Nukleové kyseliny
Molekulová hmotnost jednoho nukleotidu je 325.
a) Kolik molů obsahuje 1g DNA o délce 50 000 bp?
b) Kolik je to molekul?
c) Jakou hmotnost má 1 molekula takové DNA?
Řešení
Molekulová hmotnost DNA o délce 50 000bp = 2 x 325 x 50 000 = 32,5 x 106
a)
1mol uvedené DNA ….. má hmotnost ….. 32,5 x 106
g
x molů ….. má hmotnost .…. 10-6
g
----------------------------------------------------------------------------------------
X = 10-6
/32,5x106
= 31 x 10-15
molu
Jeden ug DNA o délce 50 000bp představuje 31 x 10-15
molu
b)
1mol ….. obsahuje ….. 6,023 x 1023
molekul
31 x 10-15
molu ..… obsahuje ….. x molekul
----------------------------------------------------------------------------------------------------
X = 6,023 x 1023
x 31 x 10-15
= asi 19 x 109
molekul
Odpověď:
Jeden ug DNA o délce 50 000bp obsahuje asi 19 miliard molekul
c)
1mol ….. 6,023 x 1023
molekul ….. má hmotnost ….. 32,5 x 106
g
1 molekula ….. má hmotnost ….. x g
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
X = 32,5 x 106
/6,023 x 1023
= asi 5,4 x 10-17
g = 55 x 10-18
g
Odpověď:
Jedna molekula DNA o délce 50 000bp má hmotnost asi 54 attogramů
Kolik molekul obsahuje 1μg DNA o velikosti
 40 000 bp
 50 000 bp
 400 000 bp
Řešení
6,023 x 1023
molekul ….. má hmotnost ….. 2 x 330 x velikost v bp (g)
x molekul ….. má hmotnost .…. 10-6
g
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
pro 40 000bp X = 6,023 x 1023
x 10-6
/2 x 330 x 40 000 = 22,8 x 109
molekul
pro 50 000bp X = 6,023 x 1023
x 10-6
/2 x330 x 50 000 = 18,2 x 109
molekul
pro 400 000bp X = 6,023 x 1023
x 10-6
/2 x 330 x 400 000 = 22,8 x 108
molekul
Odpověď:
Jeden ug DNA o délce 40 000bp obsahuje 22,8 x 109
molekul
Jeden ug DNA o délce 50 000bp obsahuje 18,2 x 109
molekul
Jeden ug DNA o délce 400 000bp obsahuje 22,8 x 108
molekul
Poznámka:
!!!!! Čím větší molekula, tím menší počet molekul na jednotku hmotnosti!!!!!
Doplňte následující tabulku:
Organismus Velikost DNA (bp) Molární hmotnost Hmotnost 1
molekuly
Počet molekul v
1g
Savci 3,0 x 109
1,95 x 1012
Drosophila 1,2 x 108
7,80 x 1010
S. cerevisiae 1,6 x 107
1,04 x 1010
Zea mays 3,9 x 109
2,54 x 1012
Escherichia coli 4,0 x 106
2,60 x 109
Bakteriofág  48 514 3,15 x 107
pBR322 4 363
pUC18 2 686
Řešení
Hmotnost jedné molekuly
6,023 x 1023
molekul ….. má hmotnost ….. M (molární hmotnost) g
1 molekula ….. má hmotnost ….. x g
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
X = M/6,023 x 1023
Počet molekul v 1g
6,023 x 1023
molekul ….. má hmotnost ….. M (molární hmotnost) g
x molekul ….. má hmotnost .…. 1 g
---------------------------------------------------------------------------------------------------------
X = 6,023 x 1023
/M
Odpověď:
Organismus Velikost DNA (bp) Molární hmotnost Hmotnost 1
molekuly
Počet molekul v
1g
Savci 3,0 x 109
1,95 x 1012
3,24 x 10-12
g 3,09 x 1011
Drosophila 1,2 x 108
7,80 x 1010
1,30 x 10-13
g 7,72 x 1012
S. cerevisiae 1,6 x 107
1,04 x 1010
1,73 x 10-14
g 5,79 x 1013
Zea mays 3,9 x 109
2,54 x 1012
4,22 x 10-12
g 2,37 x 1011
Escherichia coli 4,0 x 106
2,60 x 109
4,32 x 10-15
g 2,32 x 1014
Bakteriofág  48 514 3,15 x 107
5,23 x 10-17
g 1,91 x 1016
pBR322 4 363 2,8 x 106
4,65 x 10-18
g 2,15 x 1017
pUC18 2 686 1,7 x 106
2,82 x 10-18
g 3,54 x 1017
Máte k dispozici linearizovanou dsDNA fága  o koncentraci 50ug/ml
a) Kolik molekul obsahuje 1ml tohoto roztoku?
b) Kolik je to molů v 1 ml?
c) Jaká je molární koncentrace molekul dsDNA fága v roztoku?
d) Jaká je molární koncentrace konců molekul dsDNA fága v roztoku?
Řešení
a)
Máte k dispozici 50ug dsDNA fága
6,023 x 1023
molekul ….. má hmotnost ….. 3,1 x 107
g
x molekul ….. má hmotnost ….. 50 x 10-6
g
---------------------------------------------------------------------------------------------------------
X = 6,023 x 1023
x 50 x 10-6
/3,1 x 107
= 9,71 x 1011
molekul
Odpověď:
Jeden ml roztoku fága  obsahuje asi 9,71 x 1011
těchto molekul (literatura udává 9,78, to
ale záleží na tom, jaká M se použije pro nukleotid)
b)
1 mol ….. 6,023 x 1023
molekul
x molů ….. 9,71 x 1011
molekul
-------------------------------------------------------------------------------------
X = 9,71 x 1011
/6,023 x 1023
= 1,61 x 10-12
molů
Odpověď:
Jeden ml roztoku fága  obsahuje asi 1,61 x 10-12
molů molekul tohoto fága
c)
Odpověď:
Molární koncentrace molekul za výše uvedených podmínek je 1,61 x 10-9
molů = 1,61nM,
protože molární koncentraci počítáme v 1 litru. Kdybychom měli výše uvedených molekul 1 litr, bylo
by jich 103
x více.
d)
Odpověď:
Molární koncetrace konců je 3,22 protože konců je 2x tolik než jenom vlastních molekul
Jaká byla původní koncentrace DNA ve vzorku, jestliže po jeho naředění v TE pufru v poměru 1:9
vykazoval stejnou intenzitu záření jako vzorek standardu o koncentraci 25 ng/μl? Jak vzorku, tak
standardu jste nanesli na gel 5 μl.
Řešení
5 µl standardu ….. o koncentraci 25 ng/µl ….. je celkem 125 ng DNA
5 µl vzorku ….. o koncentraci X ….. je 10 x 125 ng DNA
5 µl vzorku ….. o koncentraci X ….. je 1 250 ng DNA
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1 250 ng/5 µl = 250 ng/µl
Odpověď:
Původní koncentrace DNA ve vzorku byla 250 ng/μl
Jak naředíte vzorek DNA o koncentraci 600 μg/ml tak, aby při nanesení 10μl na gel intenzita jeho
záření odpovídala 5μl standardu o koncentraci 100 ng/μl ?
Řešení
5 µl standardu ….. o koncentraci 100 ng/µl ….. je celkem 500 ng DNA
600 µg/ml = 600 ng/µl
10 µl vzorku ….. o koncentraci 600 ng/µl ….. je celkem 6 000 ng DNA
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
6 000 ng/500 ng = 12x
Odpověď:
Vzorek DNA naředíme 12x, tedy v poměru 1 díl DNA : 11 dílům pufru
Kolik molekul plasmidové DNA o velikosti 2 500 bp obsahuje 50 μl roztoku o koncentraci
100 ng/μl?
Řešení
M (1 bp) = 650
1) Určíme celkovou hmotnost plasmidové DNA v roztoku
50 µl roztoku ….. o koncentraci 100 ng/µl ….. 5 000 ng DNA
5 000 ng = 5 µg
2) Vypočteme hmotnost jednoho plasmidu
6,023 x 1023
bp ….. má hmotnost ….. 650 g
2 500 bp ….. má hmotnost ….. X g
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
X = 2 500 x 650/6,023 x 1023
g = 2,70 x 10-18
g = 2,70 pg
3) Vypočteme počet molekul
1 molekula plasmidu ….. má hmotnost ….. 2,70 x 10-18
g
Y molekul plasmidu ….. má hmotnost ….. 5 x 10-6
g
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Y = 5 x 10-6
/2,70 x 10-18
= 1,85 x 1012
molekul
Odpověď:
Roztok obsahuje 1,85 x 1012
molekul plasmidové DNA
Jak se můžete přesvědčit o tom, která z forem plasmidu pozorovaná na vašem izolátu
po elektroforéze je L-forma?
Odpověď:
Rozštěpením plasmidové DNA restrikční endonukleázou, která štěpí plasmid jen 1x. Všechny formy
se přemění na formu lineární.
Na uvedeném elektroforetickém snímku vyznačte různé formy plasmidu.
Odpověď:
Co lze říci o průběhu izolace plasmidové DNA, jestliže je na elektroforetickém gelu vidět pruh
denaturované DNA?
Odpověď:
Že lyze buněk probíhala příliš dlouho nebo za vysokého pH (vyššího než 12,45)
CCC-forma
OC-forma
multimery
denaturovaná DNA L-forma
chromozomální DNA
chromozomální DNA
po štěpení restriktázou
Kolik ředícího roztoku přidáte do 30 μl vzorku DNA o koncentraci 60 μg/ml tak, aby koncentrace
DNA po zředění klesla na 15 ng/μl?
Řešení
60 µg/ml = 60 ng/µl
Použijeme směšovacího pravidla
Odpověď:
Do vzorku DNA přidáme 90 μl ředícího roztoku
60
0
15
45
15
1
3
30
90
DNA
ředící roztok
: : :
Jaké množství plasmidu (v μl) přidáte do reakční směsi, potřebujete-li štěpit 500 ng plasmidu a je-li
jeho zásobní koncentrace 100 ng/μl ?
Řešení:
1 µl zásobní koncentrace ….. obsahuje ….. 100 ng plasmidu
X µl zásobní koncentrace ….. obsahuje ….. 500 ng plasmidu
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
X = 500/100 = 5 µl
Odpověď:
Do reakční směsi přidáme 5 µl plasmidu
Kolik molekul plasmidové DNA o velikosti 50 000 bp obsahuje 100 μl roztoku u něhož byla hodnota
absorbance při 260 nm po 10 násobném zředění rovna 0,15?
Řešení:
Jestliže je absorbance A260 = 1,0, pak má roztok DNA koncentraci 50 µg/ml
M (1 bp) = 650
1) Určíme koncentraci plasmidové DNA v roztoku
jestliže je A260 = 1,0 ….. pak koncentrace je ….. 50 µg/ml
jestliže je A260 = 10 x 0,15 ….. pak koncentrace je ….. X µg/ml
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
X = 10 x 0,15 x 50 = 75 µg/ml
2) Určíme celkovou hmotnost plasmidové DNA v roztoku
75 µg/ml = 75 ng/µl
100 µl roztoku ….. o koncentraci 75 ng/µl ….. 7 500 ng DNA
3) Vypočteme hmotnost jednoho plasmidu
6,023 x 1023
bp ….. má hmotnost ….. 650 g
50 000 bp ….. má hmotnost ….. Y g
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Y = 50 000 x 650/6,023 x 1023
g = 5,40 x 10-17
g
4) Vypočteme počet molekul
1 molekula plasmidu ….. má hmotnost ….. 5,40 x 10-17
g
Z molekul plasmidu ….. má hmotnost ….. 7 500 x 10-9
g
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Z = 7 500 x 10-9
/5,40 x 10-17
= 1,39 x 1011
molekul
Odpověď:
Roztok obsahuje 1,39 x 1011
molekul plasmidové DNA
Jedna jednotka restrikční endonukleázy (značí se u) je množství enzymu, které rozštěpí 1μg DNA
fága λ za optimálních reakčních podmínek při 37°C za 1 hodinu. Na molekule DNA fága λ je
celkem 6 štěpných míst pro restriktázu Hinf I. Jaké množství plasmidu pUC18 rozštěpí
1 jednotka restriktázy Hinf I za jednu hodinu, jestliže je na tomto plasmidu jen jedno
restrikční místo? Velikost plasmidu pUC18 je 2 686 bp.
Řešení:
Velikost DNA fága λ = 48 502 bp
1) Spočítáme počet molekul fága λ, které enzym Hinf I rozštěpí
6,023 x 1023
molekul ….. má hmotnost ….. 650 x 48 502 g
X molekul ….. má hmotnost ….. 1 x 10-6
g
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
X = 6,023 x 1023
x 1 x 10-6
/ 650 x 48 502 = 1,91 x 1010
molekul
2) Molekul plasmidu, které enzym Hinf I rozštěpí je 6x více
6 x 1,91 x 1010
= 11,46 x 1010
molekul
3) Spočítáme hmotnost 11,28 x 1010
molekul plasmidu pUC18
6,023 x 1023
molekul ….. má hmotnost ….. 650 x 2 686 g
11,46 x 1010
molekul ….. má hmotnost ….. Y
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Y = 11,46 x 1010
x 650 x 2 686/6,023 x 1023
= 3,32 x 10-7
g = 0,332 x 10-6
g = 332 ng
Odpověď:
Jedna jednotka Hinf I rozštěpí za daných podmínek 332 ng plasmidu
Jak dlouho bude štěpit 1u restrikční endonukleázy Hind III 200 ng plasmidu pUC18? Na tomto
plasmidu je jediné restrikční místo pro restriktázu Hind III.
Řešení:
Vyjdeme z výsledků předchozího příkladu
Podmínky štěpení Hind III jsou stejné jako v případě Hinf I
1 u Hind III rozštěpí ….. 332 ng plasmidu ….. za 60 minut
1 u Hind III rozštěpí ….. 200 ng plasmidu ….. za X minut
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
X = 200 x 60/332 = 36
Odpověď:
Restriktáza Hind III bude štěpit plasmid 36 minut