REJSTŘÍK: - 0.1% gelatine, prasečí želatina (porcine skin gelatine) v destilované vodě, MQ kvality, autoklavováno (sterilita + rozpuštění želatiny) - EB, embryoidní tělíska (EB - embryoid bodies), plovoucí trojrozměrné sférické kolonie diferenciujících EC nebo ES buněk - EC buňky, pluripotentní embryonální nádorové (EC - embryonal carcinoma) buňky, kmenové buňky teratokarcinomu ES buňky, pluripotentní embryonální kmenové (ES - embryonic stem) buňky odvozené z vnitřní buněčné masy blastocysty - DMSO, dimethylsulfoxide, organické rozpouštědlo - ITS médium, serum-free medium, DMEM : F12 media (1 : 1) + ITS supplement (insulin, transferin, selen) ) + antibiotika (penicilin/streptomycin) - kompletní DMEM médium, DMEM + 10% séra (telecí fetální) + antibiotika (penicilin/streptomycin) + 0.05 mM b-merkaptoethanol - MTT (1-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan), MTT stock solution, 2.5 mg MTT na 1 ml PBS - MTT extrakční pufr, 10% Triton X-100 + 0.1 M HCl - PBS, fosfátový pufr pro tkáňové kultury, 8 g NaCl + 0.2 g KCl + 0.2 g KH[2]PO[4] + 2.16 g Na[2]HPO[4].7H[2]O, (2.88 g Na[2]HPO[4].12H[2]O) na 1L MQ vody, pH 7.4 - RA, kyselina retinová - all-trans retinoic acid, zásobní roztok 5-15 mM v EtOH, pracovní zásobní roztok 50-100 mM v PBS - SDS lyzační pufr, 1% SDS, 100mM Tris pH 6.8, 10% glycerol - TC plastik, plastik pro tkáňové kultury (TC – tissue culture) - Kit na stanoveni ATP a luciferázové aktivity - Vhodné plasmidy a PEI (transfekční roztok) Trypsinizace adherentních buněk = převod adherentních buněk do suspenze, PASÁŽOVÁNÍ Většinu adherentních buněk lze převézt do suspenze tzv. trypsinizací. 1) odsaj růstové médium a opláchni buňky PBS (stačí stejný objem jako byl růstového média) 2) přidej pracovní roztok trypsin (0.25 %) / EDTA tak, aby udělal tenkou vrstvu na dně kultivační misky (pro misku o průměru 60 mm 350 – 500 ml, pro misku o průměru 100 mm 700 – 1000 ml). 3) můžeš dát tuto misku do termostatu a nebo při R.T. přímo pozorovat uvolňování buněk od podkladu. Buňky by měly v trypsinu být tak 3 – 5 minut. 4) k uvolněným buňkám přidej kompletní růstové médium obsahující sérum (absolutní objem séra tak 1 : 1 k objemu roztoku trypsin / EDTA) nebo inhibitor trypsinu. 5) pipetou buňky jemně rozsuspenduj na homogení populaci, spočítej je a použij do experimentu nebo pasážuj v požadovaném množství. Důkaz pleiotropního působení kyseliny retinové (RA) Model: Diferenciace EC buněk linie P19 do buněk primitivního entodermu a buněk neuroektodermu působením RA. Teorie: RA je silným indukrotem diferenciace buněk EC P19. V adherentní, jednovrstevné kultuře (monolayer) buněk P19, v závislosti na přítomnosti sérových faktorů/séra, RA (0.1-1 mM) indukuje vznik buněk primitivního entodermu a neuroektodermu. V přítomnosti séra vznikají buňky primitivního entodermu, za jeho nepřítomnosti buňky neurální. Postup: 1) připrav si dvě želatinou potažené petriho misky pro TC (průměr 60 mm, plocha 20 cm^2). 2) na jednu tuto TC misku vysej 5000 (PE) a na druhou (NE) 10 000 buněk P19 na cm^2 v kompletním DMEM médiu, finální objem 5 ml. 3) 2-3 hodiny po vyseti vyměň kompletní DMEM na misce „NE“ za ITS médium. 4) do obou misek přidej RA do finální koncentrace 0.2 mM. 5) po 2 dnech kultivace u obou misek vyměň médium za čerstvé. Miska „PE“ kompletní DMEM, miska „NE“ ITS, v obou případech již bez RA. 6) po dalších dvou či více dnech pozoruj morfologické změny případně aplikuj detekci nekterého ze specifických markerů pro daný buněčný typ. Závěr: Na misce „PE“ by měly vznikat buňky primitivního entodermu (ploché buňky pozitivní na cytokeratin Endo A) a na misce „NE“ buńky neurální (neurony + glie, charakteristická morfologie a experese specifických proteinů, N-cadherin, neuron specifický III b-tubulin, GAP-43, N-CAM, GFAP,...). Literatura: http://www.biomed.cas.cz/physiolres/pdf/2005/54_115.pdf Technika embryoidních tělísek - příprava kardiomyocytů Model: Diferenciace EC buněk linie P19 do kardiomyocitů technikou embryoidních tělísek v přítomnosti DMSO Teorie: Zabráníme-li EC (nebo ES) buňkám adherovat k podkladu, začnou vytvářet tzv. embryoidní tělíska, EB. Buňky obsažené v EB diferencují různými směry, prakticky do všech třech zárodečných listů. V hodnými doplňky růstového média lze tuto diferenciaci více specifikovat. EB v přítomnosti DMSO diferencují zejména směrem do buněk mezodermu a posléze kardiomyocytů. Postup: 1) připrav si suzpenzi buněk P19 o hustotě 3 – 5 buněk v jednom ml kompletního DMEM s 1 % DMSO 2) 10 ml této suspenze vysej na baktriologickou plastovou petriho misku (průměr 90-100 mm) 3) ze stejné suspenze jako v bodě „2“, nanes kapky o objemu 35 ml na vnitřní stranu víčka petriho misky pro TC (průměr 90-100 mm), víčko pak přiklop zpět na misku do které jsi dal/dala 10-15 ml PBS 4) po 4 dnech kultivace zkontroluj vytvořená EB, a přenes je na nové misky pro TC (potažené želatinou) do kompletního DMEM již bez DMSO. 5) po dalších 3-5 dnech, pozoruj objevení kardiomyocytů v podobě pravidelně tepajících koloniích na dně misky Závěr: Jak na bakteriologické misce, tak v kapkách by měly vzniknout EB. Po přenesení na TC misku s adhezivním povrchem, EB adherují na její dno a dávají vznik koloniím, které po 7 a více dnech celkové kultivace začínají pravidelně tepat v důsledku přítomnosti diferencovaných kardiomyocytů. Přítomnost kardiomyocytů lze dále potvrdi detekcí specifických proteinů (Sarkomerický alfa-aktin, Troponin I). Literatura: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20163207 Detekce proliferační aktivity adherentích buněk Model: Analýza růstu EC buněk linie P19 po působení RA (0.1 a 1 mM). Teorie: Stanovené růstové aktivity buněčné populace je možno provést nejen sledováním počtu živých buněk v takové populaci, ale také analýzou aktivity některé z jejich metabolických drah a nebo jako celkového množství proteinů, které tato populace obsahuje. Postup: 1) na 12 (1 jamka = 3.6 cm^2) a 96 (1 jamka = 0.4 cm^2) jamkovou destičku vysej buňky P19 v kompletním DMEM médiu o hustotě 5000 buněk na cm^2. Počítej stím, že na 12 jamkové destičce budou duplikáty a na 96 jamkové triplikáty. V případě 96 jamkové destičky také buňky nevysévej do okrajových jamek, ale do středních a ty okolo naplň PBS. Finání objem pro 12 jamkovou desku je 2 ml, a pro 96 jamkovou 200 ml média v jedné jamce. 2) ovlivnění buněk na 96 jamkové desce proveď tak, že buňky vysej v objemu 100 ml a poté se k nim přidej dalších 100 ml média s naředěnými drugs o dvojnásobné koncentraci než je požadovaná finálně, v jamce tak bude celkem 200 ml média o požadované koncentraci drugs. 3) k buňkám na 12 jamkové desce přidej požadovaná drugs o žádané koncentraci přímo ze zásobního roztoku, případně po jeho naředění, aby se přidávaný objem pohyboval v rozsahu 2 - 20 ml, kdy ho na 2 ml celkového objemu média v jamce můžema považovat za zanedbatelný*. 4) po 2 dnech kultivace 2x PBS opláchni buňky na 12 jamkové desce a zlyzuj je v SDS lyzačním pufru (150-300 ml, podle buněčné denzity u nejvíce rostoucí jamky). 5) pro optimální homogenizaci vzorku je tento lyzát vhodné sonikovat. 6) pomocí DC Protein Assay kitu fy Bio-Rad změř koncentraci proteinů v lyzátech. 7) u 96 jamkové destičky po 2 dnech kultivace k buňkám přidej do každé jamky 20 ml MTT roztoku a desku vrat zpět do termostatu (teď bez víčka!!!!, na sterilitě již nezáleží). 8) po 2 hodinách kultivace v termostatu, zkontroluj vznik barevného formazanu v buňkách, pokud se ti zdá málo, nech kultivovat ještě 1 hodinu. 9) odstraň médium z jamek 96 jamkové desky (nejlépe vyklepnutím do umyvadla a pak na filtrační papír) 10) poté se do každé jamky napipetuje 50 – 100 ml (v závislosti na množství vytvořeného formazanu) MTT extrakčního pufru a za mírného třepaní se barevný formazan nechá extrahovat. 11) po vyextrahování formazanu se jeho absorbance změří na ELISA readeru při vlnové délce 570 nm. * V případě že rozpouštedlo drugs je biologicky aktivní, je nezbytné i je samotné přidat do kontrolních jamek. Závěr: Populace pomaleji rostoucích buněk obsahuje méně proteinů (12 jamková deska) a pomaleji rostoucí buňky mají i menší metabolickou aktivitu a je jich samozřejmě také méně (96 jamková deska). Metabolická aktivita je zde měřena jako schopnost oxidačně-redukčních systémů buňky měnit rozpustnou a žlutou tetrazoliovou sůl (zde MTT) na nerozpustný a fialově zbarvený formazan, akumulovaný uvnitř buněk. Je dobré si uvědomit, že stanovení celkového proteinu jako růstového parametru není vhodné u buněk tvořících nadměrné množství extracelulární matrix, např. chondrocyty. MTT test zase není vhodný v případě, kdy testovaná drugs jsou sama o sobě silnými oxidačně-redukčními činidly. Literatura: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7868929 Reportérový test A) test účiniosti transfekce pomocí vektoru/plasmidu kodujícího konstitutivně exprimovaný zelený (GFP) případně červený (RFP) fluorescenční protein - ověření účinnosti transfekce - příslušné buňky vyset na poželatinovanou 6-wells plate, 3xE4 buněk na cm2 v 1,5 ml media - druhý den připravit transfekční směs = pro jednu jamku 3ug DNA(příslušný plasmid/vector) plus 200 uL serum/AB-free media s 6uL PEI (2x, pH 7.0), po 15-20 minutách nakapat na buňky v jamce - po cca 4h vyměnit buňkám médium za čerstvé - následující den pozorovat ve fluorescenčním mikroskopu poměr buněk pozitivních k GFP/RFP proti negativním. Lépe lzepoužít analýzu pomocí flow-cytometru (FACS) - samozřejmě dle potřeby je možné použít i kultivační plastik jiných rozměrů B) reportérový test na aktivitu transkripce citlivé na působení kyseliny retinové (RA) - analýza transkripční aktivity RA, transfekce buněk reportérem kódujícím gen pro luciferázu pod kontrolou promotoru citlivého k RA (RARE-luc; RARE-retinoic acid responsive element) - příslušné buňky vyset na poželatinovanou 12-wells plate, 3xE4 buněk na cm2 v 0,7 ml media - druhý den připravit transfekční směs = pro jednu jamku 0,7 ug DNA(příslušný plasmid/vector) plus 100 uL serum/AB-free media s 1,7 uL PEI (2x, pH 7.0), po 15-20 minutách inkubace pči R.T. nakapat na buňky v jamce. - Po cca 4h vyměnit médium za čerstvé a 8h po transfekci provést experimentální zásah (zde přídavek 0.1uM RA v kombinaci s N-acetyl cysteinem (NAC, 1, 3, 5mM) - Druhý den opláchnout buňky PBS a zlyzovat v příslušném pufru (1 : 1; lyzační pufr pro luciferázu a lyzační pufr pro stanovení ATP) - Změřit na luminometru luciferázovou aktivitu (vzorek + substrát – 50 + 50uL) a následně ATP (vzorek + substrát – 30 + 30 uL). Výsledná hodnota je poměr signálu luciferázy ku signálu ATP (RA aktivita na buňku) Literatura: Test - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20492758 RA - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22254103 Analýza proliferace stanovením ATP - celkové množství ATP velice přesně a citlivě vypovídá o kondici buněk a jejich počtu. - vysetí buněk na 12-, 24-, nebo 96 wells plate, počet buněk dle jejich schopnosti proliferovat a potřebné délky testu/kultivace - buňky s eovlivní příslušnou látkou (zde RA) a ve vybraném čase se opláchnou PBS a zlyzují pufrem pro stanovení ATP (viz. výše). Test klonogenicity (– mezní ředění) Schopnost klonogenicity (expanze buněčné populace z jediné) buňky je významná např. pro přípravu transgenních buněčných línií, přípravu monoklonálních protilátek, pro testování klonogenního potenciálu genů (např. při hledání a studiu onkogenů), pro testování schopnosti látek klonogenicitu u konkrétních buněk narušit nebo vyvolat (náš případ) atd. - buňky se vysévají v množství 1 buňka na 3 jamky 96-wells plate, čímž se zajistí vysoká pravděpodobnost, že skutečně bude v každé jamce jen jedna buňka. Alternativne lze buňky vyset do některého z polotekutých médií jako je agar nebo methylcelulósa. V závislosti na typu buněk je třeba často kultivovat i týden a déle. - Posuzuje se pak poměr očekávaného počtu kolonií proti skutečnému, případně v rámci experimentálních skupin - V našem případě jedna skupina ovlivněn 0.2uM RA - Pro snadnější vizualizaci vzniklých kolonií je vhodné buňky obarvit, buď barvivy/fluorochromy vázající mi se na např. proteiny nebo DNA, případě barevnými produkty enzymatických reakcí 9samozřejmě po přídavku vhodného substrátu (v našem případě využijeme MTT – viz. MTT test).