Genetické markery Marker (genetický marker) = signální gen, signální linie ■ morfologické ■ bílkovinné (izoenzymy) ■ DNA 1. založené na hybridizaci DNA 2. založené na polymerázové řetězové reakci amplifikace - specifických sekvencí - náhodných sekvencí I 2 J 4 I 2 J 4 1234 12 3 4 Figure 1 - Inhibition pattern torcharacterization of esterases from leaves of Aspidospentut polrneurotr showing thai Hsl-3, l:st-4, and lisl-6 isoiryisic.i were- inhibited in iha presence Of" Malalhiiin Hsl-jL l!st-7, Ilst-tt, and i:s.t-] 2: isozymes were detected as weakly stained bands by Folidol (C), Esl-J, Kst-4, and If si-6 isozymes were inhibited by Thtamclhoxtm (D). The gel in A shows (k and |i esterases in the absence of inhibitors. Lanes 1-4 correspond to leaf samples of diflerent planls of A. polyiit'ttr'vit. c 1 ~i j r~ Pop. 2 ~~i j Vlastnosti markem 1. vysoký polomorfizmus 2. kodominantní charakter dědičnosti 3. častý výskyt v genomu 4. nezávislost na podmínkách prostředí 5. snadná dostupnost 6. snadné a rychlé testování 7. vysoká reprodukovatelnost 8. snadná výměna údajů mezi laboratořemi Typy DNA markerů: 1. založené na hybridizaci DNA 2. založené na polymerázové řetězové reakci amplifikace - specifických sekvencí - náhodných sekvencí Klasifikace DNA markerů podle použitých sond = cílových loku s u (genů): 1. jednokopiové a vícekopiové sondy RFLP (Restriction fragment length polymorphism CAPS 2. mnohokopiové sondy mikrosatelity, RAPD, AFLP Schéma RFLP markerů RFLP Technology m? Denarure ľna md dal QíilĽ. ä 3 i.:niíí pEf*' _.. » X-ray HKTi -----1 hybrida pfth t ťl ad^Fdiťa rúbe j_ - I zolace DNA - Reštrikční analýza - Elektroforetická separace - Přenos DNA na membránu © Prentics-Hall - Značení sondy Hybridizace Vi7iia Ii7arp Schéma SSR markerů Schéma CAPS markerů RAPD DAF random amplified polymorphic DNA DNA amplification fingerprinting SCAR sequence characterised amplified regions RAPD příklady: ječmen Analyzována kolekce jarních ječmenů využívaných ve šlechtění na sladovnickou kvalitu Malé rozdíly v genetickém založení kolekce A dendrogram generated from RAPD data for H.vulgare cultivars Unweighted pair-group average Jaccard's coefficients NOVUM ALEXIS ATRIBUT BLENEHIM KARAT KRONA PERUN MALME AMULET KM1174 CE790 BITRANA MARINA KRYSTAL OTIS JUBILANT CE758 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 Linkage Distance Primer Sequence Primer Sequence Contents of CG pairs ABN-02 5'-ACCAGGGGCA-3' ABN-04 5'-GACCGACCCA-3' 70% ABN-07 5'-CAGCCCAGAG-3' ABN-08 5'-ACCTCAGCTC-3' ABN-09 5-TGC CGG CTG G-3' ABN-13 5'-AGCGTCACTC-3' ABN-14 5-TCG TGC GGG T-3' ABN-20 5-GGT GCT CCG T-3' AB2-02 5'-GGT GCG GGA A-3' AB2-09 5'-CTTCACCCGA-3' 60% AB2-10 5'-CACCAGGTGA-3' AB2-19 5 '-ACG GCG TAT G-3' ABN13xAB2 19 ABN13xAB2 10 AFLP - amplified fragment length polymorphism 1. Štepení genomové DNA dvéma restriktázami Msel EcoRI Msel EcoR\ Fragment 2. Ligace s adaptéry proMsel a EcoRI B A B C ffyšSS EcoRI adapters Msel adapters I 3. Amplifikace všech fragmentů pomocí univerzálních primerů proEcoRI a Msel Msel universal Egg EcoRI universal gags genomová DNA štěpení DNA se vzácně a často štěpícími enzymy ligace adaptérů s komplementárními konci 4. Amplifikace pomocí selektivních primerů prodloužených o 1 až 3 náhodné vybrané báze Amplifikace ano Msel selective —GA _ A ■m^lilllllllllllllilillll^ cc cc B |1EĚA___CT GA |at~ GA- EcoRI selective JGGt CC ne ne provedení PCR za přítomnosti neselektivních primerů 3 polyakrylamidový gel a jeho analýza H^H WH W* íttáHB **• kí* (BÄ *** W K ^ Vhodný pro hodnoceni Kapilární elektroforéza 1 t 5 ■ Ě^JC Využití genetických markem Základní výzkum i šlechtění Studium rostlinných genomů Otisk DNA (fingerprinting) Stanovení evolučních vztahů (příbuznost genotypů), taxonomie Genetické mapování^ 3. Genetické mapování 1. Konstrukce genetických map určitého druhu 2. Identifikace nových DNA markerů Vytváření nástrojů pro MAS (marker-assisted selection) Poziční klonování genů Konstrukce genetických map hlavních plodin 1986 - 1. mapa RFLP markerů u kukuřice a rajčete Databáze projektů zabývajících se mapováním rostlinných genomů (celkem pro 66 různých druhů rostlin) http://www.nal.usda.gov/pgdic/Map_proj/ Teoretické otázky genetického mapovaní rostlinných genomů Podstata genetického mapování Pravděpodobnost vzniku crossing-overu mezi 2 lokusy Polymorfizmus a jeho detekce Výchozí křížení Populace využívané k mapování F2 znak dominantní 3:1 znak kodominantní 1:2:1 Bx 1:1 Aneuploidní linie - viz schéma Dihaploidní linie - homozygotní materiál Rekombinantní inbrední linie (RIL) Izogenní linie (NIL) Znaky kvalitativní x znaky kvantitativní Velikost populace Počet DNA markerů pro zachycení vazby Lokalizace genů do vazbových skupin pomocí aneuploidů trizomiků 1. Mutace a je lokalizována na trizomickém chromozomu P: AAA x aa Fl: AAa Aa F2: 2 A a AA 2 AAA AAa 2Aa 4 AAa 2 Aaa 2 A 4 AA 2 Aa a 2 Aa aa Fenotypové štěpné poměry A— : aaa 1 : 0 A- : aa 8:1 2. Mutace b není lokalizována na trizomickém chromozomu P: AAABB x AAbb Fl: AAABb AABb F2: AB AAB AAABB Á Ab AAABb AB AABB Ab AABb Ab AAABb AAA b b AABb AAbb Fenotypové stepné poměry: AAA B- : AAA bb 3:1 AAB- : AAbb 3:1 Příklad: Genetické mapování mutace u druhu s malým genomem lycopodioformis Arabidopsis thaliana Materiál: morfologická mutace ly Populace F2 DNA markery - SSR (Simple sequence repeats ) mikrosatelity - CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequences) Schéma krížení m...........mutantní alela na pozadí S96 resp. DiG M.......... mikrosatelit na pozadí S96 resp. DiG +........... standardní alela na pozadí Col M...........mikro satelit na pozadí Col 0 x CO.... žádný crossing-over 1 X CO.... jeden crossing-over 2 x CO ... dva crossing-overy Rámečkem jsou označeny rostliny F2 generace mutantního fenotypu S96 S96 M X M Col Col Bi M S96 S96 m M m M OxCO S96 S96 .n n S96 S96 + M M M M S96 Col U u M S96 Col 1 x CO S96 Col SÍW Col M M Col Col 1! M 2 x CO Col Col m_i 1 + M J I- M Col Col ||im m| p I J M Genetická mapa DNA markem u Arabidopsis thaliana Počet DNA markem potřebných pro základní skríning genomu 1CH 2CH 3CH 4CH 5CH 3,9-11,4- 28,1 x 29,9 N 33,8 34,0 y EAT nga63 F19G10-23714 49,6- 66,3 — 83,8-87,0 — UFO nga280 117,8- AthATPASE 9,6- 34,5 — 50,7-57,0- 73,8- 87,6 — 90,8—b nga1145 8,4 — 20,6- — P HYB nga1126 C2SOD2 nga168 43,8- 59,2-60,0- 75,2- I 86,4- GAPC nga162 AthGAPAb nga6 CAPS zeleně SSR černě 5,1 17,7- 29,6- F1P2-TGF 57,6- 78,9 82,3^ 83,4 85,3 y 104,7- -GA1.1 nga1111 — G4539 nga1139 nga1107 8,5 9,0 14,3 15,0 16,0 17.0 18.1 23,7 38,7 — 50,5- 68,4-79,9- 93,1 - 125,1 -134,5- MUK11D CIW15 nga225 CIW18 CIW16 nga158 nga249 ■nga139 ■nga76 AthS0191 ■ FM4 PDC2 Postup 20 až 30 vzorků DNA ly z F2 Kontroly: rodiče, Fx ■ PCR pro SSR markery ■ ELFO PCR pro CAPS markery Štěpení enzymem ELFO Segregující populace F2 a molekulární analýza - příklady M C ly H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Výpočet podílu rekombinace r: (1) r = C chromozomů ^ . všech chromozomů C... rekombinovaný chromozom Výpočet střední chyby podílu rekombinace s r(l - r) n... celkový počet chromozomů Odhad mapové vzdálenosti D dle Kosambiho mapovací funkce (Kosambi, 1944): Výpočet střední chyby odhadu mapové vzdálenosti sn: Lokalizace mutantní alely ly v genetické mapě Arabidopsis 1CH 2CH 3CH 4CH 5CH 1,0 3,9 5,0 7.0 7.1 9,0 11,4 12,6 15.8 28.1 29.9 31.2 PVV4.1 EAT NT7I23 280-4-4 ^/L4\VT1G11-89778 -7/ ^ nga63 1 WIII-111 -^J=l\v cp F19G1 0-23714 NF19G9 NF21J9 ZFPG T27K12SP6 83,8 87,0-i 117,8- 135,0- nga280 9,6- 34,5 — 73,8- 90,8-97,0- ■ ngal145 PHYB ■ ngal126 CZSOD2 -T27E13 ■ C4H ■ nga168 ■Ml ■97 6,9-i^-- nga172 8,4-. chm 10,3 20,6 38,1 — 43,8- 59,2-60,0-68,2-73,9-75,2- 83,4-86,4- 101,0- AthATPASE nga162 AthGAPAb ■TOPP5 F1P2-TGF BgM ■ 280-4-8 ■ nga6 101 135 černá - SSR markery zelená - CAPS markery červená - analyzované mutace 5,1 -17,7-29,6- 57,6 — 85,3 104,7- 125,0- ■ MI122 ■GA1.1 ■ngal111 ■ G4539 ATMYB3R ngal139 ■ CAT2 ngal107 125 23,7 V |\ n9a249 33,4 y-\V nga106 38,7 50,5 68,4-79,9- 93,1 ■ 112,0-125,1 ■ 139,0- MUK11D CIW15 ly nga225 CIW18 CIW16 ng£ ■nga139 ■nga76 ■ AthS0191 ■ FM4 ■ PCD2 ■ G2368 ■139 2. Zpřesnění mapové pozice (200 mutantních rostlin) vzdálenost 1 až 3 cM (200 až 600 kb, 45 až 135 genů) 3. Identifikace kandidátních genů až 2000 F2 rostlin, identifikace dvou DNA markerů v co nej bližší pozici, identifikace rekombinantů Nezbytná vysoká vysycenost genomu DNA markery SNP, In/Del Speciální problémy řešitelné mapováním u druhů s velkým genomem Podrobné mapování určité oblasti genomu - fine mapping Mapování u druhů s velkým genomem • Identifikace DNA markerů v těsné vazbě s genem • Speciální populace pro mapování - RIL, NIL, • BSA (Bulk Segregant Analysis) s cílem MAS (marker assisted selection) selekce pristřednictvím DNA markerů • Pyramidování genů ve šlechtitelských programech RIL (recombinantisogenic lines) Rekombinantní inbrední linie ® časová náročnost © vysoká homozygotnost Křížení polymorf nich IIIIIIIIII (fenotypově kontrast- j II II II II I nich) linií U U U U U MM S « « « LLLL F2 50,0% F3 75,0% F4 87,5% F5 93,8% F6 96,9% F7 98,7% Fo 99,5% HMl Ulli, t n..;;":: SS SS SS «s SS DliiDB NIL (near isogenic lineš) Izogennílinie ® časová náročnost - vytvoření F1 + 6 x BC, selekce na daný gen (znak) v každé generaci ©vysoká homozygotnost, rozdíl jen v lokusu konkrétního genu a jeho okolí © polymorfismus (DNA) mezi NIL s vysokou pravděpodobností souvisí s vazbou marker-gen Pj Ďonor Bj Bg By P2 Recipientní rodič 9726 BSA (bulk segregantanály sis) ©rychlá příprava kontrastních skupin genotypů z F2 generace dominance, recesivita Rezistentní Segregující Náchylné BSA Rodič R Rodič 5 R-Bulk ..............► 5-Bulk RIL Rezistentní i Náchylné Genetické mapování genu odolnosti u ječmene Druh s velkým genomem ■ Hotdeum vulgare Padlí ječmen původce Blumeúa graminis f. sp. hordei v ČR i celosvětově jedna ■íl^r^ lecmene Šlechtění odolných odrůd Významné zdroje genů odolnosti jsou plané ječmeny -H. vulgare ssp. spontaneum^ H. bulbosum 23 zdrojů (donorů) odolnosti ječmene (H. vulgare ssp. spontaneurrí) k padlí ječmene (PI.....) V*TV *■ závažných chorob ječmene Genetické aspekty choroby Rostlina (hostitel) génom 1 interaction Patogen génom 2 geny odolnosti R geny avirulence Avr většinou dominant alela dominantní i i . rozpoznaní . protem 1 „-► protein 2=elicitor Aktivace mechanismů odolnosti koncept gen — proti — genu geny R 1. Mají schopnost detekovat (rozpoznat) patogena 2. Mají schopnost aktivovat obranné mechanismy Cíle studia donorů rezistence 1. Zjistit charakter dědičnosti genů v nových zdrojů odolnosti ječmene k padlí ječmene 2. Lokalizovat zjištěné geny odolnosti v genomu ječmene pomocí DNA markerů 3. Vyvinout molekulární markery pro některé ze zjištěných genů odolnosti 4. Pyramidování genů Strategie řešení 1. Vytvoření vhodných populací pro analýzy odrůda 'Tiffany'x zdroj odolnosti -► F2 2. Fytopatologické testy - P, Fl5 F2 3. Genetická analýza Určení počtu genů determinujících odolnost 4. Získání DNA markerů pro ječmen H. vulgare Určení polymorfísmu u rodičů 5. Určení DNA markerů ve vazbě s jednotlivými geny odolnosti: Analýza balků - náchylného a odolného Lokalizace genů na chromozomech ječmene Mapa SSR markem ječmene Počet DNA markerů potřebných pro základní skríning genomu 1H 2H 3H 4H 5H GH 7H 64 J8 ■ 139JS [(GMS021) -GBM1007 KBmac0399) i ABA004 ■ Bmac0213 f ABG053 ■ GBM1042 ■ Bmag0504 í(EBmac0656) ■ Bmac0345 -GBM1311 ■ Bmag0211 ■ GBM1451 ■ BmacOOQO |EBmac0405 lEBmacO501 ■ Bmac0063 ■ Bmac0032 ■ Brna c0154 ■ Bmag0382 WMC1E8 Bmag0579 (EBmac0783) 39.8 29.5" -0 ■ ŮBMS247 ■ Bmac0134 GBMS031 MWG878 GBM1187 GBM1281 ■GBMS090 IGBM1035 lůBM1121 HVM36 '(ABG318) GBM5018 GBMS002 GBM1052 Bmac0222 Bmag0692 '(Bmac0218) Bmac0093 |EBmac0557 lEBmac0607 EBmac0715 EBmac0640 '(Bmag0518) Bmag0378 'CHVHOTR1) Bmag0140 Bmag0125 EBmac0415 GBM1047 Bmag0749 ■156.5 o.o- 13.9-20.5- 32.0- 137.2-139.4" 145.4' 157.5- -ŮBM1450 ■ EBmac0705 ■ GBM1284 ■ BmagOSOS ■ Bmag0603 ■ EBmac0871 ■ Bmag0112 ■ Bmag0225 ■ Bmag0841 ■ BmagOeOO ■ Bmag0013 ■ EBmac0541 ■ HVM62 ■ EBmag07O5 -157.5 o.o- 22.4- 133.3- ■ HVM40 ■ HvOLE ■ HVM03 JCEBmac0540) 1(EBmac0669) ■CBmag0490J ■ EBmac0658 ' EBmac0635 ■ EBmac0701 ■ EBmac0788 'WMS8 ■ HVM67 U—133.3 o.o- 18.6- 37.7 ■ 41.9- 53.1 " 65.0-73.8- 88.9" 102.3 ■ 156.9- ■ ŮBM1176 ■ Bmac0163 ■ (HVM30) I Bmac0303 lBmacO096 ■ Bmag0357 ■ EBmac0684 ■ Bmag0223 - GBM1231 ■ (HvLOÍQ ■ (GMS061) EBmac0824 EBmatc0003 ŮMS027 Bmag0222 ■ GBM1164 0J0 ■ 72 ■ 31J6 " 40.4- 57 J8 " 62J0 ■ 643 " 75.4" 755 ■ 973 ' 1132 ■ 1399 ■ -0 - Bmac0316 - BamgOSOO - GBM1355 - Bmag0173 ■ EBmac0674 -(Bmag0219) ■ EBmac0602 ■ EBmacOSOe -ŮBM1140 ■ Bmac0040 ■ 139.9 79.1 - HVPLASC1B Bmag0O21 GBM1060 GBM1126 G B MS 192 (EBmac0713) Bmag0206 EBmag0794 Bmag0O07 (HVM04) GBM1326 EBmacO603 AF022725A HVCMA Bmac0187 Bmag0341 (Bmag0109) Bmag0189 Bmag0217 Bmag0321 Bmag0516 Bmac0162 EBmac0785 EBmac0827 (Bmac0224) BmagOOH (Bmac0582) Bmag0507 Bmag0385 EBmac0764 Bmag0120 EBmac0755 (Bmac0035) Bmac0156 HVPRP 157.1 Druh - ječmen Hordeum vulgare Hodnocený znak - odolnost k padlí travnímu Původce padlí travního - Blumeria graminis f. sp. hordei (houba) Populace F2 po křížení náchylná (S) x odolná (R) H. vulgare cv. Tiffany x H. vulgare ssp. spontaneum PI466200 (zdroj odolnosti - planý ječmen) Fi - F2 (100 rostlin) Úkoly 1. Určit počet genů determinujících odolnost k padlí travnímu v uvedeném zdroji odolnosti ječmene, statisticky ověřit 2. Určit typ dědičnosti genu/genů odolnosti 3. Určit SSR/CAPS markery ve vazbě (analýzou balků) 4. Se kterými markery jsou vázány geny odolnosti (použitím SW MapQTL5) • Rostliny rodičovské, Fj i jednotlivé rostliny F2 jsou otestovány virulentním izolátem Bgh • Stupnice hodnocení: 0,0-1,1,1-2,2,2-3,3,3-4,4 0 až 3 - rostliny odolné, 3-4 a 4 - rostliny náchylné Tiffany RT4 Zdroj odolnosti RTO Fj RTO • F2 balky (DNA) každý 18 rostlin • F2 100 rostlin (DNA) • F2 240 rostlin (fytopatologická analýza) Určení markerů ve vazbě s genem odolnosti k padlí travnímu u ječmene. Práce s balky. Materiál: Zdroj odolnosti (PI460200) Populace F2 (Tiffany x PI460200) Krajní třídy RTO a RT4 DNA markery - SSR (Simple sequence repeats ) CAPS (cleaved amplified polymorphis sequence) chromozom 1H chromozom 6H chromozom 2H chromozom 7H chromozom 3H chromozom 4H chromozom 5H Analýza bulku při dominanci odolnosti S - z náchylných rostlin F2 R - z odolných rostlin F2 51 - testovaný SSR marker není ve vazbě s genem odolnosti 52 - testovaný SSR marker je ve vazbě s genem odolnosti rodič 1 rodič 2 |drůda Tiffany zdroj odolnosti F2 bulk R bulkSI S2 DNA markery — aplikace ve šlechtění CR Rezistentní šlechtění markery kosegregující se znakem odolnosti Pšenice geny rezistence ke rzi, lokusy Lr99 Lr24 a Lr35 Ječmen - gen waxy, charakter endospermu - gen pro [3-amylázu - gen pro a-amylázu - gen pro odolnost k viru BYDV - geny pro odolnost k padlí ječmene Pracoviště: VURV Praha-Ruzyně, Zemědělský VU Kroměříž Brambor — geny rezistence k háďátku bramborovému a plísni bramborové (Phytophthora infestanš), lokusy H19 R1 s v Pracoviště: VU bramborářský Havlíčkův Brod, AF CZU Meruňka — mapování a identifikace AFLP markem vázaného s genem pro odolnost k viru šarky švestky Pracoviště: VURV Praha-Ruzyně ve spolupráci s pracovištěm v USA. Další oblasti aplikace genetických markerů Metody identifikace transgenních rostlin A) Selekce na médiu s antibiotikem -kanamycin Gen NPT (neomycin phosphotransferase) B) Polymerázová řetězová reakce C) Southernova hybridizace Identifikace transgenních rostlin Arabidopsis thaliana Agrobacterium tumefaciens T-DNA Gen selekční NPT Gen signální GUS A) Postup Materiál: Kontrola Wassilevskaja transformované linie - RJG, ER4 1. Příprava selekčního média s antibiotikem a bez antibiotika (kanamycin) 2. Sterilizace semen, metodika 3. Výsev na misky 4. Vyhodnocení klíčních rostlin KanR, Kans 5. Vyhodnocení počtu inzertů KanR : Kans 6. Přesazení rostlin KanR, důkaz PCR Vyhodnocení počtu inzertů Rezistence ke kanamycinu je dominantní znak ■ 1 inzert 3 :1 KanR : Kans ■ 2 inzerty 15 :1 ■ 3 inzerty 63 :1 i. Jak se změní štěpné poměry, jestliže 2 a více inzertů ie ve vazbě? Určení počtu inzertů u testovaných inzerčních linií. Přesazení rostlin a identifikace inzertu PCR. B) Postup PCR pro NPT Polymerázová řetězová reakce Primery pro NPT 5' CCCGCTCAGAAGAAGAACTCGTCA 3' 5' TGGCTGCTATTGGGCGAAGTG 3' Program pro amplifíkaci genu NPT (94C 45s, 60C 45s, 72C 60s) 35x Složení reakční směsi dH20 5,6 ul dNTP 0,25 200 uM 5x PCR pufr 2,0 Primer-1 0,5 Primer-2 0,5 Go Taq-polymeráza 0,15 0,75 U Rostlinná DNA 1,0 10,0