Úloha z restrikčního štěpení Zadání Jedna jednotka restrikční endonukleázy BamH I je množství enzymu, které rozštěpí 1μg DNA fága λ za optimálních reakčních podmínek při 37°C za 1 hodinu. Na molekule DNA fága λ je celkem 5 štěpných míst pro restriktázu BamH I. Chceme-li linearizovat plasmid, který obsahuje jediné restrikční místo pro tuto restriktázu, jaké podmínky štěpení použijeme? Máme linearizovat 10^10 molekul plasmidu. Řešení a) Předpokládejme, že budeme štěpit 1 hodinu. Musíme tedy spočítat množství jednotek restriktázy. b) Předpokládejme, že použijeme 1 jednotku restriktázy. Musíme tedy spočítat dobu štěpení Velikost DNA fága λ = 48 502 bp, molekulová hmotnost 1 bp = 650 1) Spočítáme počet molekul fága λ, které enzym BamH I rozštěpí 6,023 x 10^23 molekul DNA fága λ ….. má hmotnost ….. 650 x 48 502 g X molekul DNA fága λ ….. má hmotnost ….. 1 x 10^-6 g --------------------------------------------------------------------------------------------------- -------------- X = 6,023 x 10^23 x 1 x 10^-6/ 650 x 48 502 = 1,91 x 10^10 molekul Ad a) 1 jednotka restriktázy BamH I ….. rozštěpí za 1 hodinu ….. 1,91 x 10^10 molekul X jednotek restriktázy BamH I ….. rozštěpí za 1 hodinu ….. 1,00 x 10^10 molekul --------------------------------------------------------------------------------------------------- -------------- X = 1,00/1,91 x 10^10 x 1 jednotek = 0,52 jednotek Chceme-li tedy štěpit 1 hodinu, použijeme asi 0,5 jednotky restriktázy BamH I (pro plasmid 5x méně) Ad b) za 1 hodinu ….. rozštěpí 1 jednotka restriktázy BamH I ….. 1,91 x 10^10 molekul za X hodin ….. rozštěpí 1 jednotka restriktázy BamH I ….. 1,00 x 10^10 molekul --------------------------------------------------------------------------------------------------- -------------- X = 1,00/1,91 x 10^10 x 1 hodin = 0,52 hodin Chceme-li tedy štěpit 1 jednotkou restriktázy BamH I, pak budeme štěpit asi 30 minut (pro plasmid 5x rychleji)