·         Roztoky a pufry

akrylamid + N, N´- methylenbisakrylamid

(30:0,822): 0,0822 g bis na 10 ml 30% akrylamidu. Přidat amberlit (vyváže kyselinu akrylovou).
Skladovat při 4°C.


1,5M Tris-Cl pH 8,8

18,171 g Tris

0,298 g EDTANa[2 ]. 2H[2]O,

přidat asi 80ml dH[2]O, upravit pH na 8,8 pomocí HCl, doplnit do 100 ml.


0,5M Tris-Cl pH 6,8

6,057 g Tris

0,298 g EDTANa[2 ]. 2H[2]O, přidat asi 60ml dH[2]O, upravit pH na 6,8 pomocí HCl, doplnit do 100
ml. Skladovat při 4°C.


5x koncentrovaný Running pufr

36 g glycin

7,5 g Tris

2,5 g SDS

doplní se na 500 ml dH[2]O, pH se upraví na 8,3. Uskladnit při 4°C, pokud nastane precipitace,
zahřát na 37°C, před použitím zředit 1:4.


vzorkový pufr (používá se redukující nebo neredukující)

neredukující: 4,8 ml dH[2]O

1,2 ml 0,5M Tris-HCl

1,0 ml glycerol

2,0 ml 10 % SDS

0,1% bromfenolová modř

skladujeme při R.T.

redukující:   25 μl 2-merkaptoethanol

475 μl neredukující vzorkový pufr

připravit těsně před použitím







·         Pufry 6,8 a 8,8 i SAMPLE mohou být stejné jako při „velké“ ELFO

SDS PAGE


Rozpis na 2 gely

                     4% (hřebínkový)

                                    10% (separační)

akryl+bis (30:0,822)

                     0,52

                                    3,244

0,5M Tris-Cl, pH 6,8

                     1


1,5M Tris-Cl, pH 8,8


                                    2,5

10% SDS

                     0,04

                                    0,1

H[2]O

                     2,416

                                    4,1

10% amonium persulfát

                     0,02

                                    0,05

TEMED

                     0,004

                                    0,005

celkem

                     4 ml

                                    10 ml


1.      Sestavíme nalévací stojánek. Jedno sklo je menší, druhé větší, pozor na jejich správnou
orientaci, při nalévání je menší směrem ven! Připravíme separační gel, amonium persulfát (vždy
čerstvý) a TEMED se přidá jako poslední. Nalejeme separační gel  zvolené koncentrace (asi 2 cm pod
horní okraj) a opatrně převrstvíme izobutanolem nasyceným vodou, nebo 1:3 pufrem 8,8. Necháme
tuhnout při laboratorní teplotě cca 45 min.

2.      Po dané době izobutanol odstraníme a povrch opláchneme dH[2]O. Přebytek tekutiny odstraníme
filtračním papírem.

3.      Nalejeme 4% hřebínkový gel (Tris pH 6,8) a zasuneme hřebínek. Tento gel tuhne pomalu,
použít gel podle návodu pro „velkou“ elfo… Pod jamkami by mělo být minimálně 0,5 cm hřebínkového
gelu. Dáváme pozor, aby nebyly na dně jamek bublinky. Necháme polymerizovat alespoň 3 hodiny v
uzavřeném sáčku. Gel je lépe nechat nejméně do druhého dne “vyzrát” (rozloží se amonium persulfát
použitý k indukci polymerizace). Možno skladovat déle jak týden v lednici.

4.      Příprava vzorků je stejná jako pro „velkou“ elfo, nanáší se 10 µl.

5.      Umístíme gely do elektroforetické vany a vzorky naneseme do jednotlivých jamek v
hřebínkovém gelu. Do spodního anodového prostoru nalejeme Running pufr (bude potřeba až 700 ml). Do
horního katodového prostoru je třeba použít vždy čerstvý running.

6.      Připojíme elektroforetickou vanu ke stejnosměrnému zdroji proudu. Na aparaturu (Bio-Rad)
přivedeme napětí 200 V asi po dobu jedné hodiny (nebo 130V asi dvě hodiny, program TV-H, nutné
nastavit čas, ale lze kdykoliv vypnou po vyjetí čela…, zdroj drží V, mA a W nenastavujeme), dokud
zóna bromfenolové modři nedoputuje ke spodnímu okraji gelu.

7.      Po sjetí rozmontujeme držáky gelu, spacery opatrně vytáhneme. Spacerem odřízneme hřebínkový
gel.

8.      Fixace a barvení stejné jako na „velké elfo“.