Netradiční metody ve šlechtění rostlin Explantátové kultury DNA markery Genetické modifikace Genomické přístupy Explantátové kultury (in vitro) Velké populace buněk 105 - 106/ml Kultivace za kontrolovaných podmínek Regenerace rostlin cestou somatické embryogeneze Šlechtitelské biotechnologie - aplikace Přehled aplikací Meristémové kultury Embryokultury Somatická hybridizace = fúze protoplastů rody Solanum, Brassica a Cucumis PřF Univerzity Palackého v Olomouci, VÚ bramborářský v Havlíčkově Brodě, ÚEB AV ČR v Olomouci, Jihočeská univerzita Indukce haploidie ÚEB AV ČR, VÚRV Praha-Ruzyně, UPOL Mutageneze in vitro selekce, izolace mutantních linií Somaklonální variabilita DNA markery Rezistentní šlechtění markery kosegregující se znakem odolnosti Pšenice geny rezistence ke rzi, lokusy Lr9, Lr24 a Lr35 Ječmen – gen waxy, charakter endospermu – gen pro β-amylázu – gen pro α-amylázu gen pro odolnost k viru BYDV Pracoviště: VÚRV Praha-Ruzyně, Zemědělský VÚ Kroměříž Brambor – geny rezistence k háďátku bramborovému a plísni bramborové (Phytophthora infestans), lokusy H1, R1 Pracoviště: VÚ bramborářský Havlíčkův Brod, AF ČZU Meruňka – mapování a identifikace AFLP markeru vázaného s genem pro odolnost k viru šarky švestky Pracoviště: VÚRV Praha-Ruzyně ve spolupráci s pracovištěm v USA. GMO zdroje BIOTRIN nezisková organizace ČR http://www.biotrin.cz/ EU http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu Genetické modifikace Typy transgenů již využívaných nebo využitelných ve šlechtění rostlin Rezistence k herbicidům Rezistence k virům Rezistence k hmyzím škůdcům Rezistence k bakteriálním a houbovým chorobám Změny ve složení zásobních látek rostlin Plody s prodlouženým dozráváním Pylová sterilita Modifikace barvy květu u okrasných druhů Odolnost vůči abiotickým stresovým faktorům Tvorba protilátek a rostlinných vakcín Produkce biodegradovatelných polyesterů Produkce farmakologicky využitelných vzácných proteinů transgenními rostlinami Transgenní rostliny pro fytoremediaci  Altered lignin production  Anti-allergy  Antibiotic resistance  Black Spot Bruise Tolerance  Coleopteran insect resistance  Delayed fruit softening  Delayed ripening/senescence  Drought stress tolerance  Enhanced Photosynthesis/Yield  Fertility restoration  Glufosinate herbicide tolerance  Glyphosate herbicide tolerance  Isoxaflutole herbicide tolerance  Lepidopteran insect resistance  Male sterility  Mannose metabolism  Mesotrione Herbicide Tolerance  Modified alpha amylase  Modified amino acid  Modified flower color  Modified oil/fatty acid  Modified starch/carbohydrate  Multiple insect resistance  Nicotine reduction  Non-Browning Phenotype  Nopaline synthesis  Oxynil herbicide tolerance  Phytase production  Reduced Acrylamide Potential  Sulfonylurea herbicide tolerance  Viral disease resistance  Visual marker Přehled znaků podle Joint Research Centre Přehled GM plodin https://isaaa.org/gmapprovaldatabase/cropslist/def ault.asp  Alfalfa (Medicago sativa)  Apple (Malus x Domestica)  Argentine Canola (Brassica napus)  Bean (Phaseolus vulgaris)  Carnation (Dianthus caryophyllus)  Chicory (Cichorium intybus)  Cotton (Gossypium hirsutum L.)  Creeping Bentgrass (Agrostis stolonifera)  Eggplant (Solanum melongena)  Flax (Linum usitatissumum L.)  Maize (Zea mays L.)  Melon (Cucumis melo)  Papaya (Carica papaya)  Petunia (Petunia hybrida)  Plum (Prunus domestica)  Polish canola (Brassica rapa)  Poplar (Populus sp.)  Potato (Solanum tuberosum L.)  Rice (Oryza sativa L.)  Rose (Rosa hybrida)  Soybean (Glycine max L.)  Squash (Cucurbita pepo)  Sugar Beet (Beta vulgaris)  Sugarcane (Saccharum sp)  Sweet pepper (Capsicum annuum)  Tobacco (Nicotiana tabacum L.)  Tomato (Lycopersicon esculentum)  Wheat (Triticum aestivum) Největší světové firmy – GM plodiny Monsanto Syngenta Pioneer High-Bred Agro BASF DuPont Evropská komise - Registr povolených GM plodin, potravin a krmiv http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm Genetické modifikace plodin - EU Experimentální pěstování v EU http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/gmp_browse.aspx ČR 2015 Univerzita Palackého Cytokininy - jsou zapojeny 1) do kontroly růstu a vývoje rostlin (kontrola buněčného dělení, růst nadzemních částí i kořenů, klíčení semen) 2) do reakcí na stresové podmínky (sucho, změna okolní teploty, zvýšená slanost půdy) GM ječmen s geny CKX1, 2 z A. thaliana produkce cytokinin dehydrogenázy – enzym schopný odbourávat cytokininy Kódující sekvence + kořenově spec. promotor z rýže nebo beta glukuronidázy (pEXP:CKX1, pEXP:CKX2, bGLU:CKX1, CKX1:RNAi) Enzym se tvoří v kořenech, inhibice obsahu cytokininu a zvětšení kořenového systému, transgenní rostliny s mnohem hustšími a rozvinutějšími kořeny, lepší regenerace po působení stresu suchem Další cíl: tkáňově specifická exprese proteinů, produkce konkrétní látky v konkrétním rostlinném pletivu. Např. antimikrobiální peptidy - slouží jako obrana proti bakteriím – produkované pouze v zrnech ječmene 2014 PřF KU kukuřice NK603 odolnost k herbicidu glyfosátu, ke škůdcům Kódující sekvence CS4-cp4 epsps, protein CP4 EPSPS protein T5-nos 3' transcript termination sequence of the nopaline synthase (nos) coding sequence from Agrobacterium tumefaciens which terminates transcription and directs polyadenylation P-e35S Promoter and leader for the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S RNA containing the duplicated enhancer region I-Hsp70 Intron from the maize heat-shock protein 70 gene TS-CTP2 DNA sequence coding for the N-teminal chloroplast transit peptide CS-cp4 epsps l214p DNA sequence coding for the CP4 EPSPS L214P protein 2011 UPOL Ječmen phyA Gene, fungal 3-phytase z Aspergillus niger Phytase unit phyA Gene, fungal 3-phytase from Aspergillus niger α-amylase promoter, promoter region from Hordeum vulgare cv. Himalaya synthase gene Selection unit bar gene, phosphinothricin acetyltransferase coding region from Streptomyces hygroscopicus, herbicide resistance ubi promoter, promoter region from Zea mays polyubiquitin gene Reporter unit luc gene, reporter gene from the (Photinus pyralis) for detecting gene expression ubi promoter, promoter region from Zea mays polyubiquitin gene 2010 výzkumná stanice Nechanice Cukrová řepa, odolnost ke glyfosátu 2010 Agritec Hrách Six types of modified peas a) for resistance to fungal pathogenes or insect pests mediated by the insertion of a modified gene for serine protease inhibitor (gmSPI-2) fused to uidA (GUS) reporter gene, gen bar b) for resistance to fungal pathogenes or insect pests mediated by the insertion of a fused gmSPI-2 gene for serine protease inhibitor s GFP reporter gene, bar gene c) showing enhanced accumulation of seed proteins due to the insertion of plant Dof gene, nptII gene, d) with earlier development of seed embryo caused by the insertion of plant L1L gene, with a selectable nptII marker gene, e) for resistance to Pea Enation Mosaic Virus (PEMV) mediated by the insertion of a sequence coding for viral coat protein f) for resistance to Pea Seed-borne Mosaic Virus (PSbMV) mediated by the insertion of a sequence coding for viral coat protein Genetické modifikace autorizované v jednotlivých letech - EU Souhlasné stanovisko s genetickými modifikacemi v zemích EU Kukuřice Brambory Řepka olejná - obnova fertility Řepka olejná - fytáza Gene Introduced Gene Source Product Function nptII * Escherichia coli Tn5 transposon neomycin phosphotransferase II enzyme allows transformed plants to metabolize neomycin and kanamycin antibiotics during selection phyA Aspergillus niger var. van Tieghem 3-phytase enzyme increases the breakdown of plant phytates which bind phosphorus and makes the latter available to monogastric animals Vojtěška – snížený obsah ligninu Gene Introduced Gene Source Product Function ccomt (inverted repeat) Medicago sativa (alfalfa) dsRNA that suppresses endogenous S-adenosyl-Lmethionine: trans-caffeoyl CoA 3-Omethyltransferase (CCOMT gene) RNA transcript levels via the RNA interference (RNAi) pathway reduces content of guaiacyl (G) lignin nptII * Escherichia coli Tn5 transposon neomycin phosphotransferase II enzyme allows transformed plants to metabolize neomycin and kanamycin antibiotics during selection Jabloň – méně PPO, proti hnědnutí Gene Introduced Gene Source Product Function PGAS PPO suppression gene Malus domestica double stranded RNA (dsRNA) double stranded RNA (dsRNA)from the suppression transcript is processed into small interfering RNAs (siRNAs) that direct the cleavage of the target mRNA through sequence complementarity and suppresses PPO resulting in apples with a non-browning phenotype. nptII * Escherichia coli Tn5 transposon neomycin phosphotransferase II enzyme allows transformed plants to metabolize neomycin and kanamycin antibiotics during selection Evropská unie – komerční využití  Kukuřice MON810 odolnost k hmyzímu škůdci zavíječi kukuřičnému  Brambory Amflora, změna obsahu škrobu zpracovatelský průmysl, 2012 firma BASF pěstování v EU ukončila  Cukrová řepa tolerantní k herbicidu a s odolností k patogenu rhizománii, 2010 pokusy zastaveny ČR  Výzkumné projekty: slivoně, len, hrách, tabák  Uzavřené nakládání i polní pokusy  Pracoviště: Biologické centrum AV České Budějovice VÚRV Ruzyně, Praha ÚEB Praha Palackého univerzita Olomouc Využití Produkty ve fázi klinických testů Produkt Rostlina Lidský somatotropin léčba trpasličího vzrůstu u dětí tabák Turnerova syndromu Albumin lidského séra Náhrada krve při traumatických stavech tabák Dow AgroSciences Lidský interferon α 2b Funkce jako léčivo při virových infekcích, leukemii i proti nádorům okřehek Biolex Therapeutics Inc Pankreatická lipáza cystická fibróza doplněk stravy kukuřice Meristem Therapeutics Protilátka proti zubnímu kazu Planet Biotechnology Inc. tabák (CaroXTM) schváleno pro EU, ještě není na trhu Vakcína psích parvovirů Large Scale Biology Corp. tabák Komerční produkty na trhu Produkt Rostlina Avidin Prodigene kukuřice β-glukuronidáza Prodigene kukuřice Trypsin Prodigene kukuřice Lidský laktoferin Meristem Therapeutics kukuřice, rýže Lidský lysozym Ventria Bioscience rýže Lipáza Meristem Therapeutics kukuřice α-amyláza Syngenta kukuřice, tabák Nové trendy Transgenoze vs. cisgenoze Introdukce genů z příbuzných druhů, které jsou s recipientním druhem křižitelné brambor Solanum tuberosum Solanum bulbocastaneum donor rezistence k patogenu Phytophthora infestans brambor – méně toxického akrylamidu Komercializace USA, firma Simplot jabloň – odolnost ke strupovitosti ječmen – vyšší aktivita fytázy Transgen – intragen – cisgen Transgene A transgene is a (synthetic) gene with some or all regulatory sequences and coding sequences from donors other than crossable plants, including microorganisms and animals. These genes belong to a new gene pool for plant breeding Intragene An intragene is a gene comprising of natural functional elements, such as coding part, promoter and terminator originating from different genes from the crop plant itself or from crossable species. All natural gene elements belong to the traditional breeders‟ gene pool Cisgene A cisgene is an existing natural gene from the crop plant itself or from crossable species. It contains its native promoter and terminator. The gene belongs to the traditional breeders‟ gene pool and is the already existing result of natural evolution. Metody využívající cílené nukleázy Tvorba inzerčních míst pro transgeny v definovaných místech rostlinného genomu Zinkové prsty ZFN-3 (Zinc Finger Nuclease-3 technique) = SDN-3 (site-directed nuclease 3) ZFN-3 cílené začlenění transgenů (inzercí) homologní rekombinací Nukleáza - 2řetězcový zlom Genová kazeta několik kbp Vnesení transgenu, cisgenu Využití proteinů ZF vyskytujících se u eukaryot. Fúze domén s 3-6 ZF repeticemi, každá rozpozná 3bp. Specificky navrženo pro cílové místo 9-18 nt. ZFN-1 náhodné mutace, jednonukleotidové záměny, In/Del v důsledku nehomologní reparace ZFN-2 cílené bodové mutace v důsledku homologní rekombinace Cílené nukleázy a reparace Site-directed nuclease (SDN) DSB double-strand breaks NHEJ non-homologous end joining HR homologous recombination Ku heterodimer homologie Techniky SDN-3 se z hlediska rizik vložených genů neliší od běžně používaných technik genetické modifikace. Hlavní rozdíl mezi SDN-3 a transgenozí je, že DNA je vkládána na předem určenou oblast genomu, tudíž techniky SDN-3 jsou schopné minimalizovat nebezpečí spojené s narušením genů a/nebo regulačních sekvencí v genomu příjemce. Techniky SDN-3 mohou způsobit nezáměrné změny v genomu přijímající rostliny, těchto změn bude méně než při použití mutageneze v konvenčním šlechtění. Taleny Výrazné omezení nežádoucích efektů: specifičtější cílení endonukleázy FokI (z Flavobacterium okeanokoites) na konkrétní místo genomu (fúze specifických domén), i když při neznalosti sekvence celého genomu nelze ani při této technice vyloučit změny v sekvenci mimo zvolenou zásahovou oblast. TAL - transcription activator-like effector technika využívající transkripční faktory produkované patogenem Xanthomonas. Jsou injikované do rostl. buněk sekrečním systémem typu III bakterií, transport do jádra. Cílené na specifické elementy promotorů (pár reziduí, pozice 12 a 13), aktivace exprese rostl. genů. funguje na principu SDN-3 Meganukleázy Cíl: vypracování technik tak, aby ve výsledku byla v genomu jen donorová DNA v cíleném místě. Rozpoznávací místo 14 – 40 bp I-SceI kvasinky I-CreI Chlamydomonas reinhardtii Introdukce do genomu elektroporace protoplastů biolostické metody A. tumefaciens při kokultivaci v suspenzní kultuře, s protoplasty i listové disky Výsledky kukuřice – snížení obsahu kyseliny fytové vyšší aktivitou fytázy Komercializace kukuřice, odolnost k herbicidu (Dow AgroSciences, 2013) Nové trendy - přehled  Cisgeneze a intrageneze  Zinc Finger Nuclease Technology (ZFN) (ZFN-1, ZFN-2, ZFN-3 )  Oligonucleotide-directed mutagenesis (ODM)  Grafting - roubování  Agro-infiltrace  RNA-dependentní metylace DNA prostřednictvím RNAi/siRNA  Reverzní šlechtění  Syntetická biologie/genomika Oligonucleotide-directed mutagenesis (ODM) Do definovaného místa v genomu je začleněna specifická bodová mutace prostřednictvím syntetizovaného oligonukleotidu (DNA, RNA), který je homologní s cílovým genem. Délka oliga 20 – 100 bp Introdukce do buněk, oligo hybridizuje s cílovým místem, přirozené reparační mechanizmy Otestováno: tolerance k herbicidům, není potřeba bakteriální transgen pro necitlivost k herbicidu Tabák, rýže, kukuřice Roubování Na GM podnož je naroubován non-GM roub – žádné transgenní elementy nejsou v listech a plodech. Studium mobility transgenů mezi podnoží a roubem. Jabloň – menší růst, kvalita plodů neovlivněna. Transgen ani mRNA nebyly detekovány v roubu Rajče, ořešák – gen pro siRNA, rezistence k infekci Agrobacterium U ořešáku siRNA detekovány v jádrech plodů Komercializace ořešák, vinná réva Agroinfiltrace T-DNA A. tumefaciens je vnesena do rostliny bez začlenění do genomu, nedědí se. Dochází však k efektivní expresi transgenů. Přechodná exprese genů plazmidu. Metoda floral dip Využívá se jako diagnostický nástroj. Transientní expresí genů jsou testovány imunitní reakce, neznámé funkce genů pod řízením silných promotorů. Nicotiana benthamiana – studium exprese proteinu VP2 infekční nefrózy drůbeže (Infectious Bursal Disease Virus, IBDV). Protein VP2 pro využití jako vakcína produkovaná rostlinami, navodí imunitu kuřat vůči viru. Rychlý test funkčnosti vakcíny u brambor. RNA-dependentní metylace DNA prostřednictvím RNAi/siRNA Začlenění DNA fragmentu - homologie s oblastí promotoru Expresí vzniká dsRNA - štěpení na malé RNA sRNA metylace promotoru, což má za následek transkripční umlčení genu. Výsledek Kukuřice – umlčení genu pro fertilitu prostřednictvím metylace promotoru, sterilní rostliny Reverzní šlechtění pomocí dihaploidů Tvorba homozygotních rodičovských rostlin parental z vybraných heterozygotů prostřednictvím suprese meiotické rekombinace pomocí RNA interference Geny dmc1, spo11 Publikováno A. thaliana