ToCymerázová řetězová reakce
V jakém množství deionizované vody rozpustíte lyofilizovaný vzorek primem, aby jeho koncentrace byla 100u.M? Vzorek obsahuje 138,6 u.g primem, který je dlouhý 18 nukleotidů a jeho molekulová hmotnost je 5 119.
Řešení
106 u.1 ..... 1M roztoku má hmotnost ..... 5119 g primem
106 u.1 ..... 100 u.M roztoku má hmotnost ..... 5 119 x 100 u.g primeru
X u.1 ..... 100 u.M roztoku má hmotnost ..... 138,6 u.g primeru
X = 138,6 x 106/5 119 x 100 u.1 = 270,75 u.1
Odpověď:
Vzorek lyofilizovaného plasmidu rozpustíme ve 271 u.1 deionizované vody.
Jaké množství primem ze zásobního roztoku 100u.M napipetujete do PCR reakce o objemu 20 u.1 jestliže chcete do reakce dát lOpmol primem?
Řešení
1M roztok lmM roztok lu.M roztok
lmol částic/litr lnmol částic/VI lpmol částic/VI
lnmol částic/u.1
100u.M roztok 100u.M roztok
obsahuje obsahuje
100 pmol 10 pmol
v v
lul Xu.1
X = 10 x 1/100 u.1 = 0,1 u.1
Odpověď:
Chceme-li odebrat z roztoku lOpmol částic, pak odebereme 0,luJ.
Taq polymeráza připojuje nukleotidy rychlostí 150 nukleotidů/sekundu. Jak dlouho trvá tomuto enzymu, než nasyntetizuje fragmenty o délce 190 a 490 bp?
Řešení:
150 nukleotidů ..... je připojeno za ..... 1 s
190 nukleotidů ..... je připojeno za ..... Xs
X = 190/150 = 1,27 s X = 490/150 = 3,27 s
Odpověď:
Fragmenty jsou teoreticky nasyntetizovány za 1,27 sekundy a 3,27 sekundy
Jak dlouhý amplikon může vzniknout na níže popsaném úseku DNA (je uveden pouze jeden z komplementárních řetězců) pokud má experimentátor k dispozici následující dvojici primem?
Primer forward: Primer reverse:
5'- ATG TGA GCG GTC TAC TGG - 3'   5'- GAT AGC TAG AAT TGA TAG - 3'
Sekvence, na které probíhá amplifikace:
5'- ATG TGA GCG GTC TAC TGG AAA TGC AGT GCA TCA GTC AGC GAT GGG TGA GTC ACC CCC GTC ACG TCA GAT TCA TGA CTA AGC GTC CGT GCT TGA TCG AGT CTA TCA ATT CTA GCT ATC ATC ATG GTT GAC ATC - 3'
Řešení:
1) Primer forvard má stejnou sekvenci i orientaci jako zadaná sekvence
2) Primer reverse je třeba obrátit a vytvořit jeho komplementární sekvenci, je tedy třeba na zadané sekvenci hledat následující posloupnost:
5'- CTA TCA ATT CTA GCT ATC - 3'
Pozice primerů jsou vyznačeny podtržením
5'- ATG TGA GCG GTC TAC TGG AAA TGC AGT GCA TCA GTC AGC GAT GGG TGA GTC ACC CCC GTC ACG TCA GAT TCA TGA CTA AGC GTC CGT GCT TGA TCG AGT CTA TCA ATT CTA GCT ATC ATC ATG GTT GAC ATC - 3'
Vzdálenost mezi ATG a ATC je 117 bp
Odpověď:
Na popsaném úseku DNA může vzniknout amplikon o délce 117 bp
Jedna jednotka enzymu Taq polymerázy inkorporuje lOnmol nukleotidů za 30 minut při teplotě 72°C. Přepočtěte tuto hodnotu na počet inkorporovaných nukleotidů za minutu.
Řešení:
10 x 10"9 mol ..... je připojeno za ..... 30 min.
X mol ..... je připojeno za ..... 1 minutu
X = 10 x 10 ~9/30 mol
1 mol ..... je ..... 6,023 x 1023 nukleotidů
10 x 10~9/30 mol ..... je ..... Y nukleotidů
Y = (10 x 10 ~9/30) x 6,023 x 1023/1 [mol x nukleotidů/mol] = 2 x 1014 nukleotidů = 200 x 1012 nukleotidů
Odpověď:
Jedna jednotka enzymu Taq polymerázy inkorporuje přibližně 200 x 1012 nukleotidů za minutu
Taq polymeráza připojuje nukleotidy rychlostí 150 nukleotidů/sekundu. Jak dlouho trvá tomuto enzymu, než nasyntetizuje fragmenty o délce 306 a 554 bp?
Řešení:
150 nukleotidů ..... je připojeno za ..... 1 s
306 nukleotidů ..... je připojeno za ..... Xs
X = 306/150 = 1,27 s X = 554/150 = 3,27 s
Odpověď:
Syntéza těchto fragmentů trvá Taq polymeráze 2,04 sekundy a 3,69 sekundy
Jestliže frekvence začlenění chybného nukleotidu činí u Taq polymerázy 285 x 106, kolikrát může tento enzym chybovat při syntéze 200 ng amplikonu o délce 500 bp? Co můžete říct o počtu chybných amplikonu v takovém výsledném vzorku DNA?
Řešení:
M (lbp) = 650
1) Spočítáme počet nukleotidů v daném množství amplikonu
6,023 x 1023 nukleotidů ..... má hmotnost ..... 650 g
X nukleotidů ..... má hmotnost ..... 200xl0~9g
X = 6,023 x 1023 x 200 x 10 7 650 = 1,85 x 1014 nukleotidů
2) Stanovíme podíl chybně začleněných nukleotidů
1,85 x 1014 x 285 x 10"6 = 5,27 x 1010 nukleotidů
3) Stanovíme podíl chybných amplikonu
5,27 x 1010 /500 = 1,05 x 108 amplikonu = 105 x 106 amplikonu
Odpověď:
Chybně bude začleněno 5,27 x 1010 nukleotidů 105 milionů amplikonu bude chybných
Poznámka:
Ve skutečnost bude počet chybných amplikonu vyšší, protože chyba v prvních cyklech se přenese i do dalších amplikonu.