene. (D) Neighboring repeats within a noncoding RNA have their origins in two tandem duplication events. (E) Insertion of a transposable element (green triangle) gives rise to a functional noncoding RNA. Ch.P. Ponting et al., Cell 136, 629-641 (2009) Figure 4. Mechanisms of lncRNA Function in Transcriptional Regulation LncRNAs are blue and protein-coding genes are pink, with pale pink regions indicating promoter/enhancer elements. (A) Transcriptional interference. Transcription of the lncRNA SRG1 through the promoter of the adjacent SER3 gene. (B) Initiation of chromatin remodeling. RNA pol II processivity upstream of fbp1 is normally repressed by Tup proteins, however, rare lncRNAs are transcribed. Upon glucose starvation, the Atf1 activator binds to the UAS1 element, facilitating chromatin remodeling by RNA pol II and the subsequent binding of Rst2 to a second UAS2 element. As further lncRNAs are transcribed, the chromatin structure around the fbp1 initiation site is then accessible to the transcriptional machinery allowing induction of the gene to occur. (C) Promoter inactivation by binding to basal transcription factors. Formation of a complex between an lncRNA and both the DHFR promoter and TFIIB prevents normal preinitiation of transcription. (D) Activation of an accessory protein. In response to stress, lncRNAs upstream of CCND1 form a complex with an RNA-binding protein TLS (translocated in liposarcoma) in which the inactive conformation of the protein is altered, facilitating repression of CCND1 via chromatin-binding protein (CBP). (E) Activation of transcription factors. The lncRNA Evf2 cooperates with the Dlx2 homeodomain protein to activate the Dlx5/6 enhancer. (F) Oligomerization of an activator protein. In response to heat shock, an lncRNA assists the trimerization of the HSF1 protein, which in turn forms a complex with the translation factor EIF to facilitate HSP expression. (G) Transport of transcription factors. Dephosphorylated NFAT is prevented from translocating to the nucleus and activating its targets due to interactions between the lncRNA NRON and importin proteins. (H) Epigenetic silencing of gene clusters by lncRNAs. The Xist, Kcnq1ot1, and Air RNAs establish a nuclear domain (or ‘‘coating’’) for gene silencing of genes in cis. The lncRNAs may directly or indirectly attract epigenetic modifiers such as histone methyltransferases (G9a or Ezh2) to bring about repressive epigenetic marks in the cluster. (I) Epigenetic repression of genes by an intergenic lncRNA in trans. HOTAIR RNA, transcribed within the HOXC cluster, interacts with the Polycomb repressor complex 2 (PRC2) resulting in the methylation and silencing of several genes in the HOXD locus. E. V. Makeyev et al., Science 319, 1789 -1790 (2008) O. Hobert Science 319, 1785 -1786 (2008) Salmena L. et al. (2011): Cell 146, 353-358, August 2011 1)Hypotéza, která se snaží osvětlit jak mRNA, transkripty pseudogenů a lncRNA interagují prostřednictvím tzv. „microRNA response elements“ (MRE) 2)Vytváří úplně nový komunikační jazyk 3)Vnáší termín „competing endogenous RNA“ (ceRNA) 4)Snaží se vysvětlit patologické procesy, např. vývoj nádorů Salmena L. et al. (2011): Cell 146, 353-358, August 2011 Salmena L. et al. (2011): Cell 146, 353-358, August 2011 Vztah mezi mRNA a miRNA je reciproký, hladina jedné mRNA ovlivňuje hladinu aktivitu jiné mRNA Konvenční logika ceRNA logika Salmena L. et al. (2011): Cell 146, 353-358, August 2011 Molekuly RNA vzájemně interagují prostřednictvím MRE elementů, větší počet sdílených MRE znamená širší komunikaci a koregulaci Konvenční logika ceRNA logika Salmena L. et al. (2011): Cell 146, 353-358, August 2011 3´-UTR oblasti molekul RNA obsahují MRE, které mohou být regulovány mechanismem cis, tedy ovlivňovat sebe sama, nebo mechanismem trans, tedy prostřednictvím miRNA ovlivňují jiné RNA Konvenční logika ceRNA logika Somel et al. (2011): MicroRNA-Driven Developmental Remodeling in the Brain Distinguishes Humans from Other Primates, Plos Biology 9 (12), e1001214, December 2011 1)Vývojové profily miRNA a jejich cílových genů vykazují 3-5x vyšší rychlost změn u lidí než u šimpanzů 2)miR-92a, miR-454, a miR-320b jsou pravděpodobně ty regulátory, které jsou zodpovědné za specifický vývoj nervové soustavy u lidí