BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie DIFERENCIACE BUNĚK RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU EVROPSKÁ UNIE MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, I MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkuroncwchopnwt investice do rozvoje vzdělávání Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Program přednášky • diferenciační potenciál buněk • diferenciační dráhy • růstové faktory • indukovaná diferenciace BiS 120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. Vývoj mnohobuněčného organismu • identický genom ve všech buňkách • kontrola na úrovni genové exprese 1. buněčná proliferace 2. diferenciace buněk 3. buněčné interakce 4. pohyb buněk 5. buněčná smrt Lidský organismus: 1 zygota -> 1013 buněk (250 různých typů) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. m DIFERENCIAČNÍ POTENCIÁL BUNĚK BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. "^Ina^ Časná embryogenéze u savců: • zygota • morula (8, resp. 16 buněk = blastomery) • blastocysta (~ 64 buněk) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 -01 / 30.3. Blastocysta: • trofoektoderm -> extraembryonální tkáně (placenta) • inner cell mass (ICM) -> embryo Gastrulace -> 3 zárodečné listy: • ektoderm (neurální a epidermální buňky) • mesoderm (svalová a pojivová tkáň) • endoderm (epitel vnitřních orgánů) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. "^Ina^ m Ektoderm • CNS • sítnice a čočky • lebeční a senzorická ganglia a nervy • pigmentové buňky • pojivová tkáň hlavy • epidermis • vlasy, ochlupení • prsní žlázy BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. Mesoderm • lebka a kostra • svalová tkáň (lebka i kosterní svalstvo) • dermis • pojivová tkáň • urogenitální systém • střevní svalovina • srdce • krevní a lymfatické buňky • slezina Endoderm • žaludek • tračník • játra • slinivka • močový měchýř • epiteliální výstelka průdušnice, plic, hltanu, štítné žlázy, střev BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 -01 / 30.3. Skeletal Musel* Celt Tubule Red Bkxx) Smooth Cel of CeH Muscle the KKJney _(m Gut) Lung Cel Thyrod Pancreat* (Alveolar Ceil Cei Cel) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. Totipotence • nelimitovaný diferenciační potenciál • schopnost tvořit embryonální i extraembryonální tkáně • časná stádia rýhování zygoty (1-4 dny) Pluripotence • schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů • buňky ICM (embryonální kmenové buňky, 5-14dní) Multipotence • schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně • např. hematopoetické kmenové buňky, neuronální kmenové buňky... BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. Fertilized egg Embryonic stem cell Hematopoietic stem cell totipotents buňka (zygota, blastomery) pluripotentní buňky (embryonální kmenové) multipotentní buňky (hematopetické kmenové) progenitorové buňky terminálne diferencované buňky BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. > y. jmi STEM CELL (e.g., hematopoietic stem cell) PROGENITOR CELL (e.g., myeloid progenitor cell) STEM CELL SPECIALIZED CELL (e.g.. neuron) SPECIALIZED CELL (e.g., neutrophil) SPECIALIZED CELL (e.g.. red blood cell) Rozdíl v diferenciačním potenciálu kmenových a progenitorových buněk mm Eukaryontní buňka: • 5000 různých bílkovin (109 -1010 molekul) • každý buněčný typ vytváří asi 100 specifických proteinů • housekeeping genes: exprimovány konstitutivně na relativně nízké úrovni ve všech buňkách organismu • housekeeping proteins: esenciální metabolické enzymy, buněčné komponenty • exprese různých genů závisí na typu buňky, fázi buněčného cyklu atd. BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. (Ml Příčiny diferenciace: • postupné změny v aktivitě genů (programovány v genomu) • odpověď na molekulární signály vysílané ostatními buňkami • odpověď na fyzikální kontakt s ostatními buňkami BiS 120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. Signály regulující diferenciaci > Solubilní regulátory • Hormony (glukagon, hydrokortison, tyroxin,...) • Růstové faktory (TGF-transformující růstový faktor, FGF-fibroblastový růstový faktor, interleukiny,...) • Vitaminy (D, A ...) • lonty (Ca2+,...) > Fyzické kontakty mezi buňkami (gap junctions) > Kontakt buněk s mezibuněčnou matrix (kolagen, laminin,...) > Polarita a tvar buněk > Fyzikální parametry prostředí (teplota, parciální tlak 02,...) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. m Molekulární mechanismy diferenciace • nejdůležitějším místem regulace je iniciace transkripce • vazba regulačních proteinů na specifické sekvence DNA (regulační oblasti) • relativně malý počet strukturních motivů Molekulární mechanismy diferenciace • 2 základní mechanismy účinku regulačních proteinů: a) ovlivnění vazby RNA polymerázy a transkripčních faktorů na promotor b) lokální modifikace struktury chromatinu v oblasti promotoru • kombinace regulačních proteinů • u člověka asi 3000 TFs (predikovaných) • ±5 TFs působí společně a reguluje transkripci jednoho genu • jeden TF reguluje více genů (pozitivně i negativně) • tkáňová specifita BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. Zachování exprese genů po rozdělení buňky Protein product of gene A enters nucleus and binds control region for gene A in a positive feedback loop. Protein A also represses gene B and activates gene C • p>o m c ° I) Transcription of gene)!, repression of gene B and activation of gene C Following cell division none of the genes are active Protein A enters the nucleus and the original pattern of gene activity is established \ • • • • • / BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 -01 / 30.3. Pancreas cell Glycolysis enzyme gene Crystallin gene Insulin gene Hemoglobin gene Active gene Eye lens cell (in embryo) Nerve cell i i Inactive gene DIFERENCIAČNÍ DRÁHY BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. Diferenciace buňky směřovány do určitého vývojového směru (linie) - tento stav nelze měnit (například buňky erytroidní linie „nepřeskočí" do linie myeloidní) Dediferenciace ztráta diferencovaného fenotypu • je obvyklá in vitro (adaptace na kultivační podmínky) • in vivo u nižších živočichů (regenerace obojživelníků) • experimentálně - příprava iPS cells Transdiferenciace schopnost určitých buněk určité tkáně (včetně SCs nebo progenitorů) diferencovat do buněk typických pro jiné orgány nebo tkáně (např. hematopoetické) vvers,>, _imj BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. ^T%^ Epigenetic landscape: H.C. Waddington (1957) Epigenetic landscape: T. Graf & T. Enver (2009) - role transkripcnich faktoru Indukovaná transdiferenciace Fibroblasts MyoD Muscle cells Monocytic Fibroblasts A B cells precursors B cells Exocrine cells / © €> (/i jmi ty S/J HMMflOpMMK Si cm MÉM Potentto* Progenitor Common Common MyotoM * Lymphoid Mtookoryocytt \^^/ T-orib BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. > y. S/J Megakaryocyte Thrombocytes Multipotential hematopoietic stem cell (Hemocytoblast) 1 IL-1 IL-3 IL-6 GM-CSF SCF Common lymphoid progenitor Common myeloid progenitor _J_ FLT-3 Ugand TNF-a TGF-01 IL-2 IL-7 IL-12 SDF-1 SCF Epo IL-3 GM-CSF GM-CSF •o Erythrocyte Small lymphocyte SCF G-CSF GM-CSF IL-3 IL-6 SCF G-CSF GM-CSF IL-3 IL-6 Myeloblast B lymphocyte SCF M-CSF GM-CSF IL-3 IL-6 IL-3 IL-5 GM-CSF IL-1 IL-2 IL-4 IL-6 IL-7 T lymphocyte Basophil Neutrophil Eosinophil Monocyte Diferenciace krevních buněk - vliv růstových faktorů a jiných cytokinů BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. > (/i jmi S/J Some hematopoietic growth factors and their target cells Type of growth factor Responding hematopoietic cells Erythropoietin (EPO) Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) lnterleukin-3 Stem cell factor (SCF) Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) Erythroid progenitors Granulocytes, neutrophils Granulocytes, macrophages Multipotent precursor cells Stem cells Macrophages, granulocytes C-JUN erythrocyte macrophage eosinophil basophil monocyte neutrophil CEBP8 Li o CEBPE O O J CUTL1 Vliv TFs na diferenciaci krevních buněk BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. > -■o Z- ft i Porucha diferenciace krevních buněk hematopoetická kmenová b. HSC LSC Normal growth and differentiation Mutation (s) leukemická kmenová b. Normal blood cells i Developmental arrest Leukemia blast cells Current Opinion in Cell Biology BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 -01 / 30.3. Průběh neuronální diferenciace lineage restrtdod progenitor celis Ql^ ®> Neuronal stem ceils stem cell* Regulace neuronální diferenciace TGF-B superfamily • TGF- P (1-3) (transforming/tumor growth factor) • BMPs š^idM (bone morphogenetic proteins) 0MP3-4 BMP 2.4 Uf. CNS Neuron proMer Jtion stat,/i \\ [ o-jtA • nodal • activin Astrocytes Ooodertdrocytes Proliferation Růstové faktory • FGF • LIF BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. m Neuronální diferenciace Kmenová buňka: • nestiň • GFAP • DNA BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. "^Ina^ Neuronální diferenciace M i Progenitorová buňka: • p-tubulin III • GFAP • DNA Neuronální diferenciace Neurony: • p-tubulin III • DNA Gliové buňky: • GFAP • DNA (Ml BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. "^W^ > y. Diferenciace příčně pruhované svaloviny diferenciaci doprovází • zástava buněčného cyklu • změna morfologie • fůze v syncytia Dividing myoblasts Cell alignment Cell fusion Muscle fiber growth factors . * . . ':V:^;;: • • • • • # * . • . • . * * . í '' *' ; Cell multiplication Cell multiplication ceases Appearance of muscle-specific proteins Spontaneous contractions begin > BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. \ Diferenciace příčně pruhované svaloviny • svalové prekurzory exprimujíTF: mrf4, myf5 a myoD • in vitro: po odstanění růstových faktorů se spustí diferenciace • exprese svalově specifických proteinů: myogenin, svalový aktin, myosin II, tropomyosin ... Determination Differentiation Maturation external signals > T £> myogenin muscle-specific genes [] inhibition activation growth factors i/i BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. i RŮSTOVÉ FAKTORY BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. "^Ina^ Růstové faktory (Growth Factors) • vazba na příslušný membránový receptor • aktivace specifické intracelulární signální dráhy • stimulace prežívania růstu buněk (metabolismus, zvyšování objemu, antiapoptotické) • některé fungují i jako mitogeny (např. PDGF), resp. induktory diferenciace • např. cytokiny, hormony (insulin),... růstové faktory Cytokiny • signální proteiny ovlivňující buněčnou proliferaci, diferenciaci a imunitní odpověď (interleukiny, INFs, G-CSF, GM-CSF, chemokiny...) ___#_j^j^ IUI | BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. ^vjjff^" Příklady růstových faktorů EGF (Epidermal Growth Factor) • specifická vazba na EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) -> aktivace RTK kaskády FGF Family (Fibroblast Growth Factor) • 22 molekul • FGF2 = bFGF (basic fibroblast growth factor) • receptory FGFR1-4 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) • stimulace vaskulárních endotelií -> angiogeneze • v případě hypoxie - exprese HIF -> VEGF > BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. \ VECF Production Blood Vessel Grow th TGF (Transforming/Tumor Growth Factor) • up-regulace u některých typů nádorů • schopnost indukovat nádorovou transformaci v podmínkách in vitro (krysí fibroblasty ledvin) • TGF-a (makrofágy, mozkové buňky, keratinocyty): vývoj epitelu - příbuznost s EGF, vazba na EGFR • TGF-p - isoformy p 1, p 2, p 3: diferenciace buněk, vývoj embrya, regulace imunitního systému, apoptóza BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. ^4n^ Trk C (NT-3) Trk B (NT-4/6 BDNF) Trk A (NGF) Neurotrofiny (Neurotrophics) produkovány cílovou tkání -> přežívání neuronů, neuronální diferenciace receptory: p75, Trk receptory (A,B,C) NGF (nerve growth factor) BDNF (brain-derived neurotrophic factor) NT-3 (neutrophin-3) NT-4 (neutrophin-4) Neunte elongation and cell survival Differentiation BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. Pleiotropní efekt BDNF -BDNF Neuron^^ j> BDNF Endothelial cell Differentiation, survival, and function Ang agenesis Hematopoetic Precursor Cell HPC Hematopoiesis BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. BDNF-indukovaná neovaskularizace HPCs Bone marrow VEGF BDNF MCs vessel HPCs- hematopoietic precursor cells, MCs - mural cell, ECs endothelial cells BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. > 5/1 y. < Příklady cytokinů EPO (Erythropoietin) • produkce v ledvinách • stimulace tvorby erytrocytu • rekombinantní EPO TPO (Thrombopoietin) • produkce ve slezine a v ledvinách • stimulace tvorby megakaryocyte krevních destiček G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) • stimulace tvorby granulocytů/neutrofilů GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating factor) JMI BÍ8120 Aplikovaná bunečná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. ^4^^ RECEPTOROVE TYROZIN-KINAZY funkce: regulace proliferace, diferenciace, metabolismu, aj. lidský genom : 59 genů (+alternativní sestřih) -> 20 receptorových rodin Receptor Tyrosine Kinases BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. > DOMÉNY : • extracelulární (receptorová) • transmembránová • cytoplasmatická (tyrozin kinázová) EGFR PDGFR InsulinR VEGFR IciD FGFR NGFR EPHR TIE DDR KLG/CCK HGFR AXL RYK ROS ROR LMR RET LTK MUSK ? LRD FNIII ICadhO DiscD KnnO EGFR INSR PDGFR-a VEGFR 1 FGFR-1 CCK4* TRKA MET EPHA1 axl TIE RYK* DDR1 ERBB2 IGF-1R PDGFR-0 VEGFR2 FGFR-2 TRKB RON EPHA2 MER TEK DDR2 ERBB3* IRR CSF-1R VEGFR3 FGFR-3 TRKC EPHA3 TYR03 ERBB4 KIT/SCFR FGFR-4 EPHA4 FLK2/FLT3 EPHA5 EPHA6 EPHA7 EPHA8 EPHB1 RET ROS LTK ROR1 MUSK ALK ROR2 RTK106 EPHB3 EPHB4 EPHB5 EPHB6 AATYK AATYK2 AATYK3 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. AKTIVACE: dimerizace vlivem růstových faktorů -> cross-fosforylace a) -> konformační změna - stimulace katalytické aktivity b) -> tvorba vazebných míst pro domény adaptorových proteinů (Grb-2) ErbB/HER Signaling Network BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. INDUKOVANÁ DIFERENCIACE BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. "^Ina^ Indukovaná diferenciace • induktory diferenciace (růstové faktory, vitamíny, inhibitory kináz, změny v kultivaci, syntetické látky...) • indukce příslušné diferenciační dráhy • inhibice signálních drah pro „self-renewal" Příklady induktorů diferenciace in vitro: • kyselina a\\-trans retinová (ATRA) • la,25-dihydroxycholekalciferol (l,25(OH)2-D3) • phorbol myristylacetát (PMA) • trichostatin • dimethylsulfoxid (DMSO) • SU5402 (inhibitor FGFR1)... _m BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. "^Ina^ Kyselina a\\-trans retinová (ATRA) jako induktor diferenciace BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. ^vľľ^* ch) Kyselina retinová (RA) jako modelový induktor diferenciace (a morfogeneze) B Without RA With RA Histono o>ac«ty1ation and repression ol transcription ; es Histone acetytation and activation of transcription Typical chordate Hot gene cluster 1. vazba na jaderné receptory (RAR, RXR) 2. vazba komplexu na regulační oblast (RARE) 3. acetylace histonů —> aktivace transkripce BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. > (/i jmi • lidská myeloidní leukémie • spontánní diferenciace: asi 10 % buněk populace Linie HL-60: • induktory granulocytární diferenciace: kyselina all-trans retinová (ATRA) dimethylsulfoxid (DMSO) • induktory monocyto/makrofágové diferenciace: phorbolmyristyl acetát (PMA) 1,25-dihydroxyvitamin D3 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. Diferenciace linie HL-60 do stádia granulocyte Induktor: lmM kyselina all-trans retin o vá Marker: CD-66b (CD-67) Detekce: anti-CD66b, SwAM-FITC Granulocytární diferenciace HL-60: flow cytometrie / CD66b SS (2) vs FITC (3) SS (2) vs FITC (3) SS (2) vs FITC (3) FITC FITC FITC lmM ATRA lmM ATRA + 13mM CA lmM ATRA + 52mM CA Diferenciace linie HL-60 do stádia makrofágů: Induktor: 1,6 nM phorbolmyristyl acetát (PMA) Marker: CD-14 Detekce: anti-CD14, SwAM-FITC Linie P19: • myší embryonální karcinom • 7denní embryo do testes • „embryoid bodies" (EB) induktory mesodermální diferenciace: kyselina all-trans retinová (ATRA) dimethylsulfoxid (DMSO) induktor neuronální diferenciace: kyselina all-trans retinová (ATRA) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. Schéma diferenciace buněk P19 metoda kultivace na metoda „visících kapek" bakteriologických miskách (hanging drops) _ IKU BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. ^T%^ Mesodermální diferenciace buněk P19: Induktor: 0,8% DMSO Marker: myosin II Detekce: anti-skeletal myosin, SwAM-FITC Neuronální diferenciace buněk P19: Induktor: lmM kyselina all-trans retinová (ATRA) Marker: neurofilamin Detekce: anti-neurofilament 160, SwAM-FITC Praktické využití indukované diferenciace: • základní výzkum • diferenciační terapie v onkológii —> hematologické malignity (APL, AML) —> vybrané typy solidních nádorů (neuroblastom) • diferenciační terapie v dermatologii —>akné • příprava buněčných derivátů in vitro BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. Retinoidy jako induktory diferenciace v klinické praxi: Roaccutane Vesanoid (isotretinoin, 13-cis-RA) (tretinoin, all-trans-RA) • akné, neuroblastom • akutní leukemie COMBAT léčba solidních nádorů (meduloblastom, neuroblastom, sarkomy...) celecoxib etoposid temozolomid kys. retinová inhibitor cyclooxygenázy inhibitor topomerázy II alkylační činidlo diferenciační činidlo antiangiogenní účinek zástava b. cyklu apoptóza diferenciace/apoptóza Celecoxib oral 200 mg/m 7d Days 1-78 Etoposide oral 25 mg/m 7d Days 1-21 Temozolomide oral 60 mg/m2/d Days 36-77 Isotretinoin oral 100 mg/mJ/d Days 1-14. 29-42. 57-70 Day -I-1-\- —I 8 1 5 22 29 36 43 50 57 64 71 78 Fig. 1. Combined or;il maintenance biodifferentiating and antiangioge-nic therapy (("()MBAT) - treatment plan. ONKOLOGIE Original Article ■ Originalarbeit Onkologie 200629:308-313 DPI 101158AT00093474 Combined Biodifferentiating and Antiangiogenic Oral Metronomic Therapy is Feasible and Effective in Relapsed Solid Tumors in Children: Single-Center Pilot Study Jaroslav Sterba3 Dalibor Valik" Peter Mudry" Tomas Kepak3 Zdenek Pavelka3 Viera Bajciova3 Karel Zitterbart3 Vera Kadlecova3 Pavel Mazánek3 'Department of Pediatric Oncology. University Hospital Brno. bDepartment of Laboratory Medicine. Masaryk Memorial Cancer Institute. Brno. Czech Republic Metronomic Chemotherapy with the COMBAT Regimen in Advanced Pediatric Malignancies: A Multicenter Experience D.Zapletalova" N.André^ LDeak* M.Kyra V. Bajciova" P.Mudry* LDubskafj R. Demlova'' Z. Pavelka" K. Zitterbart" J. Skotakova6 K. Husekc A. Martincekova" P.Mazánek" T.Kepak" M.Doubek** L.Kutnikova" D.Valik' J.Sterba"h BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. y. Vi -ay/ Teoretické modely diferenciční terapie přímá diferenciace nádorové buňky oprava onkogenního mechanismu vede k původní diferenciaci „přesměrování" na prekurzor —> jiná diferenciační dráha www.impiK t jourmtlv* om/oiK otrtrgct / Oncotarget, May, Vol.3, No 5 Solid Tumor Differentiation Therapy - Is It Possible? Filemon Dela Cruz' and Igor Matushansky BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2015 - 07 / 30.3. 1/1