VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO
FARMACEUTICKÁ FAKULTA
Ústav molekulární biologie a farmaceutické biotechnologie
Klonování rostlinného genu pro peroxidázu
Brno 2015 Jiří Makatura
Vedoucí diplomové práce: doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.
doc. PharmDr. Petr Babula, Ph.D.
Anotace:
Peroxidáza je protein, který rostlinám umožňuje tvorbu polymeru ligninu. Ten je,
tvořen různými monomery, odvozenými od kyseliny skořicové, která je modifikována
hydroxylací, methylací či redukcí a tak vznikají prekursory ligninu včetně kyseliny ferulové,
hořčičné, kávové, coniferylalkoholů apod. K iniciaci polymerace je nutný vznik radikálů
z těchto molekul. Ty pak samovolně polymerují a vytvářejí lignin. Rozsah lignifikace závisí na
druhu rostliny a druhu pletiva.
Gen pro peroxidázu byl klonován do bakteriálního plasmidového vektoru za účelem
následné přípravy eukaryotického systému určeného ke studiu funkce peroxidázy
v heterologickém systému.
Annotations:
Peroxidase is a protein, which allows plants to create lignin. Lignin molecule is
created by various monomers derived from cinnamic acid, which is modified by
hydroxylation, methylation or reduction. This way develop Precursors of lignin are formed by
this way including ferulic acid, mustard acid, caffeine acid, coniferylalcohols and so on. For
initiation of polymerization formation of radicals from these molecules is necessary. The
radicals spontaneously polymerize and create lignin. Lignification range depends on plant
species and type of tissue.
The gene for peroxidase has been cloned to bacterial plasmid to prepare eukaryotic
system in future. The eukaryotic system will be used to study of peroxidase function in
heterologous system.
Klíčová slova:
Peroxidáza, lignin, klonování, rekombinantní proteiny, vliv stresu na rostliny.
Key words:
Peroxidase, lignin, cloning, recombinant proteins, effects of stress on plants.
Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci vypracoval samostatně, pouze s použitím uvedené
literatury.
V Brně, 29. 3. 2015 Jiří Makatura
Poděkování:
Děkuji svému školiteli doc. RNDr. Milanu Bartošovi, Ph.D a doc. PharmDr. Petru Babulovi,
Ph.D. za neocenitelné rady a pomoc při psaní mé diplomové práce a ing. Haně Vítkové za
cenné rady při práci v laboratoři.
5
1. Úvod ................................................................................................................................................ 7
2. Buněčná stěna a enzymy................................................................................................................. 8
2.1. Buněčná stěna rostlinné buňky............................................................................................... 8
2.2. Syntéza buněčné stěny............................................................................................................ 8
2.3. Hlavní rostlinné fenolické látky ............................................................................................. 11
2.4. Peroxidázy ............................................................................................................................. 14
2.4.1. Funkce peroxidáz................................................................................................................. 14
2.4.2. Struktura peroxidáz....................................................................................................... 16
2.4.3. Rozdělení peroxidáz ...................................................................................................... 17
2.5. Charakteristika procesu lignifikace a peroxidáz Zinnia elegans............................................ 19
2.6. Dřevnatění Cínie.................................................................................................................... 19
2.7. Poškození rostlin a jejich obrana........................................................................................... 21
3. Cíl práce......................................................................................................................................... 27
4. Materiál a metody......................................................................................................................... 28
4.1. Příprava materiálu k izolaci mRNA a pasážovací médium..................................................... 28
4.2. Izolace RNA............................................................................................................................ 28
4.3. Média pro práci s bakteriálními buňkami E. coli ................................................................... 31
4.4. Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu........................................................... 32
5.1. Pasážování a tvorba kalusu ................................................................................................... 33
5.2. Určení sekvence genu a návrh primerů pro amplifikaci........................................................ 34
5.3. Izolace RNA............................................................................................................................ 36
5.4. Amplifikace............................................................................................................................ 37
5.5. Ligace..................................................................................................................................... 43
5.6. Transformace......................................................................................................................... 43
5.7. Další práce s narostlými koloniemi........................................................................................ 45
5.8. Izolace plasmidové DNA.................................................................................................... 4746
6. Diskuse....................................................................................................................................... 4847
6.1. Izolace RNA........................................................................................................................ 4847
6.3. Určení nukleotidové sekvence a návrh primerů ................................................................... 49
6.4. Příprava genu pro peroxidázu amplifikací............................................................................. 50
6.5. Ligace a transformace bakteriální buněk E. coli.................................................................... 50
6.6 Transformace......................................................................................................................... 53
6.7. Screening transformantů....................................................................................................... 53
6
6.8. Izolace plasmidové DNA a sekvenování ............................................................................ 5453
7. Závěr.................................................................................................................................................. 58
8. Seznam použitých zkratek................................................................................................................. 59
9. Literatura a zdroje ............................................................................................................................. 60
7
1. Úvod
Všechna živá stvoření se skládají z buněk - malých, membránou ohraničených
jednotek naplněných koncentrovaným vodným roztokem chemických sloučenin a vybavených
mimořádnou schopností vytvářet kopie sebe samých růstem a dělením. Buňky jsou
základními funkčními jednotkami živých organismů a život závisí na schopnosti buněk
uchovávat, třídit a překládat genetickou informaci.1
To je podmínkou k vytvoření a udržení
živého organismu. Na tvorbě funkčních struktur živého organismu se rozhodující mírou
podílejí proteiny. To jsou makromolekuly, které provádějí většinu buněčných funkcí, slouží
jako stavební kameny většiny buněčných struktur, mohou fungovat jako enzymy, které
katalyzují buněčné chemické reakce, regulují genovou expresi, umožňují buněčný pohyb a
vzájemnou komunikaci. Informace pro tvorbu proteinů, tzv. genetická informace, je uložena
v genech. Geny se nacházejí na chromosomech v jádře.
Rekombinantní technologie dnes umožňuje nejen cíleně měnit genetickou informaci
vedoucí k tvorbě pozměněných proteinů, ale také přenášet genetickou informaci z jednoho
organizmu do jiného. Genetická informace (ve formě DNA) může být živočišná, rostlinná či
mikrobiální a může se začlenit do buněk bakteriálních, rostlinných, živočišných, do kvasinek
či plísní nebo do celé rostliny či živočicha. K začlenění cizorodé DNA se používají uměle
zkonstruované vektory na bázi plasmidů nebo virů. Ty jsou pak transformovány do speciálně
upravených organismů, zejména prokaryotických buněk Escherichia coli a Bacillus subtilis,
kvasinek Saccharomyces cerevisiae, do hmyzích nebo savčích buněk.2
Produkty rekombinantní technologie dnes nalézají využití v řadě průmyslových
odvětví, ale také v terapii, nebo diagnostice onemocnění. Produkty rekombinantních
technologií jsou především enzymy, peptidové hormony, vakcíny, cytokiny, interferony.
V terapii cukrovky se dnes například běžně používá inzulín připravený rekombinantní
technologií.2
8
2. Buněčná stěna a enzymy
2.1. Buněčná stěna rostlinné buňky
Buněčná stěna je jedním ze základních charakteristických rysů, kterým se rostlinná
buňka odlišuje od buňky živočišné. Je primární mechanickou ochranou buňky. Sestává ze čtyř
skupin polymerů: celulózy, hemicelulózy, pektinu a proteinů.3
Samotná buněčná stěna ale neposkytuje dostatečnou ochranu celé rostlině,
k tomuto účelu složí krycí pletiva.4
Ta poskytují ochranu nejen proti patogenům a některým
býložravým živočichům ale také chrání před ztrátou vody. Tato mechanická ochrana
nadzemní části se skládá hlavně z celulózy, hemicelulózy, pektinu a je impregnována
ligninem a suberinem, dále může být ještě zesílena z vnější strany trichomy, které často
obsahují sekundární metabolity a z vnitřní strany vrstvami buněk, které jsou také
impregnovány.5
2.2. Syntéza buněčné stěny
Ontogeneticky nejstarší částí buněčné stěny je střední lamela, jejíž tvorba začíná
v poslední fázi buněčného dělení, kdy mikrotubuly v ekvatoreální oblasti vytvářejí
fragmoplast.6
Mezi střední lamelou a plasmalemou dceřiných buněk se tvoří nové primární
buněčné stěny sekrecí membránových váčků a syntézou celulosových mikrofibril na povrchu
plasmalemy.1
Již během tvorby primární stěny nebo hned poté dochází ke zvětšování objemu
buňky. Strukturu primární stěny tvoří xyloglukany a pektiny syntetizované v Golgiho aparátu
a do buněčné stěny jsou transportovány v sekretorických váčcích.7
Po ukončení expanzního
růstu se v některých buňkách tvoří stěna sekundární- tím, že ze strany plasmalemy se
na primární stěnu ukládají nové vrstvy. Ty obvykle obsahují, kromě celulózy, pektinů
xyloglukanů a dalších látek také 20- 30% ligninu. 8
Impregnace buněčných stěn ligninem je podstatnou součástí dřevnatění. Lignin
stěnám dodává extrémní odolnost proti roztržení a rozlomení a přitom zachovává jejich
pružnost, zmenšuje také jejich prostupnost pro vodu. Stěna je zpevňována zvýšením počtu
9
vazeb mezi látkami již přítomnými, i vkládáním látek syntetizovaných de novo. Lignin je
polymer, tvořený různými monomery, odvozenými od kyseliny skořicové. Ta je modifikována
hydroxylací, methylací či redukcí, a tak vznikají prekursory ligninu včetně kyseliny ferulové,
hořčičné, kávové, coniferylalkoholů apod. To se děje v Golgiho aparátu, odkud jsou
prekursory ligninu exportovány do stěny. Tyto látky jsou dehydrogenovány peroxidázami za
vzniku volných reaktivních radikálů. Ty pak samovolně polymerují a vytvářejí lignin. Rozsah
lignifikace závisí na druhu pletiva.8
Během zpevňování se aktivují enzymy nezbytné pro syntézu základních stavebních
kamenů ligninu, tj. aromatických alkoholů - fenylalaninmonyumliáza (PAL), chalkosyntáza
(CHS) a chalkoizomeráza, i peroxidázy, které jsou nutné k polymeraci složek buněčné stěny.
Peroxidázy vázané v buněčné stěně katalyzují polymerizaci fenolických látek na lignin a také
vznik suberinu. Zvyšuje se syntéza proteinů bohatých na hydroxiprolinhydroxyprolin.
Aktivuje se NADPH oxidáza, lokalizovaná na vnější straně plazmatické membrány, která
katalyzuje vznik superoxidu (O2). 8
Impregnace buněčných stěn ligninem je podstatnou součástí dřevnatění. Lignin
stěnám dodává extrémní odolnost proti roztržení a rozlomení a přitom zachovává jejich
pružnost, zmenšuje také jejich prostupnost pro vodu. Stěna je zpevňována zvýšením počtu
vazeb mezi látkami již přítomnými i vkládáním látek syntetizovaných de novo. Lignin je
polymer, tvořený různými monomery, odvozenými od kyseliny skořicové. Ta, je
modifikována hydroxylací, methylací či redukcí, a tak vznikají prekursory ligninu včetně
kyseliny ferulové, hořčičné, kávové, coniferylalkoholů apod. To se děje v Golgiho aparátu,
odkud jsou prekursory ligninu exportovány do stěny. Tyto látky jsou dehydrogenovány
peroxidázami za vzniku volných reaktivních radikálů. Ty pak samovolně polymerují a vytvářejí
lignin. Rozsah lignifikace závisí na druhu pletiva.12
Během zpevňování se aktivují enzymy nezbytné pro syntézu základních stavebních kamenů
ligninu, tj. aromatických alkoholů - fenylalaninmonyumliáza (PAL), chalkosyntáza (CHS)
a chalkoizomeráza, i peroxidázy, nutné k polymeraci složek buněčné stěny. Peroxidázy
vázané v buněčné stěně katalyzují polymerizaci fenolických látek na lignin a vznik suberinu.
Zvyšuje se syntéza proteinů bohatých na hydroxyprolin. Aktivuje se NADPH oxidáza,
lokalizovaná na vnější straně plazmatické membrány, která katalyzuje vznik superoxidu (O2
).
Naformátováno: horní index
10
Peroxidázy vázané v buněčné stěně katalyzují polymerizaci fenolických látek na lignin a také
vznik suberinu.8
Obr. 1: Model impregnace buněčné stěny ligninem, převzato z: kfrserver.natur.cuni.cz
Syntéza ligninu vychází z fenolických látek.7
Prekurzorem většiny fenolických látek
přírodního původu je kyselina šikimová, produkt syntézy sacharidů vznikajících při
fotosyntéze.
11
Obr. 2: Syntéza kyseliny šikimové
2.3. Hlavní rostlinné fenolické látky
Pro fenolické látky je charakteristický aromatický kruhový systém, který nese
minimálně jednu OH skupinu. Patří mezi ně mnoho látek, které mají důležité fyziologické
jako: (1) přenašeče elektronů, (2) ochrana před UV zářením, (3) lákadla opylovačů, (4)
fytoalexiny, atd. a (5) impregnační materiál buněčných stěn a strukturální materiál dodávající
rostlinám stabilitu.10
Tabulka 1: Přehled uhlíkatých skeletů jejich molekul lze rozdělit do čtyř tříd:
Jednoduché fenoly hydrochinon, arbutin
Kyseliny fenolkarboxylové kys. galová, pyrokatechová, p- hydroxybenzoová
Fenylpropanoidy lignin, kumariny, skořicový alkohol, skupina kyselin
skořicových
Flavonoidy flavany, flavonoly, anthokyany
Pro syntézu ligninu jsou klíčové fenylpropanoidy. Biosyntéza fenylpropanoidu vychází
od aminokyseliny fenylalaninu, který je produktem již popsané šikimátové metabolické
12
dráhy. Jejich charakteristickým znakem je tříuhlíkatý řetězec připojený k aromatickému
fenolovému kruhu.10
Obr. 3: Přeměna fenylalaninu v kyselinu trans- skořicovou působením
fenylalaninamoniaklyázy, při reakci se uvolňuje amoniak.
Základními fenylpropanoidy jsou kyselina skořicová a její deriváty, které vznikají její
modifikací – hydroxylací, methylací či redukcí, a tak vznikají prekursory ligninu v rostlinách se
běžně vyskytující kyseliny p- kumarová, kávová, ferrulová a sinapová.10
Modifikace se
uskutečňují v Golgiho aparátu, odkud jsou prekursory ligninu exportovány do stěny. Tyto
látky jsou dehydrogenovány peroxidázami za vzniku volných reaktivních radikálů. Ty pak
samovolně polymerují a vytvářejí lignin. Rozsah lignifikace závisí na druhu pletiva.
13
Kyselina skořicová
Kyselina ferrulová
Kyselina kávová
Konyferylalkohol
Kyselina kumarová
Kyselina sinapová
14
2.4. Peroxidázy
2.4.1. Funkce peroxidáz
Polymerázy potřebují k polymeraci H2O2, který vzniká oxidací NADH a redukcí
superoxidu (O2
)
na rozhraní plazmatické membrány a buněčné stěny. Při polymeraci vzniká
voda.8
Schéma reakce8
:
XH + XH + H2O2  X-X + 2 H2O
Obr. 4: Model teoretické molekuly ligninu, Převzato z: www.plantphys.net
15
Reakce je zprostředkována III. třídou rostlinných peroxidáz. Produktem reakce je
opticky inaktivní, hydrofobní heteropolymer složený z H (hydroxyphenylových),
G (guaiacylových) a S (syringylových) jednotek. Lignin je heteropolymer, který vzniká
oxidativní polymerací tří monolignolů, p- coumaryl alkoholu, koniferyl alkoholu a sinapyl
alkoholu. 11
Obr. 5: Fenylpropanoidní metabolismus vedoucí ke vzniku monolignolů – p-kumaryl
alkoholu, koniferyl alkoholu a sinapyl alkoholu, převzato z: kfrserver.natur.cuni.cz
Lignin dvouděložných rostlin je složen převážně z Konyferyl alkoholu a Synapyl alkoholu.
Lignin jednoděložných rostlin je tvořen Konyferyl alkoholem, Synapyl alkoholem a Kumaryl
alkoholem.
Správná syntéza ligninu je extrémně náročná. Vyžaduje velké množství uhlíkových
základních jednotek a redukujících molekul. Rostliny nemají enzymatický aparát na rozklad
ligninu, takže tvorba ligninu je nevratný proces. Zdřevnatělé buňky přestavují významné uložiště
uhlíku, a proto musí být vyvážený poměr nově syntetizovaného ligninu a zdrojů uhlíku. Metabolismus
uhlíku (alokace) musí být proto enzymaticky řízen na mnoha úrovních.12
A právě enzym pro peroxidázu, která je pro dřevnatění zásadní jsem se rozhodl
izolovat, naklonovat a vložit do genetické výbavy transformované buňky.
Naformátováno: Zarovnat do bloku
Naformátováno: Odsazení: První
řádek: 1,25 cm
16
2.4.2. Struktura peroxidáz
Peroxidáza je životně důležitý glykoprotein, v rostlinách je kódovaný velkým
množstvím genů. Izoformy tohoto enzymu jsou kódovány ve více než 100 sekvencích.11
Obr. 6: Hypotetický 3D model enzymu, převzato z http://marid.bioc.cam.ac.uk
V peroxidázách jsou dobře konzervované zbytky aminokyselin. Ve struktuře byla dále
identifikována hemová struktura a místa vázající vápník a substrát. Tyto úseky byly
v minulosti podrobně zkoumány. Vzhledem k získaným údajům by mohla být předpovězena
hypotetická struktura membránově vázaných peroxidáz srovnáním se známými strukturami
peroxidáz s dostatečnou sekvenční podobností. Hypotetické 3D modely byly vytvořeny pro,
ZmPrx01, ZmPrx66, a ZmPrx70 (Mika et al., 2008 and Sottomayor et al., 2008).11
Počítačová analýza peroxidáz III. třídy odhalila 13-21 α-šroubovic a minimálně 2
a maximálně 11 β-listů., dále disulfidické můstky a glykosylovaná místa. I když všechny
peroxidázy obsahují mezi 8 a 11 cysteinovými zbytky s podobnými pozicemi v sekvenci,
17
předpovídané modely ZmPrx24, ZmPrx58, a ZmPrx81 odhalily méně disulfidových vazeb, ve
srovnání s ostatními. Struktura těchto peroxidáz vyžaduje ještě další zkoumání.12
Detailním zkoumáním peroxidáz se zabýval tým Doktora C. Gabaldóna (já bych sem
dal odkaz na citaciLos Angeles School district). Jejich zásluhou byla určena a naklonována
primární struktura peroxidázy Z. elegans. Geny kódující peroxidázu se skládají ze tří exonů a
dvou intronů. Jejich struktura a pozice ukazují na to, že tento enzym patří do peroxidázové
skupiny, popisované v Rýži (Oryza sativa) a Huseníčku (Arabidopsis). Studium sekvencí
určujících peroxidázu ukázalo, že obsahují identickou sekvenci 966 bp ORF kodující
321aminokyselin, které se ovšem liší na 5′ nepřekládaném konci (5′-UTR). Ačkoli je přesná
úloha tohoto úseku zatím neznámá, je téměř jisté, že obsahuje informace, které se mohou
podílet na sekundární struktuře a interagují s proteiny, které regulují transport mRNA,
stabilitu a translaci. Nezralý polypeptid ZePrx obsahuje signální peptid (N terminální propeptid)
o 30 aminokyselinách, který řídí vazbu peptidu na membránu endoplazmatického
retikula.11
2.4.3. Rozdělení peroxidáz
Peroxidázy - katalázy (pojmenované podle dvou hlavních enzymatických aktivit), také známé
jako neživočišné peroxidázy, nebo bakteriální, houbové a rostlinné peroxidázy s hemovou
strukturou. Tato skupina je patrně evolučně nejúspěšnější linií peroxidáz v eukaryotických i
eukaryotických buňkách. V současné době splňuje kritéria pro zařazení do této skupiny
přibližně 3630 proteinů. První klasifikace těchto enzymů byla prezentována v roce 1992
Karyn Welinderovou. Rozdělení bylo založeno na strukturální homologii, na které se autorka
pokusila o rozdělení do tří hlavních skupin:13
Peroxidázy I. třídy jsou intracelulární neglykosylované proteiny, které můžeme nalézt
v rostlinách, houbách a prokaryotech. Tyto proteiny nemají ve své struktuře disulfidické
můstky nebo vápenaté ionty. Třída se dále dělí na cytochrom C peroxidázy, peroxidázykatalázy
a peroxidázy kyseliny askorbové. Jejich hlavní funkcí je likvidace nadbytečného
peroxidu vodíku.13
Peroxidázy II. třídy jsou výhradně glykosylované proteiny s vápenatými ionty,
disulfidickými můstky. Skupina sestává z ligninových peroxidáz, manganových peroxidáz
18
a univerzální peroxidázy. Jejich hlavním úkolem je degradace odumřelých částí rostlinných
těl. Jenom peroxidázy jsou totiž schopné degradovat rostlinný lignin.13
Peroxidázy III. třídy tvoří velkou skupinu, přítomnou ve všech pozemních rostlinách
s výjimkou jednobuněčných řas. Jsou to glykosylované proteiny stejně jako peroxidázy II.
třídy a obsahují vápenaté ionty a čtyři nebo pět disulfidických můstků. Mají velmi důležitou
roli ve dvou katalytických cyklech. V peroxidázovém cyklu přijímají elektrony od různých
donor- molekul, jako jsou například fenoly a katalyzují redukci H2O2. A byl také popsán
samostatný hydroxylový cyklus, který vede ke vzniku reaktivních forem kyslíku. V důsledku
velkého počtu genů a počtu izoforem a funkcí ve dvou katalytických cyklech se peroxidázy III.
třídy podílejí na široké škále fyziologických procesů, jako jsou obranné reakce rostlin,
elongace buněk, produkce kyslíku a produkce ligninu a suberinu.19
Protože se podílejí
na velkém počtu fyziologických procesů, lze velmi snadno detekovat, jejich přítomnost.
Nicméně přiřadit přesnou roli pro každý izoenzym peroxidázy je stále ještě nemožné.13
Tato základní klasifikace byla dále upřesněna a byla rozšířena rozšířena do dalších
oddílů na základě převládajících specifik ve všech třech třídách. Rozsáhlé sekvenční analýzy
genových rodin ze všech tří skupin vedly k závěru, že všechny peroxidázy mají společného
předchůdce ve třídě Negibacteria. Existuje předpoklad, že v průběhu evoluce se již
diverzifikované geny pro Peroxidázyy přenesly endosymbiózou do nově vytvořených
eukaryotických buněk. Podrobnější fylogenetická analýza peroxidáz II. třídy a několika
vybraných zástupců z I. a III. třídy, odhalila že I. třída se oddělila od hlavní vývojové linie
velmi brzo a zbylé dvě prošly dalším vývojem.13
V závislosti na jejich interakci s komponenty buněčné stěny je lze ještě dále rozdělit
do tří skupin14
:
a) volně navázané proteiny s málo nebo žádnými interakcemi s komponenty buněčné stěny;
b) slabě vázané proteiny představující hydrofobní nebo iontové interakce s matricí. ;
c) silně vázané proteiny, které jsou zesítěné s komponenty buněčné stěny kovalentní vazbou
Naformátováno: Ruština
19
2.5. Charakteristika procesu lignifikace a peroxidáz Zinnia elegans
Jako organismus vhodný k získání genetické informace jsem zvolil Zinnia elegans,
protože studiem její peroxidázy se již zabýval prof. Gabaldón (viz. výše). Rostlina roste velmi
rychle a je nenáročná na pěstování v laboratorních podmínkách.3
Tato rostlina je navíc běžně
využívaná jako model pro studium diferenciace xylemu. Rostlina se k tomu účelu dobře hodí
díky dvojakosti dřevnatění na stonku a hypokotylu a díky komplementu izoenzymů, který je
téměř omezen na bazický izoenzym. Proces dřevnatění Zinnie je unikátní v tom, že během
svého vývoje umožnuje studovat dva modely dřevnatění. První se vyskytuje u
u nahosemenných a druhý u krytosemenných rostlin. Produktem lignifikace je opticky
inaktivní, hydrofobní heteropolymer složený z H (hydroxyphenylových), G (guaiacylových)
a S (syringylových) jednotek.11
Zatímco hypokotyl rostlin starých 25- 30 dní je složen z G / S jednotek v poměru
42/58, tak lignin stonku obsahuje významné množství H jednotek v H / G / S poměru. Tak
tedy S jednotky převažují v hypokotylu zatímcohypokotylu, zatímco G jednotky převažují ve
stonku. V tomto ohledu je Z. elegans typický představitel krytosemenných. Lignin mladého
stonku se podobá ligninu nahosemenných rostlin, protože (H + G) sám tvoří 78% ligninu
stavebních bloků.11
2.6. Dřevnatění Cínie
Vývoj prvního internodia Cínie můžeme rozdělit do tří jasně definovaných fází, které
jasně určují morfologii rostliny a charakteristické dřevnatění. První fáze určuje tvar prvního
páru pravých listů, a během této fáze začíná být vidět první internodium. Na konci této fáze
začíná být formující se xylem pozorovatelný optickým mikroskopem. Utváří se 12 cévních
svazků, zatímco vlákna floemu zůstávají nedostatečně vyvinutá. V této fázi jsou náznaky
ligninu viditelné pouze za použití fluoroglucinolového testu a vlákna floemu ještě nejsou
zdřevnatělá.15
20
Druhá fáze vývoje kmene (stonku), tj. 3. až 6. den po objevení prvního páru pravých
listů, v ní rostlina plně využívá růstový potenciál prvních internodií. Stejná fáze nastává ve
formaci xylemu, který v této fázi tvoří až 18 ligninových svazků viditelných po
fluoroglucinolovém testu. Na konci této fáze (6 dnů po objevení prvního páru pravých listů)
se obsah ligninu ve stonku zvyšuje maximální rychlostí, přestože je omezený pouze na oblast
xylemu. Vlákna floemu jsou pouze slabě vidět po fluoroglucinolovém testu.15
Třetí fáze 6. až 9. den je charakterizována viditelnou ztrátou prodlužovacího
potenciálu prvního internodia, po devátém dni se to projeví úplnou ztrátou růstového
potenciálu. Na konci této fáze je xylem maximálně vyvinutý a floem začíná dřevnatět, což se
opět snadno prokáže fluoroglucinolovým testem. Prodlužovací růst je nahrazen tloustnutím
a další vývoj xylemu začíná později.15
21
Dejte pozor na to, že tento obrázek přesahuje okraje stránky!
Obr. 7: Model diferenciace xylemu u rostliny Zinnia, převzato z www.kfrserver.natur.cuni.cz
A) kruhový B) spirální C) síťkový D) dírkovaný
Produkce H2O2 xylemem Cínie je komplikovaný proces, v jehož regulaci hrají klíčovou roli
kalmodulin, fosfolipáza C (citlivá na neomycin sulfát) a proteinkináza (citlivá na
staurosporin). Tato specificita produkce H2O2 poukazuje na analogii mezi mechanismem
produkce H2O2 během lignifikace v xylému a v oxidativní reakci při hypersenzitivní reakci
rostliny na stres. 15
22
2.7. Poškození rostlin a jejich obrana
Proboha, už jsem to říkal, tady máte jinak citovanou literaturu!
Apoplastické peroxidázy III. třídy mají klíčovou roli v reakci rostlin na infekci
patogenem a abiotický stres, například poranění. Různá poranění představují pro rostliny
naprosto běžný stres, který může být způsoben hmyzem, spásáním dobytkem, nebo jako
důsledek zemědělských praktik. Běžné mechanické poranění ihned indukuje rychlou aktivaci
genů pro peroxidázu, a tvorbu reaktivních forem kyslíku. Je dokázáno, že tato obranná
reakce souvisí s aktivací i jiných apoplastických enzymů. Pozdější reakce na poranění zahrnují
různé formy hojení například peroxidázou řízenou suberinizaci nebo buněčnou smrt.
Dostupné údaje naznačují, že reaktivní formy kyslíku zprostředkovávají buněčnou smrt
i signalizaci ostatním buňkám. Peroxidázy jsou zodpovědné za tvorbu i likvidaci těchto
molekul.16
U rostlin se během evoluce vyvinul efektivní mechanismus uvolňování ROS společně s
aktivací fenylpropanoidové metabolické dráhy. (Collinge and Slusarenko, 1987), depozicí
kalózy a řízenou polymerací a zesíťováním fenolických látek buněčné stěny (Bradley et al.,
1992). Další způsoby obrany jsou suberinizace buněčné stěny (Bernards et al., 1999), a řízená
buněčná smrt (Cui a kol., 2013) Produkce ROS, jako je peroxid vodíku (H2O2), superoxidu (O)
a hydroxylového radikálu (HO) - a reaktivních forem dusíku, jako je oxid dusnatý (NO) jako
reakce na zranění ve spojení s kontrolou redoxních reakcí při hojení ran, jsou rysy společné
rostlinám a živočichům. Prudké oxidativní reakce mohou přímo zabít patogeny. ROS
zprostředkovávají degradaci jejich proteinů, nukleových kyselin a rozklad buněčných
membrán, a také inhibují klíčení spor patogenů. Například, aplikace 25 uM H2O2 na
Peronospora tabacina, Cladosporium cucumerinum a Colletotrichum lagenarium zcela
inhibuje klíčení spor v těchto patogenů (Peng a Kuc 1992). ROS usnadňují dřevnatění
a suberinizaci tkáně v místě poranění, čímž omezují šíření infekce. Systémové obranné
reakce zahrnují produkci obranných bílkovin, tzv defensinů, které se hromadí v poraněných
listech a také ve vzdálených neporušených listů (Green a Ryan, 1972). Podle Leóna et al.
(2001), tyto indukovatelné proteiny mohou provádět opravy poškozené tkáně, a produkovat
látky, aby se zabránilo šíření patogenu a upravovat metabolismus poškozených rostlin, které
mají po zranění změněné nutriční nároky. Peroxidázy zdá se, se zapojují téměř do všech
těchto dějů. První, kdo prokázal přínos prudkých oxidativních reakcí (oxidative burst) a jejich
23
přímou souvislost s peroxidázami při kontaktu s patogenem byl Profesor Paul Bolwell
(Bolwell et al., 1995, Robertson et al., 1995 a Bolwell, 1996).16
Poškození rostlin zatím věda chápe nesprávně, protože v laboratoři se rostliny
poraňují často pouze noži a lámáním. Je proto zajímavé, že i bez zraňování, tedy jenom
mírným mechanickým namáháním můžeme zvýšit redoxní aktivitu. ( Benikhlef et al., 2013).
Uvolnění peroxidázy do apoplastu je tedy brzkou odpovědí rostliny na poranění (Minibayeva
et al., 2009), tato reakce je také dobře dokumentována u rostlinných odpovědí na patogeny
(např. Lehtonen et al., 2009). Důležité je, aby konkrétní Apoplastický enzym byl přítomen na
správném místě ve správný čas, aby plnil svou funkci. To však závisí nejen na genové
transkripci a syntéze bílkovin, ale také na sekreci a cílení na místo akce (PENEL a Dunand,
2009). Okamžité zvýšení aktivity peroxidázy ihned po poranění obvykle trvá alespoň několik
hodin, a často předchází hromadění transkriptů peroxidázy (Holm et al., 2003) To naznačuje,
že uvolňování peroxidázy do apoplastu a aktivace jejich post-translačních modifikací je
zodpovědné za okamžité zvýšení jejich aktivity, mimo jiné to dokazuje, že uvolnění
Apoplastických peroxidáz je zprostředkováno měnícími se podmínkami prostředí (FechtCHRISTOFFERS
et al., 2003). Buněčná stěna má zřejmě obrovskou schopnost akumulovat
různé izoformy peroxidázy. V kultivovaných buňkách Catharanthus roseus , byly pouze 4% z
celkové aktivity peroxidázy vylučovány do růstového média ve srovnání s 45% protoplastů
(Mera et al., 2003). Některé apoplastické peroxidázy vykazují abilitu k vápenatým iontům a
v závislosti na nich mění konformaci pektinu ( Carpin et al., 2001). Regulace sekrece
peroxidázy byla pozorována na mnoha příkladech, ale dosud se nepodařilo objasnit její
mechanismus. Tímto by se možná dal vysvětlit vliv peroxidáz na místa v buněčné stěně, kde
mohou produkovat a odstraňovat ROS ( Delannoy et al., 2003). Mnoho peroxidáz III. třídy má
přesně určenou strukturu motivů vázajích Ca ionty. ( Cosio and Dunand, 2009). Exogenní
aplikace Ca2+
stimuluje aktivitu čisté apoplastické peroxidázy. ( Minibayeva et al.,
2009 a Plieth and Vollbehr, 2012). Dále bylo prokázáno, že extracelulární peroxidáza
izolovaná z latexu rostliny Euphorbi má afinitu ke kalmodulinu, Ca2 + a je to tedy
dependentní regulační protein, a je silně aktivován současnou přítomnosti kalmodulinu a
Ca2 + (Mura et al., 2005). Vzhledem k jejich komplexním biochemickým vlastnostem, může
být činnost Apoplastické peroxidázy regulována na několika úrovních.17
24
Jedna z nejčastějších klasifikací extracelulárních peroxidáz je založena na jejich
isoelektroforetické mobilitě, a jsou klasifikovány jako aniontové, kationtové nebo neutrální,
(Kukavica et al., 2012). Změny Apoplastického pH, proto představují spínač, který může
vyvolat aktivaci konkrétní izoformy peroxidázy. Je dobře známo, že po napadení patogenem
dochází k alkalizaci Apoplastického média během 15-20 min, a shoduje se s prudkým
nárůstem koncentrace ROS (Bolwell et al., 2002). Podobné změny pH se vyskytují také
v v reakci na zranění (Minibayeva et al., 2009). K rychlým přechodným změnám
Apoplastického pH může dojít změnou v činnosti draselných a vápenatých kanálů během
oxidativního vzplanutí (Bolwell a kol., 2002) a také sekrecí rychlého alkalizačního faktoru
(RALF). Tento peptid, který způsobuje rychlou alkalizaci média pro buněčnou kultivaci, byl
objeven v tabáku, vojtěšce, rajčatech a topolu (Pearce a kol., 2001 a Haruta et al., 2014).
Mezi faktory, které ovlivňují aktivitu Apoplastické peroxidázy, patří různé posttranslační
modifikace, jako je glykosylace a fosforylace, které mohou zvýšit účinnost a univerzálnost
peroxidáz (Gabaldón et al., 2007). Většina vylučovaných peroxidáz je silně N-glykosylovaná, i
když glykanová část může být v rozmezí od 0% do 25% celkové molekulové hmotnosti
(Welinder, 1992). Glykosylace peroxidáz III. třídy se zdá být zapojena do uspořádání
proteinů, stabilizace enzymů a jejich katalytických aktivit (Van Huystee et al., 2004). Úplnou
glykosylací přečištěných peroxidáz z cínie elegans se dvěma předpokládanými místy Nglykosylace
(181-NSTL a 191-NRSL) se snížila jejich schopnost oxidovat monolignoly
(Gabaldón et al., 2007). Oboustranná fosforylace proteinů je další regulační mechanismus
závod signálních drah v reakci na zranění. Dostupné údaje naznačují, že fosforylace /
defosforylace Apoplastických peroxidáz umožňuje doladění jejich činnosti při rychlé reakci
rostlin na poranění.17
Bezprostřední navýšení oxidačních reakcí po zranění může být krátkodobé, např. 10-
20 min pro excizi v některých semenech (Roach a kol., 2008, Roach a kol., 2010 a Roach
a kol., 2014), avšak ve většině případů trvá mnohem déle. Často se silná korelace nachází
mezi nárůstem produkce ROS a aktivitou peroxidázy, což naznačuje, že kromě své klasické
role H2O2 detoxikaci, jsou některé rostlinné peroxidázy schopny oxidační aktivity pro
generování H2O2 při fyziologickém pH prostřednictvím přímých a nepřímých mechanismů (viz
hodnocení podle Bolwell a Wojtaszek, 1997, Ros Barceló, 2000, Bolwell et al., 2002, Kawano,
2003, Mika a kol., 2004, Almagro et al., 2009 a O'Brien a kol., 2012a ). Teoreticky mohou
25
peroxidázy generovat H2O2 redukcí sloučenin konjugovaných ze železa a kyslíku
(oxyperoxidázy).17
Identifikace látek, které svojí redukcí umožňují peroxidázám vytvoření HO v apoplastu
je zásadní pro pochopení role peroxidázy v nárůstu oxidačních reakcí. V úvahu připadají
kyselina dihydroxyfumarová, indol-3-octová kyselina, NAD (P) H, a různé sulfhydrylové
molekuly, které splňují požadované vlastnosti pro vznik ROS in vitro (Penel a Dunand,
2009).17
Nicméně, v reakci na zranění to může být právě sekrece těchto látek, co zvýší
redukční potenciál, který zapříčiní oxidativní reakci. Ve skutečnosti mohou exogenní aplikace
redukčního činidla jako je NADH stimulovat apoplastickou produkci kyslíkových O2
-
.
Radikálůradikálů. (Minibayeva et al., 2009).
Peroxidázy jsou klíčovými prvky i v pozdějších stádiích reakce rostlin na zranění,
například posílení buněčné stěny prostřednictvím polymerace makromolekul, které jsou pak
uloženy na extracelulárním povrchu, a také zesítění složek buněčné stěny (Almagro et al.,
2009) Dehydrogenativní oxidace fenolických substrátů peroxidázou vede k tvorbě fenoxy
radikálů a následné kopulaci nestabilních radikálů, které dále vedou k ne-enzymatické
polymerací monomerů (Hiraga et al., 2001) Hydroxycinnamylové druhy alkoholů se
polymerují do ligninu, zatímco hydroxyskořicové kyseliny, které obsahují alifatické skupiny,
jsou začleněny do vysoce hydrofobního suberinu. Suberin se ukládá okolo zraněných pletiv
(Hiraga et al., 2001). Některé genetické důkazy pro role peroxidáz ve zraněním indukované
polymeraci ligninu a suberinizaci existují; například, způsob prostorová a časová exprese ranindukovatelných
aniontových peroxidáz silně koreluje s depozicí suberinu (Bernards et al.,
1999 a Bernards a Razem, 2001).17
Dvojitá činnost peroxidáz buněčné stěny. Peroxidázy jsou schopné generovat
reaktivní formy kyslíku (ROS), jako jsou OHa
HOO,
ale také mohou regulovat úroveň
peroxidu vodíku (H2O2). Proto hrají klíčovou roli v buněčném růstu tím, že řídí jemnou
rovnováhu mezi uvolňováním proteinů buněčné stěny (levá část obrázku) a de novo syntézou
buněčné stěny / (pravá část obrázku). H / PRPs = Hydroxyprolin / Proline-Rich proteiny.14
Naformátováno: dolní index
Naformátováno: horní index
26
Obr. 8: Znázornění dvojitého působení peroxidáz
27
3. Cíl práce
Cílem mé práce bude klonování rekombinantního genu pro peroxidázu z mRNA po
zpětné transkripci a amplifikaci metodou polymerázové řetězové reakce jako cDNA.
Sekvence cDNA bude ověřena sekvenováním nebo PCR.
28
4. Materiál a metody
4.1. Příprava materiálu k izolaci mRNA a pasážovací médium
Na tuhém MS médiu jsem nechal vyklíčit nažky Zinnie elegans. Tyto nažky bylo nutné
zbavit veškerých jiných organismů. Za tímto účelem jsem je opláchl v saponátu a potom
v destilované vodě. Takto očištěné nažky jsem vložil do tuhého MS média a nechal 5 dní
inkubovat. Z vyrostlých rostlinek jsem odstřihl děložní lístky a ty dále pasážoval.
Pro pasážování kalusů Zinnie elegans jsem použil tuhé MS médium.18
Jako zpevňující
složku jsem použil agar. Médium bylo zakoupeno od firmy DUCHEFA BIOCHEMIE a jeho
složení je uvedeno v Tabulce 2.
Tabulka 2: Složení média pro pasážování kalusů
složka Množství (mg/L)
MgSO4× 7H2O 370 K1 0.83
CaC12× 2H2O 440 H3BO3 6.2
KNO3 1,900 Na2M0O4× 2H2O 0.25
NH4NO3 1,650 CoC12× 6H2O 0.025
KH2PO4 170 Sucrose 30,000
FeSO4× 7H2) 27.8 Myo-Inositol 100
Na2EDTA 37.3 Nicotinic Acid 0.5
MnSO4× 4H2O 22.3 Pyridoxine 0.5
ZnSO4× 7H2O 8.6 Thiamine HC1 0.1-1
CuSO4× 5H2O 0.025 Glycine 2
Médium jsem sterilizoval autoklávováním (teplota 121 ͦC; přetlak 1,2 kg/cm2)
po dobu 30 min.
4.2. Izolace RNA
Jako vhodný materiál k získání RNA jsem si zvolil buňky z apikálního meristému mladé
rostlinky. K izolaci jsem použil RNeasy Plus Mini Kit od firmy QUIAGEN.
Postup:
1. Z MS media jsem odebral přibližně. 2,5 g kalusu z rostliny Zinnia elegans. Celé
množství rostlinné tkáně jsem přenesl do třecí misky a zalil dostatečným množstvím
Naformátováno: Zarovnat do bloku
29
tekutého dusíku a ihned začal třít tloučkem. Po úplném rozrušení materiálu jsem
přidal 350ul RLT Pufru. RLT pufr je nutný pro dokončení lýze buněk a inhibuje RNázy.
2. Pokračoval jsem v tření, až vznikla naprosto homogenní směs bez viditelných
usazenin.
3. Přenesl jsem lyzát do kolonek s vrstvou uzpůsobenou k zachycení zbytků buněčné
stěny, které byly vsunuty do sběrných kolonek, a odstřeďoval na centrifuze 2 minuty
při maximálních otáčkách.
4. Přenesl jsem homogenizovaný lyzát do gDNA eliminačních kolonek umístěných ve
sběrných kolonkách a centrifugoval 30 s při více než 10 000 otáčkách za minutu. Na
membráně gDNA eliminační kolonky zůstala gDNA a pro další práci jsem použil
složku, která prošla přes membránku.
5. K materiálu jsem přidal 350 ul 70% ethanolu, který zajistil odstranění zbytků DNA.
6. Přenesl jsem 700ul materiálu, ve kterém se může utvořit sraženina, do RNázy
centrifugační kolonky, umístěné ve sběrné kolonce. Centrifugoval jsem 15 s při
10 000 otáčkách za minutu. Pro další práci jsem použil materiál zachycený na
mambránce a část, která protekla, jsem odstranil.
7. Přidal jsem RW1 pufr do RNázy odstředivé kolonky a odstřeďoval 15 s při 10 000
otáčkách za minutu. Tento pufr slouží pročištění membrány v odstředivé kolonce.
8. Do té samé kolonky jsem přidal 500ul RPE pufru a centrifugoval 15s při 10 000
otáčkách za minutu. Část, která protekla, jsem odstranil.
9. Krok 8 jsem opakoval ještě jednou, odstřeďoval jsem 2 minuty. RPE pufr je schopen
vymývat RNázy, které je potřeba odstranit. Vymyjí se a zůstanou ve sběrné kolonce.
10. RNáza odstředivou kolonku jsem umístil no nové sběrné kolonky a odstřeďoval na
plné otáčky (asi 150 000 otáček za minutu) po dobu 1 min. Část, která protekla, jsem
odstranil. Na membráně mi zůstala izolovaná RNA.
11. Kolonku s izolovanou RNA jsem no nové sběrné kolonky a přidal 40ul čištěné vody.
(prostou enzymů, které by mohly rozložit izolát). Kolonku, s membránkou, a vodou
jsem umístil do nové sběrné kolonky. Odstřeďoval jsem 1 minutu při 10 000 otáčkách
za minutu. Do sběrné kolonky protekla voda s izolovanou RNA.
30
Obr. 9 Schéma izolačního postupu:
Převzato z RNeasy Plus Mini Handbook 09/2010
31
4.3. Média pro práci s bakteriálními buňkami E. coli
Selekční média
LB médium selekční s ampicilinem
LB-Broth (DIFCO) 0,25 g 2,5 % (w/v)
Ampicilin (100 mg/ml) 10 μl 100 μg/ml
Destilovaná voda 10 ml
LB agar selekční s ampicilinem
Destilovaná voda 10 ml
LB-agar (DIFCO) 0,4 g 4,0 % (w/v)
Ampicilin (100 mg/ml) 10 μl 100 μg/ml
X-gal (20 mg/ml) 20 μl 40 μg/ml
IPTG (23,8 mg/ml) 10 μl 23,8 μg/ml
LB médium selekční s ampicilinem a chloramfenikolem
Destilovaná voda 10 ml
LB-Broth (DIFCO) 0,25 g 4,0 % (w/v)
Ampicilin (100 mg/ml) 10 μl 100 μg/ml
Chloramfenikol (17 mg/ml) 20 μl 34 μg/ml
32
LB agar selekční s ampicilinem a chloramfenikolem
Destilovaná voda 10 ml
LB-agar (DIFCO) 0,4 g 4,0 % (w/v)
Ampicilin (100 mg/ml) 10 μl 100 μg/ml
Chloramfenikol (17 mg/ml) 20 μl 34 μg/ml
4.4. Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu
1,5% agarózový gel
0,5× TBE pufr 30 ml 80 ml
Agaróza 0,45 g 1,2 g
ethidiumbromid (0,15 mg/ml) 30 μl 80 μg/ml
5× TBE pufr (5× tris-borátový pufr)
Kyselina boritá 27,5 g
Trishydroxymethyl-aminomethan 54 g
EDTA (pH 8,0) 20 ml
Destilovaná voda Do 1000 ml
33
6× GLB (nanášecí elektroforetický pufr s barvičkou)
Bromfenolová modř 0,5 g
Glycerol 50 ml
1× TBE pufr do 200 ml
5. Výsledky
5.1. Pasážování a tvorba kalusu
Nažky Zinnie elegans jsem nechal vyklíčit s tuhém MS médiu.18
Z mladých rostlinek
jsem odstřihl klíční lístky a ty pak dále pasážoval při stálé laboratorní teplotě kolem 25 °C.
Obr. 10: Kalusy v laboratoři
Naformátováno: Písmo: 12 b.
34
5.2. Určení sekvence genu a návrh primerů pro amplifikaci
Z vědeckého článku prof. Gabaldona10
byla získána informace o nukleotidové
sekvenci a podle ní nevrženy primery, které byly objednány u firmy GeneriBiotech (Česká
republika).
Nukleotidová sekvence RNA kódující enzym peroxidázu. Navržené primery jsou podtrženy.
Naformátováno: Zarovnat do bloku
35
TCCCAGTCAC GACGTTGTAA AACGACGGCC AGTGAATTGT AATACGACTC ACTATAGGGC
GAATTGGGCC CTCTAGATGC ATGCTCGAGC GGCCGCCAGT GTGATGGATA TCTGCAGAAT
TCGCCCTTCT AATACGACTC ACTATAGGGC AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGTACGCGGG
GAAGCTAAGC TACTTACTCT TAGTTATAAA CATCAGCCTC AAGCTTTTTT CTCTTCACTA
ATATTATGAG TTATCATAAG TCAAGTGGAA CTACATTAAT GGTTCCTCTA TTTATGTTAC
TTATATCAGT GAACTACTTC ATGTCATGTA ACGCTCAGTT GTCAACCACC TTTTACGATA
CCACATGCCC TACTGCACTT TCAACCATTC GAACTTCTAT CAGAAGTTCG GTTTCAAGCA
ACCGTCGCAA TGCAGCCTTG GTCATTCGCC TTCTTTTTCA CGATTGTTTT GTTCAGGGAT
GTGATGCCTC TCTTTTGCTA TCAGGTGCTG GTAGTGAGAG GGCGTCACCT GCCAATGACG
GTGTGTTGGG CTATGAAGTT ATAGATGCCG CCAAAGCTGC GGTTGAAAGG GTGTGTCCTG
GAGTTGTTTC GTGTGCTGAT ATACTAGCGG TTGCAGCTCG TGATGCTTCA GTTGCGGTTG
GTGGGCCGTC ATGGACAGTA AGACTTGGAA GAAGAGATTC TACAACTTCG AACGCGGCAC
AAGCCGCAAC TGATCTTCCA AGAGGGAACA TGGTTTTAAG TCAACTTATT AGTAACTTTG
CCAATAAGGG ACTCAACACA AGAGAAATGG TCGCCTTATC AGGATCTCAC ACACTCGGTC
AGGCGAGATG TATAAGGTTC AGGGGAAGGA TATACAACAG TACATTAAGA ATAGAACCTA
ATTTTAACAG ATCCCTTAGC CAAGCCTGCC CACCAACCGG TAACGATGCT ACCTTGCGAC
CACTTGATTT GGTGACACCA AATTCGTTCG ACAACAACTA CTACAGGAAT CTTGTCACAA
GTAGGGGTCT TCTTATATCA GACCAGGTGC TTTTTAACGC TGACTCTACC GATAGCATCG
TGACTGAGTA TGTCAACAAT CCTGCAACGT TTGCCGCTGA TTTTGCTGCA GCCATGGTTA
AGATGAGTGA AATTGGTGTT GTTACTGGTA CTAGTGGGAT TGTAAGGACT CTTTGCGGTA
ATCCCAGTTA AAAAAAAATA AGGAGATGTG ATGTTATATA TGTGCAGTTA TAAACAAGTA
TTCTGCATGT GTTGTAATTC CGTAAAATGA ATAAAAGTCT CCTTTCAAAA TAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA A
Primer forward ZINF
5´ATG AGT TAT CAT AAG TCA AG 3´
Primer reverse ZINR
5´TTA ACT GGG ATT ACC GCA AA 3´
Délka amplikonu = 966 bp
36
5.3. Izolace RNA
Izolovaná RNA byla podrobena elektroforéze v 1,0% agarózovém gelu (12V/cm,90 minut),
výsledek je zaznamenán na obr. 11. Ze 100 mg vstupního materiálu je možné získat
přibližnepřibližně 45 ug RNA. Já jsem z 1,5 g tedy získal mohl získat přibližně 675 ug RNA
Obr. 11: Výsledek izolace RNA,
1 2 ladder
37
5.4. Amplifikace
Gen pro peroxidázu jsem amplifikoval pomocí metody polymerázové řetězové reakce
(PCR).
Pro zjištění vhodné teploty annealingu (fáze, při které se primery připojují
k jednořetězcové matrici) jsem zvolil teplotní rozmezí od 50,0°C do 65,0°C. Přesné teploty
jsou uvedeny v tabulce 3. Z dosažených výsledků je patrné, že nejvhodnější teplota pro
annealing byla 52,2 až 61,0°C.
Tabulka 3: Teploty annealingu v jednotlivých reakčních jamkách
zkumavka 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
teplota [°C ] 50,0 50,4 51,3 52,5 54,2 56,4 58,9 61,0 62,7 63,9 64,7 65,0
V Tabulce 4 je uvedeno složení reakčních směsí pro PCR. V první části tabulky je seznam a
množství jednotlivých vstupních komponent pro uskutečnění jedné reakce, druhé potom
množství pro patnáctinásobek reakce.
Naformátováno: Zarovnat do bloku
Naformátováno: Zarovnat do bloku
38
Tabulka 4: Směs pro PCR.
komponenta Množství [ul] Množství [ul] x 15
Taq Man Rt enzyme mix 0,25 3,8
Taq Man RT PCR mix 5,00 75,0
primer ZinF ( 100uM) 0,25 3,8
primer ZinR ( 100uM) 0,25 3,8
Templát (RNA) 1,00 15,0
voda 3,25 49,0
V Tabulce 5 je PCR program, který měl zajistit zisk klonů DNA v dostatečném množství
pro úspěšnou transformaci. Kroky 3, 4, a 5 jsem uzavřel do cyklu, který jsem nechal opakovat
34x.
Naformátováno: Odsazení: První
řádek: 1,25 cm
39
Tabulka5: Struktura PCR programu
Krok č.
Program ZINNIA
teplota [°C] doba trvání [s]
1 RT 48 900
2 AKT 95 600
3 DEN 95 15
4 ANNEALING (50-65) 20
5 Polymerace 60 40
6 60 30
7 10 bez konce
8 END
Výtěžek amplifikace jsem zhodnotil po provedení elektroforézy na 1,5% agarózovém
gelu. Pro tento účel jsem připravil 1,5% agarózový gel, do první jamky jsem nanesl ladder
v množství 5 μl, do dalších vzorky v množství 2μl + 3μl promíchané s koncentrovaným
nanášecím pufrem (6xGLB). Elektroforéza probíhala při 120 V 120 minut.
Naformátováno: Odsazení: První
řádek: 1,25 cm
40
Výsledek 1. Amplifikace je zaznamenán na obr. 12
Obr. 12: Amplifikace č. 1.
číslo reakční jamky
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ladder (2x)
Výsledek první amplifikace byl neuspokojivý, protože amplikony nevznikaly
v dostatečném množství. Jako možné řešení jsem upravil program ZINNIA. Jeho algoritmus /
struktura je v tabulce 6.
Naformátováno: Odsazení: První
řádek: 1,25 cm
41
Tabulka 6: Upravený program ZINNIA
Krok č.
Program ZINNIA
teplota [°C] doba trvání [s]
1 RT 48 900
2 AKT 95 600
3 DEN 95 15
4 ANNEALING (50-65) 90
5 Polymerace 60 40
6 60 30
7 10 bez konce
8 END
Po provedených změnách už byla kvalita i množství amplikonů vyhovující, což je
patrné z obr. 13.
Naformátováno: Odsazení: První
řádek: 1,25 cm
42
Obr. 13: Amplifikace č. 2
Číslo reakční jamky:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ladder
Pro vyhodnocení amplifikace jsem použil elektroforézu v agarózovém gelu. Připravil
jsem 1,5% agarózový gel, do první jamky jsem nanesl ladder v množství 5 μl a vzorky jsem
promíchal s koncentrovaným nanášecím pufrem (6× GLB), a to 5 μl vzorku a 2 μl 6× GLB,
a nanesl postupně do jednotlivých jamek. Elektroforéza s 80 ml gelu pak probíhala při
120V 40 minut.
Naformátováno: Odsazení: První
řádek: 1,25 cm
43
5.5. Ligace
Ligaci jsem uskutečnil za použití příslušného PCR produktu a komerčního vektoru
pETBlue ze soupravy „1 AccepTor Vector Kit“ (INVITROGEN), která poskytuje
standardizovaný set činidel vhodných k vysoce účinné ligaci a transformaci s každým typem
plasmidového vektoru a inzertu.
Tabulka 7: Složení ligační směsi
1 µl (~0.02 pmol) AccepTor™ Vector (50 ng/µl)
0.5 – 4.0 µl (0.1 – 0.2 pmol PCR product (or 2 µl AccepTor™ Control Insert) X µ
5.0 µl Clonables™ 2X Ligation Premix
Nuclease-free
water
to a total of 10 µl
Celou směs je třeba před transformací inkubovat 30 minut při 16°C a pak je teprve
vhodná k použití.
5.6. Transformace
Buňky NovaBlue SinglesTM Competent je nutné nejprve rozmrazit a pak temperovat
5 minut na ledu, potom jsem k nim přidal 1 µl ligační směsi a promíchal, po tomto kroku jsem
buňky vrátil zpět na led na dobu 5 minut. Následně jsem provedl transformaci tzv. tepelným
šokem. Směs jsem vložil do vodní lázně s teplotou 42°C na 30s. Tuto dobu je nutné přesně
dodržet pro úspěch celé transformace. Po 30s jsem buňky vrátil zpět na led na dobu 2 min.
Následkem těchto prudkých změn teploty buňky přijaly cizorodou DNA. V dalším kroku jsem
nechal buňky regenerovat s přídavkemve 250 µl SOC média. Toto médium umožňuje buňkám
Naformátováno: Odsazení: První
řádek: 1,25 cm
44
regeneraci a expresi β-galaktozidázy a rezistence vůči ampicilinu. Kultivace probíhala při
37 °C po dobu 30 minut. Po této době se obnovilo buněčné dělení a buňky bylo možné vyset
na selekční LB agar, na kterém jsme nechali buňky kultivovat při 37 °C přes noc. Pěstoval
jsem na 4 Petriho miskách a v tabulce je uveden počet kolonií i s výsledkem modro/bílého
testu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce
Tab. 8: Výsledek kultivace – počty kolonií
miska
modré
kolonie bílé kolonie
A 14 3
B 23 6
C 10 11
D 41 13
Počet bílých kolonií by měl odpovídat počtu úspěšných transformací.
45
Obr. 14: Fotografie misek s koloniemi. Foceno fotoaparátem Olympus při denním světle.
Barva kolonií není z fotografií poznat, protože při počítání jsem si je barevně značil pro lepší
orientaci.
Miska A (14 modrých kolonií a 3 bílé)
Miska B (23 modrých kolonií a 6 bílých)
Miska C (10 modrých kolonií a 11 bílých)
Miska D (41 modrých kolonií a 13 bílých)
46
5.7. Další práce s narostlými koloniemi
Kultivace ve formě čárek Vyrostlé bakterie jsme ve formě čárek přeočkovali opět na
LB selekční agar. Po přeočkování následovala opět kultivace při 37 °C po dobu 16 hodin,
kultivoval jsem jen buňky z bílých kolonií. Ty totiž na základě modro/bílého testu měly
obsahovat insert. Bohužel narostly jen modré čárky, což znamená, že buňky neobsahovaly
mnou vkládaný insert a k bílému zbarvení došlo z jiných důvodů. Ve formě čárek narostly
pouze modré bakterie.
Obr. 15: Výsledek kultivace kolonií ve formě čárek
Miska 1 Miska 2
47
5.8. Izolace plasmidové DNA a analýza konstruktů
Konstrukce použitého vektoru umožnuje izolaci úseku, který je navržen přímo
k vložení inzertu. Obr. 17 Plasmidovou DNA jsem izoloval pomocí komerčně dostupného kitu
z 10 kolonií Izolovanou DNA jsem amplifikoval metodou PCR a provedl elektroforézu na 1,5
% agarózovém gelu. V případě, že by se transformace podařila by izolované a amplifikované
fragmenty DNA měly velikost přes 1 400 bp. Jak je vidět na Obr. 16, mnou izolovaná DNA má
velikost přibližně. 400 bp. Což odpovídá velikosti úseku určenému k vkládání cizí DNA a je
tedy jasné , že se mně nepodařilo do něj nic vložit.
Tady opravdu chybí popis
1) Jaký komerční kit jste použil pro izolaci plasmidové DNA
2) Jaké bylo složení směsi pro PCR a jaký program byl použit.
Obr. 16: Izolace plazmidové plasmidové DNA
48
6. Diskuse
6.1. Příprava rostlinného materiálu
Na tuhém a vysterilizovaném MS médiu jsem pasážoval kalusy z buněk apikálního
meristému mladé rostlinky. Pasážování bylo úspěšné a získal jsem dokonce několik linií
kalusů. Obr.10 Dlouhodobým pasážováním jsem získal kvalitní zdroj mRNA.
6.2. Izolace RNA
Izoloval jsem RNA z kalusů apikálního meristému mladé rostlinky. Tyto buňky mají
téměř neomezenou dělitelnost a jsou pluripotentní. Buněčné kultury, z dělících se buněk
(meristematické kultury) vytvářejí in vitro tzv. kalusy. Buňky meristematického kalusu se
neustále dělí a proto je v nich velké značné množství RNA. Při izolaci genetického materiálu
z rostlinných buněk je zapotřebí kompletní a rychlé rozbití výchozího materiálu. Tím se zajistí
vysoké výtěžky a zamezí se degradaci RNA působením vnitrobuněčných enzymů. K izolaci
RNA je možno použít jakýkoli rostlinný materiál, nejvhodnější jsou měkké tkáně, zejména
rychle rostoucí klíčky rostlin, které obsahují velké množství genetického materiálu, mají
méně polysacharidů a polyfenolů a buňky mají měkké buněčné stěny. Mechanické rozbití
buněčné stěny je vhodné provést třením v misce. Možností jak si proces zjednodušit, je
provést zmrazení tekutým dusíkem a následně podrtit zmraženou tkáň. Zmražením se stěna
stane křehčí a zároveň se inhibují enzymy, které by degradovaly RNA.17
RNeasy Mini Kit Plus je určen pro izolaci RNA z malého množství živočišné buňky nebo
tkáně. Souprava je kompatibilní s širokou škálou kultivovaných buněk a snadno lyzuje tkáně.
Kontaminace genomovou DNA je účinně eliminována pomocí speciálně navržené gDNA
eliminační kolonky. Získaná RNA je připravená k použití a je ideální pro použití v úkonech,
které jsou citlivé vzhledem k nežádoucí kontaminaci DNA, jako jsou např. metody
kvantitativní PCR, RT PCR. Postup RNeasy Plus integruje patentované technologie firmy
Qiagen pro selektivní odstranění dvouvláknové DNA s dobře zavedenou RNeasy technologií.
Účinná izolace vysoce kvalitní RNA je zaručena, bez potřeby dalšího odstraňování DNA.
Biologické vzorky jsou nejprve lyzovány a homogenizovány ve vysoce denaturačním
Naformátováno: Barva písma: Text 1
Naformátováno: Nadpis 2
Naformátováno: Písmo: není Tučné,
Barva písma: Text 1
Naformátováno: Písmo: (výchozí)
+Nadpisy (Cambria), Barva písma:
Akcent 1
49
guanidin-isothiokyanátu obsahujícím pufr, který okamžitě inaktivuje RNázy pro zajištění
izolace intaktní RNA. Lyzát se pak nechá projít gDNA eliminační centrifugační kolonkou. 18
Tato kolonka, v kombinaci s optimalizovaným vysoce slaným pufrem, umožňuje
efektivní odstranění genomové DNA. V dalším kroku se do průtokové kolonky přidá ethanol,
který zajistí odpovídající vazebné podmínky pro RNA, a vzorek je pak přenesen na
ostřeďovací RNeasy kolonku, kde se kompletní RNA váže na membrány a nečistoty jsou
účinně odplaveny. Vysoce kvalitní RNA se pak vymývá v 30 a více ul vody.17
S postupem RNeasy Plus jsou izolovány všechny molekuly RNA delší než 200
nukleotidů. Postup poskytuje „zkvalitněnou „ mRNA, protože většina RNA s velikostí <200
nukleotidů (jako je například 5.8S rRNA, 5S rRNA, tRNA a, které dohromady tvoří 15 - 20% z
celkové RNA) jsou selektivně vyloučeny. Distribuce velikosti čištěné RNA je srovnatelná
s metodou centrifugace přes CsCl vrstvu, kde není sedimentace malých molekul RNA příliš
účinná.17
Kvalitu mnou izolované RNA jsem ověřil elektroforézou na agaróovém gelu. Na
elektroforéze (viz. Obr. 11) jsem viděl izolované molekuly 28S a 18S rRNA, což je dobrým
indikátorem kvalitní izolace. Tyto molekuly jsou v buňkách významně zastoupeny a na
elektroforetickém gelu je možné je zaznamenat. Molekuly mRNA, kterých je mnoho druhů,
na gelu vidět nejsou nebo jsou vidět ve formě „smíru“.
6.3. Určení nukleotidové sekvence a návrh primerů
Pro každou genetickou manipulaci je zásadní znalost sekvence zvoleného proteinu. Já
jsem sekvenci cílového proteinu získal z odborného článku prof. Gabaldona10
, který se
studiem peroxidázy zabýval a podařilo se mu ji izolovat a zjistit její genetickou sekvenci.
Primery jsem pak navrhl podle počátečních a koncových nukleotidů v sekvenci. Pro
návrh primerů pro standardní primer forward se musí shodovat s počátkem sekvence
matricového vlákna DNA. Primer reverse jsem navrhnul podle konce kódující sekvence
matricového vlákna. Návrh primerů je pro celou transformaci zásadní, a proto PCR je třeba
brát v úvahu několik důležitých pravidel, mezi něž patří: délka zpravidla 18-25 nukleotidů,
obsah G+C 40% až 60%, rovnoměrná distribuce oblastí bohatých na G/C a A/T páry,
specifičnost primerů (na matricové DNA nesmí být nespecifická vazebná místa), absence
Naformátováno: Odsazení: První
řádek: 1,25 cm
50
komplementárních sekvencí v primerech (mohly by vést k tvorbě duplexů), absence vnitřních
sekundárních struktur (vlásenek) a to nejdůležitější: zařazení 1 až 2 zbytků G nebo C
v sekvenci na 3'- koncích primerů pro zajištění přesné vazby na templát.17
Já jsem se ale
musel držet struktury kódující sekvence genu, proto jsem většinu uvedených pravidel
nemohl respektovat. Dodržel jsem ale délku primerů, která činila 20 a 20 nukleotidů, obsah
G+C byl 20 a 15%. Přesné nasednutí primerů na cílovou sekvenci jsem pak testoval použitím
gradientového termocykleru, který umožňuje v jednom experimentu nastavit několik
různých teplot připojení primerů (annealing). 17
Výsledek diskutuji v kapitole 6.4.
6.4. Příprava genu pro peroxidázu amplifikací
Gen pro peroxidázu jsem amplifikoval metodou PCR. Program, který jsem pro reakci
navrhl, se neukázal jako dostačující, a proto bylo nutné jej modifikovat. Pro zjištění vhodné
teploty annealingu jsem nastavil teplotní gradient od 50°C do 65°C. Během tohoto kroku
primery dosedají na matricové vlákno DNA, je teplota určujícím faktorem pro specifičnost
reakce. Podle vyfocených Agarozóvých gelů je vidět, že nejvhodnější teplota annealingu byla
mezi 52,2°C a 58,9°C. Při nízkých teplotách není dostatečná specifičnost reakce, na gelu je
možno pozorovat řadu nespecifických produktů a při vysokých teplotách se amplikony
netvoří, protože se destabilizují vodíkové vazby mezi sekvencí a primerem.
A já jsem viděl toto: Jak je vidět na Obr. 12, p Při teplotách annealingu do …………………… °C
se opravdu tvořilo určité množství produktů, které ovšem nebyly dostatečně zřetelné. Při
teplotách nad 58,9°C se nevytvořilo nic. Optimální byly hodnoty ………………
6.5. Ligace a transformace bakteriální buněk E. coli
Dalším krokem bylo vložení amplikonů do vektoru. Použil jsem komerční vektor
pETBlue-1 (obr. 17). Termostabilní DNA polymeráza často poskytuje amplikony, které mají
jeden přečnívající 3´-dA nukleotid, linearizovaný AccepTor vektor pak obsahuje jeden
přesahující 3´-dU nukleotid a může se tudíž jednoduše spojit s amplikonem. Spojení
51
amplikonu a vektoru zajišťuje enzym DNA ligáza. Během transformace jsou dU nukleotidy
nahrazeny dT nukleotidy a plasmid se normálně replikuje v bakteriální buňce.
6.6. Transformace
Transformace je proces vnesení tohoto produktu do bakteriální buňky. Součástí kitu,
který jsem použil, byly NovaBlue kompetentní buňky, které jsem transformoval metodou
tepelného šoku. Vektor, který jsem k transformaci použil, nese gen pro rezistenci na
ampicilin (exprese β-laktamázy), což se dá využít k selekci buněk nesoucích vektor, při
kultivaci na médiu obsahujícím ampicilin. Další gen, který vektor nese je gen pro βgalaktozidázu,
čehož se využívá k vizuálnímu screeningu bakterií a k oddělení buněk
obsahujících vektor s inzertem od buněk s vektorem bez inzertu.
pETBlue systém vektorů je soubor klonovacích vektorů, který umožňuje vysokou
úroveň exprese zvolených genů v E. coli19
. Soupravy Acceptor Vector jsou navržené pro
jednoduché vkládání PCR produktů s použitím termostabilní DNA polymerázy, jako je např.
Taq DNA polymeráza. Tyto DNA polymerázy nechávají jednotlivé 3 'dA přesahy na reakčních
produktech. Linearizovaný Accep Tor vektor DNA obsahuje jednotlivé 3’ dU přesahy a tak
mohou být ligovány do PCR produktu bez modifikace. Souprava obsahuje ligační premix tj,
unikátní ligační směs, která obsahuje ligázu, pufr a kofaktory pro rychlou a účinnou ligaci. Kit
také obsahuje nachystané kompetentní buňky NovaBlue Singles pro transformaci a ligaci. Kit
také obsahuje nachystané kompetentní buňky NovaBlue Singles pro transformaci a ligaci.
Hostitelský kmen NovaBlue je vhodný pro klonování a ověření konstrukce vektorů Accep Tor
díky vysoké účinnosti transformace a obsažené recA endA mutace, které vedou k vysokým
výtěžkům a vynikající kvalitě plasmidové DNA.20
Použití vektoru označeného AccepTor a kompetentních buněk NovaBlue Single
umožňuje vizuální rozlišení kolonií obsahujících vektor s insertem a vektor bez insertu. Jedná
se o tzv. modro/bílý test. Této vizuální identifikace klonů je dosaženo použitím oslabeného
konstitutivního promotoru (tet) původem z E. coli k řízení exprese α-peptidu lacZ, samotná
exprese cílového genu je pak řízena promotorem T7lac.20
52
Polyklonovací místo je vloženo do genu pro β-galaktozidázu tak, že nedochází
k posunu čtecího rámce, a tudíž není porušena struktura ani aktivita tohoto enzymu.
V případě, že nedojde k včlenění inzertu do vektoru, dojde k expresi funkční β-galaktozidázy.
Tento enzym štěpí v přítomnosti induktoru IPTG (isopropyl-β-D-thiogalaktozid) substrát X-gal
(5- bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-galaktozid) na modře zbarvený produkt – vznikají modré
kolonie. Vložením inzertu do polyklonovacího místa dojde k narušení exprese enzymu,
a nedochází tedy k štěpení X-gal. Vzniklé kolonie jsou bílé.20
AccepTor vector umožňuje modro/bílý screening transformantů, k rozlišení těch
kolonií, jejichž bakterie mají rekombinantní plasmid, a které jej nemají. Když jsou bakterie
naočkovány na X-gal/IPTG zkoušecí misku, kolonie s rekombinantním plasmidem jsou bílé
a kolonie bez rekombinantního plasmidu modré. 20
Obr. 17: Mapa vektoru pETBlue-1 s vyznačením významných míst pro klonování,
převzato z User Protocol TB248
,
pETBlue vektor umožňuje expresi zvolených genů v E. coli na vysoké úrovni. Exprese
proteinů bez N- terminálního konce je dosaženo T7 RNA polymerázou řízenou z T7
Naformátováno: Zarovnat do bloku
53
promotoru. Ribozomální vazebné místo ve vektoru je vhodně umístěno od 5ꞌ k AccepTor
klonovacímu místu (EcoRV) pro dosažení iniciace translace z místa počátku ATG. První primer
pro PCR amplifikaci, která poskytne požadovaný produkt musí začínat kodonem ATG na 5ꞌ
konci. Ligace provedená s AccepTor vektorem poskytne optimální vzdálenost mezi
ribozomálním vazebným místem a translačním místem. 20
Zbytečné, expresi jsme nedělali
6.6. Transformace
Cílové proteiny vložené do vektoru pETBlue-1 mohou být exprimovány v expresních buňkách
E. coli pouze pod podmínkou, že je insert ve správné orientaci vztažené k T7lac promotoru
vektoru, a že insert obsahuje počáteční kodon ATG na svém 5´-konci. Transkripce dále
požaduje zdroj T7 RNA polymerázy, kterou dodávají expresní buňky pod kontrolou lacUV
promotoru, a tudíž poskytují expresi T7 RNA polymerázy a klonovaných genů indukovanou
IPTG. Exprese byla indukována pomocí IPTG. Tady možná popsat modro/bílý test.
6.7. Screening transformantů
AccepTor vector je přizpůsoben k vizuálnímu screeningu bakterií. Toho je dosaženo
umístěním polyklonovacího místa v genu pro β-galaktozidázu a to tak, aby nedošlo k posunu
čtecího rámce, tudíž aby nebyla porušena struktura ani aktivita enzymu. V případě, že
nedojde k včlenění inzertu do vektoru, dojde k expresi funkční β-galaktozidázy
a v přítomnosti induktoru IPTG (isopropyl-β-D-thiogalaktozid) a barevného substrátu X-gal
(5-bromo-4- chloro-3-indolyl-β-D-galaktozid) enzym štěpí X-gal za vzniku modrého zbarvení –
kolonie modrého fenotypu. Vložením inzertu do polyklonovacího místa dojde však k narušení
exprese enzymu, β-galaktozidáza nevzniká, tudíž nemůže štěpit X-gal a vzniklé kolonie jsou
bílého fenotypu. Navíc se mohou objevit i kolonie světle modré barvy nebo bílé kolonie
modrající při skladování. Oboje pravděpodobně obsahují vektor s inzertem. Dochází zde
k tvorbě malého množství β-galaktozidázy. Existují i další metody screeningu, jako např.
54
použití vektor-specifických primerů ohraničujících klonovací místo, tuto metodu jsem ovšem
nevyužil. Po vysetí bakterií na selekční agar s ampicilinem jsem pozoroval modré a světle
modré kolonie a menší množství bílých kolonií, což dávalo předpoklad pro úspěšnou
transformaci.
6.8. Izolace plasmidové DNA a ověření konstruktů
K ověření úspěšnosti transformace, jsem izoloval plazmidovou plasmidovou DNA z 10
kolonií, které před přeočkováním ve formě čárek měly bílou barvu. K izolaci jsem použil
komerční kit. A izolovanou DNA amplifikoval metodou PCR. K vyhodnocení amplifikace jsem
použil elektroforézu na agarózovém gelu.
Jak je vidět na Obrobr. 18, vektor je navržen tak, že místo pro vložení inzertu se
nachází mezi dvěma primery. Primer forward - pETBlueT7UP primer #70725-3, a primer
rewerse - pETBlueDOWN primer #70603-3Tato skutečnost umožňujěumožňuje izolaci celého
úseku, ať už s inzertem nebo bez něj.
Za předpokladu, že jeden ribonukleotid izolované RNA má molekulovou hmotnost
360, byAmplikon genu fragment, který jsem izoloval z plasmidů (má délku délka 966
nukleotidůbp), měl molekulovou hmotnost 360*966=347760. Po spojení s vektorem by měla
být vzdálenost mezi primery použitými pro PCR (a tedy velikost amplikonů) mít velikost
1 416 bp a molekulovou hmotnost 509760.
Vektory bez naklonovaného genu pak poskytují amplikony o délce ………… 200 nebo 400 jak
výše uvádíte?
Protože měly všechny amplikony délku kolem ….. bp, neprovedli jsme další ověření
sekvenováním, protože konstrukty požadovaný inzert zjevně neobsahovaly.
Naformátováno: Odsazení: První
řádek: 1,25 cm
55
6.8. Izolace plasmidové DNA a ověření konstruktů
K ověření úspěšnosti transformace, jsem izoloval plasmidovou DNA z 10 kolonií, které před přeočkováním ve formě čárek měly bílou
barvu. K izolaci jsem použil komerční kit. A izolovanou DNA amplifikoval metodou PCR. K vyhodnocení amplifikace jsem použil elektroforézu na
agarózovém gelu.
Jak je vidět na Obr. 18, vektor je navržen tak, že místo pro vložení inzertu se nachází mezi dvěma primery. Primer forward - pETBlueT7UP
primer #70725-3, a primer rewerse - pETBlueDOWN primer #70603-3 Tato skutečnost umožňujě izolaci celého úseku, ať už s inzertem
nebo bez něj. Za předpokladu, že jeden ribonukleotid izolované RNA má molekulovou hmotnost 360, by fragment, který jsem izoloval
z plasmidů (délka 966 nukleotidů), měl molekulovou hmotnost 360*966=347760. Po spojení s vektorem by měl mít velikost 1416bp a
molekulovou hmotnost 509760.
56
Obr. 18 struktura místa uzpůsobeného pro transformaci.
57
- z jakých kolonií jste izoloval plasmidy - z modrých či bílých?
- z kolika kolonií jste izoloval plasmid
- že byl výsledek sekvenování negativní, jak jste hledal ten inzert? Inzert jsme hledali jen
takto, na sekvenování se už nic neposílal
58
7. Závěr
1) Na Murashige- Skoog médiu jsem vypěstoval kulturu meristematických buněk Zinnia
elegans ve formě kalusu.
2) Z buněk jsem izoloval mRNA, kterou jsem použil jako zdroj genetického materiálu. Její
kvalitu jsem ověřil elektroforézou.
3) Provedl jsem zpětnou transkripci izolované mRNA.
4) Transkripty jsem amplifikoval pomocí specifických primerů a získal dostatečné
množství dsDNA pro klonování.
5) Takto získanou DNA jsem vložil do plasmidového vektoru.
6) Výsledným konstruktem jsem transformoval buňky E. coli, které byly speciálně
k tomuto účelu upraveny.
7) Transformované buňky jsem kultivoval na selekčním médiu a narostlé kolonie buněk
jsem dále namnožil.
8) Z klonů jsem izoloval plasmidovou DNA, kterou jsem nechal na přítomnost
osekvenovat komerčním subjektem.ověřil metodou PCR
9) Výsledky sekvenování PCR nepotvrdily naklonování genu pro peroxidázu do
plasmidového vektoru.
59
8. Seznam použitých zkratek
Různé typy písma!!!!
A Adenin
C Cytosin
cDNA komplementární DNA kódující pouze oblasti exprese (complementary
DNA)
E. coli Escherichia coli
EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová
G Guanin
IPTG isopropyl-β-D-thiogalaktozid
LB Luria-BertamiBertani
mRNA mediátorová ribonukleová kyselina
NADPH
Nikotinamidadenindinukleotidfosfátnikotinamidadenindinukleotidfosfát
NADH Nikotinamidadenindinukleotidnikotinamidadenindinukleotid
PCR polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)
RNA ribonukleová kyselina
DNA deoxyribonukleová kyselina
rpm počet otáček za minutu (repeats per minute)
SOC médium tekuté médium; složené z tryptanu, NaCl, kvasinkového extraktu,
glukosy a vody
T ThiminThymin
TBE pufr pro agarózovou elektroforézu; složený z Tris báze, kyseliny borité,
ethyldiamintetraacetátu disodného a vody
X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktozid
60
9. Literatura a zdroje
Proboha - opravte i velikost písma a formátování
1. ALBERTS, B; BRAY, D; JOHNSON, A; LEWIS, J; RAFF, M; ROBERTS, K; WALTER, P; Základy buněčné
biologie, Esperero Publishing, Ústí nad Labem 1998
2. MAREŠOVÁ, J; Příprava rekombinantního proteinu TTF3 v prokaryotickém expresním systému.
Diplomová práce, VFU Brno 2010
3. (http://botanika.wendys.cz/kytky/K399.php
4. http://botanika-v-kostce.blogspot.cz/2011/05/2-bunecna-stena.html
5. http://chemistry.ujep.cz/userfiles/files/Celuloza.pd
6. NEČAS, O a kolektiv; Obecná biologie pro lékařské fakulty, Praha, H& H 2000
7. GLOSSER, J, Fyziologie rostlin Masarykova univerzita, fakulta přírodovědecká, Brno 1995
8. PAVLOVÁ, L; Fyziologie rostlin, Praha, Karolinum 2006
9. KLOUDA, P; Základy biochemie, Pavel Klouda, Ostrava 2005
10.LUŠTINEC, J; ŽÁRSKÝ, V; Úvod do fyziologie vyšších rostlin, Univerzita Karlova v Praze, Karolinum
2003
11.Carlos Gabaldón, Matías López-Serrano, Federico Pomar, Fuencisla Merino, Juan Cuello, M.A.
Pedreño, A. Ros Barceló, Characterization of the last step of lignin biosynthesis in Zinnia elegans
suspension cell cultures, FEBS Letters, Volume 580, Issue 18, 7 August 2006, s. 4311-4316
12.Sabine Lüthje, Claudia-Nicole Meisrimler, David Hopff, Benjamin Möller, Phylogeny, topology,
structure and functions of membrane-bound class III peroxidases in vascular plants, Phytochemistry,
Volume 72, Issue 10, July 2011, s. 1124-1135,
13. Marcel Zámocký, Paul G. Furtmüller, Christian Obinger, Evolution of structure and function of
Class I peroxidases, Archives of Biochemistry and Biophysics, Volume 500, Issue 1, 1 August 2010, s.
45-57
14. Igor Cesarino, Pedro Araújo, Adriana Franco Paes Leme, Silvana Creste, Paulo Mazzafera,
Suspension cell culture as a tool for the characterization of class III peroxidases in sugarcane, Plant
Physiology and Biochemistry, Volume 62, January 2013, s. 1-10,
15.Alfonso Ros-Barceló, Federico Pomar, Matías López-Serrano, Pilar Martínez, María A Pedreño,
Developmental regulation of the H2O2-producing system and of a basic peroxidase isoenzyme in the
Zinnia elegans lignifying xylem, Plant Physiology and Biochemistry, Volume 40, Issue 4, April 2002,
Pages 325-332,
61
16.Farida Minibayeva, Richard Peter Beckett, Ilse Kranner, Roles of apoplastic peroxidases in plant
response to wounding, Phytochemistry, Available online 12 July 2014,
17. ŠMARDA, J; DOŠKAŘ, J, PANTŮČEK, R; RŮŽIČKOVÁ, V; KOPTÍKOVÁ, J; Metody molekulární biologie.
, Brno, Masarykova univerzita 2010
18. http://shodhganga.inflibnet.ac.in:8080/jspui/bitstream/10603/9074/16/16_table.pdf
19. .ttp://www.britannica.com/EBchecked/topic/570661/suberin
20. Novagen User Protocol TB248 Rev. E 0111 Jn
21. Farida Minibayeva, Richard Peter Beckett, Ilse Kranner, Roles of apoplastic peroxidases in plant
response to wounding, Phytochemistry, Available online 12 July 2014,
22. BARTOŠ, M; FOREJTNÍKOVÁ, H; BARTOŠOVÁ, L. Biotechnologie pro
farmaceuty: Návody k praktickým cvičením. Brno : VFU Brno, 2006. 98 s.
23. SLAVÍKOVÁ, Z; Morfologie rostlin, Univerzita Karlova v Praze, Karolinum 2002
24. http://marid.bioc.cam.ac.uk/credo/structures/2GHH
25. http://web2.mendelu.cz/af_211_multitext/obecna_botanika/texty-cytologie-
rostlinna_bunka.html
26. http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/bunka/2010/0910_05.pdf
27. http://study.upol.cz/predmet/BOT/PGSFB?lang=cs
28. www. plantphys.net
29. BARTOŠ, M; KOLORZ, M; HOŠEK, J; BARTOŠOVÁ, L; Biotechnologie a farmakogenetika pro
farmaceuty: Návody k praktickým cvičením. Brno, VFU Brno, 2008. 85 s.
30. RNeasy Plus Mini Handbook 09/2010
31. Larissa Barelli, Israel Enrique Padilla-Guerrero, Michael J. Bidochka, Differential expression of
insect and plant specific adhesin genes, Mad1 and Mad2, in Metarhizium robertsii, Fungal Biology,
Volume 115, Issue 11, November 2011, s. 1174-1185
32. Andreas E. Voloudakis, Philippe Marmey, Etienne Delannoy, Aida Jalloul, Christelle Martinez,
Michel Nicole, Molecular cloning and characterization of Gossypium hirsutum superoxide dismutase
genes during cotton–Xanthomonas campestris pv. malvacearum interaction, Physiological and
Molecular Plant Pathology, Volume 68, Issues 4–6, April–June 2006, s. 119-127
33. Edith Francoz, Philippe Ranocha, Huan Nguyen-Kim, Elisabeth Jamet, Vincent Burlat, Christophe
Dunand, Roles of cell wall peroxidases in plant development, Phytochemistry, Volume 112, April
2015, s. 15-21,
62
34. Zhiqing Gong, Dajing Li, Chunquan Liu, Anwei Cheng, Wenliang Wang, Partial purification and
characterization of polyphenol oxidase and peroxidase from chestnut kernel, LWT - Food Science and
Technology, Volume 60, Issue 2, Part 2, March 2015, s. 1095-1099
35. Chii-Jeng Wang, Yuan-Li Chan, Chin Hui Shien, Kai-Wun Yeh, Molecular characterization of fruitspecific
class III peroxidase genes in tomato (Solanum lycopersicum), Journal of Plant Physiology,
Volume 177, 1 April 2015, s. 83-92,
36. Y.N. Shkryl, G.N. Veremeichik, V.P. Bulgakov, T.V. Avramenko, E.A. Günter, Y.S. Ovodov, T.I.
Muzarok, Y.N. Zhuravlev, The production of class III plant peroxidases in transgenic callus cultures
transformed with the rolB gene of Agrobacterium rhizogenes, Journal of Biotechnology, Volume 168,
Issue 1, 10 October 2013, Pages 64-70,
37. Igor Cesarino, Pedro Araújo, Juliana Lischka Sampaio Mayer, Adriana Franco Paes Leme, Paulo
Mazzafera, Enzymatic activity and proteomic profile of class III peroxidases during sugarcane stem
development, Plant Physiology and Biochemistry, Volume 55, June 2012, s. 66-76,
38. http://www.stefajir.cz/?q=ampicilin
39. Carolina Andreia Cateto, Maria Filomena Barreiro, Alírio Egídio Rodrigues, Mohamed Naceur
Belgacem, Kinetic study of the formation of lignin-based polyurethanes in bulk, Reactive and
Functional Polymers, Volume 71, Issue 8, August 2011, s. 863-869,
40. Edith Francoz, Philippe Ranocha, Huan Nguyen-Kim, Elisabeth Jamet, Vincent Burlat, Christophe
Dunand, Roles of cell wall peroxidases in plant development, Phytochemistry, Available online 7
August 2014
41. https://www.qiagen.com/cz/products/catalog/sample-technologies/rna-sample-
technologies/total-rna/rneasy-plant-mini-kit/#productdetails