C4182 Biochemie II 04-Metody studia nukleových kyselin FRVŠ 1647/2012 2/21/2014 1 Petr Zbořil Obsah •Metody studia nukleových kyselin •Sekvenace •PCR 2/21/2014 Petr Zbořil 2 Určení sekvence DNA •Sekvence DNA, základní principy ochemická (selektivní štěpení – Maxam-Gilbert) obiochemická (syntéza, dideoxy metoda - Sanger) •Postupná sekvenace štěpů •Kombinace oligonukleotidů •Další zdokonalování metod, modifikace •Vícekanálová zařízení •Hybridizační sondy oFISH (fluorescence in situ hybridization) •DNA čipy • • 2/21/2014 Petr Zbořil 3 Určení primární struktury • •Chemická metoda Maxam-Gilbertova •Specifické (téměř) štěpení řetězce činidly •Pracná, málo efektivní, ale univerzální a nezávislá oModifikace bazí – DMS – puriny ohydrazinolýza pyrimidinů •Štěpení řetězce v místě této báze oG – DMS, piperidin oA+G – kys. mravenčí, piperidin oT+C – hydrazin, piperidin oT – hydrazin + NaCl, piperidin • • 2/21/2014 Footer Text 4 Destrukce bazí a štěpení řetězců • • 2/21/2014 Footer Text 5 Sekvenace DNA •Schema metody •Ilustrace postupu oOd známe sekvence ok výsledku • 2/21/2014 Footer Text 6 Sekvenace DNA •Schema metody •Ilustrace postupu oOd výsledku k sekvenci • 2/21/2014 Footer Text 7 Syntéza oligonukleotidů •Syntéza na pevné fázi oMonomery s aktivovanými a ochráněnými skupinami oPrvní zakotven na nosiči oDeblokace reagujících skupin oVazba oPromývání oCyklický proces - automatizace •Příprava primerů oKomerční záležitost •Umělé geny • 2/21/2014 Footer Text 8 Syntéza oligonukleotidů •Fosforamiditinová metoda •Komerčně dostupné •oligonukleotidy – primery •Vlastní primery •Umělé geny •Modifikované geny • 2/21/2014 Footer Text 9 Syntéza oligonukleotidů •Umělé geny oDelší geny po částech • 2/21/2014 Footer Text 10 Table 12.3 Some Chemically Synthesized Genes Gene Size (bp) tRNA 126 α-Interferon 542 Secretin 81 γ-Interferon 453 Rhodopsin 1057 Proenkephalin 77 Connective tissue activating peptide III 280 Lysozyme 385 Tissue plasminogen activator 1610 c-Ha-ras 576 RNase T1 324 Cytochrome b 5 330 Bovine intestinal Ca-binding protein 298 Hirudin 226 RNase A 375 Určení sekvence DNA •Dideoxy sekvenace – nápodoba replikace oZnačené primery (+ dNTP, DNA polymerasa, templát - ssDNA) oDideoxy (dd)NTP – 4 nádobky (a) oProdukty končí danou bazí = (b) • • 2/21/2014 Petr Zbořil 11 Určení sekvence DNA •Dideoxy sekvenace oElektroforesa – autoradiografie – 4 dráhy • 2/21/2014 Petr Zbořil 12 Určení sekvence DNA •Dideoxy sekvenace oFluorescenční značení – odlišné pro každý ddNTP oDideoxy (dd)NTP – 1 nádobka oProdukty končí danou bazí - odlišně fluoreskující oCZE v 1 vzorku – automatizace, vícekanálové analýzy • • 2/21/2014 Petr Zbořil 13 PCR •Polymerázová řetězová reakce oOpakování replikace zkoumaného úseku oCyklická změna T •Komponenty oTaq polymeráza, dNTP, primery, vzorek-templát oTermocycler oPotřeba primerů •Kvantitativní PCR oRT PCR •Význam oanalytický – diagnostika, forenzní analýza, opreparativní - pomnožení materiálu, cílené mutace, umělé geny atd. • 2/21/2014 Petr Zbořil 14 PCR •Schema •Nadbytek •reaktantů odNTP, primery •Střídání T – cykly oDenaturace – ca 95 oHybridizace – ca 50 oPolymerace – ca 65 •Geometrická řada oAnalýza produktů •Variace oHybridizace – vliv T o • 2/21/2014 Petr Zbořil 15 Geometrická řada produktu Kvantitativní PCR •Schéma RT PCR oSledování fluorescencí, kvantifikace oVyužití fluorescence, 3‘-exonukleasové aktivity Taq polymerasy • 2/21/2014 Petr Zbořil 16 Modifikace PCR •Využití reverzní transkriptázy •Syntéza cDNA • 2/21/2014 Petr Zbořil 17