A. AMINOKYSELINY, PEPTIDY A BÍLKOVINY Chování disociabilních skupin podstatně ovlivňuje vlastnosti aminokyselin a bílkovin: pK[a1] pK[a2] R‑CH‑COOH Û R‑CH‑COO^‑ Û R‑CH‑COO^‑ ^ ½ ½ ½ NH[3]^+ NH[3]^+ NH[2] Tabulka I. Disociační konstanty aminokyselin pK[a1] pK[a2] pK[a] boční řetězec protonovaný –> deprotonovaný Ala 2,3 9,9 Gly 2,4 9,8 Phe 1,8 9,1 Ser 2,1 9,2 Val 2,3 9,6 Asp 2,0 10,0 3,9 –COOH –> –COO^- Glu 2,2 9,7 4,3 –COOH –> –COO^- His 1,8 9,2 6,0 –imidazolium^+ –> –imidazol Cys 1,8 10,8 8,3 –SH –> –S^- Tyr 2,2 9,1 10,9 –fenyl-OH –> –fenyl-O^- Lys 2,2 9,2 10,8 ‑NH[3]^+ –> –NH[2] Arg 1,8 9,0 12,5 –guanidinium^+ –> –guanidin Asn 2,0 8,8 Gln 2,2 9,1 Trp 2,4 9,4 Leu 2,4 9,6 Ile 2,3 9,6 Met 2,3 9,2 Thr 2,2 9,1 Pro 2,0 10,6[DEL: :DEL] IZOELEKTRICKÝ BOD (pI) AMINOKYSELIN -odpovídá hodnotě pH, při které je aminokyselina elektroneutrální Výpočet pI Obecně: pI = 1/2 (pK[a1] + pK[a2]) pI je aritmetickým průměrem pK[a] kyselé a bazické skupiny Bazické aminokyseliny: pI = 1/2 (pK[a2] + pK[a3]) pI bazické aminokyseliny je průměrem pK[a] obou bazických skupin Kyselé aminokyseliny: pI = 1/2 (pK[a1] + pK[a3]) pI kyselé aminokyseliny je průměrem pK[a] obou kyselých skupin) Velmi slabě kyselé AK (Tyr, Cys) pI = -1/2 log(K[a1].K[a2]+K[a1].K[a3]) Při výpočtu pI pro Tyr, Cys je třeba zohlednit příspěvky všech disociabilních skupin PEPTIDY Peptidy a bílkoviny zapisujeme zleva od N-konce k C-konci. Disociace peptidů s více disociabilními skupinami: Výpočet pI peptidů a bílkovin: internetové algoritmy např. na http://www.expasy.org -> pI/MW tool -zde také další nástroje pro analýzu primární struktury bílkovin BÍLKOVINY Primární struktura bílkovin a její studium Enzymy a činidla štěpící peptidové vazby: Enzym/činidlo Místo hydrolýzy Trypsin Lys, Arg (C strana) Chymotrypsin Phe, Trp, Tyr (C strana) Bromkyan Met (C strana) Aminopeptidáza odštěpení N-teminální aminokyseliny Karboxypeptidáza odštěpení C-terminální aminokyseliny Další reagens: LiBH[4] – redukce -COOH -> -CH[2]OH ninhydrin – reakce s –NH[2] -> fialové zbarvení (důkaz bílkovin), s Pro žluté zbarvení močovina – chaotropní činidlo SDS – detergent merkaptoethanol, dithiothreitol- redukční činidla (viz obrázek) Sangerova reakce Sangerovo činidlo (2,4-DNFB) Edmanovo odbourávání Fenylisothiokyanat Hmotnostní spektrometrie -peptide mass fingerprinting (metoda identifikace proteinů na základě peptidového mapování) -de novo sekvenování proteinů Sekundární struktura bílkovin Sekundární struktura bílkovin je důsledkem její primární struktury. Sekundární strukturu bílkoviny proto lze předpovědět ze znalosti primární struktury např. pomocí počítačového modelování. K základním typům sekudární struktury bílkovin patří: helikální struktury: a-helix, další helixy,... b-struktury: skládaný list (paralelní x antiparalelní),... reverzní smyčka (b-otočka),... Relativní pravděpodobnost, že se daná aminokyselina vyskytne v a-šroubovici, skládaném listu nebo v reverzní smyčce je udána v následujícím grafu: Terciární struktura bílkovin -fibrilární a globulární proteiny -studium: rentgenová strukturní analýza Kvarterní struktura bílkovin -funkční enzym je tvořen více polypeptidovými podjednotkami Stabilita proteinů -elektrostatické síly -vodíkové můstky -hydrofobní interakce -disulfidové vazby ÚLOHY 1. Napište vzorce aminokyselin a) majících aromatické jádro b) obsahujících síru c) majících při pH 7 celkový kladný náboj d) majících při pH 7 celkový záporný náboj e) majících alifatický řetězec f) která aminokyselina nemá žádný asymetrický uhlíkový atom a která má dva asymetrické atomy? 2. Zakreslete titrační křivku a popište inflexní bod a) slabé kyseliny (kys. octové) b) aminokyseliny (glycinu) 3. Vypočítejte procentuální obsah disociované formy karboxylové skupiny a NH[3]^+ skupiny glycinu při pH: 3,0 a 11,0. (pK[a1]= 2,4, pK[a2]= 9,0) 4. Peptidová vazba mezi glycinem a threoninem může vzniknout dvěma způsoby. Napište vzorce obou variant. Analýzou bylo zjištěno, že izoelektrický bod jednoho z peptidů je při pH 6,38. O který peptid se jedná? Disociační konstanty glycinu: pK[a1]= 2,34, pK[a2]= 9,60 Disociační konstanty threoninu: pK[a1]= 2,63, pK[a2]= 10,43 (Při výpočtu zanedbáme fakt, že disociační konstanty koncových skupin dipeptidu se mohou po kondenzaci změnit) 5. Odhadněte celkový náboj peptidu při pH 5 a při pH 9. Arg‑His‑Gly‑Phe‑Gly‑Glu‑Lys‑Tyr‑Cys‑Ala Hodnoty pKa koncových disociabilních skupin jsou: pK[a1]=3,6, pK[a2]=7,9 6. Jakého pH je nutno použít, aby se každý z peptidů pohyboval při elektroforéze na opačnou stranu. A. Ser‑Tyr‑Ser‑Met‑Glu‑His‑Phe‑Arg‑Gly B. Val‑Cys‑Phe‑Glu‑Ala‑Lys‑Leu‑Gln‑Gly Hodnoty pKa koncových disociabilních skupin jsou: pK[a1]=3,6, pK[a2]=7,9 7. Následující směs aminokyselin byla podrobena elekroforéze. Rozdělte aminokyseliny podle směru migrace při pH 3 a při pH 7: Gly, Ala, Glu, Lys, Arg, Ser, Asp, Asn 8. Směs aminokyselin byla nasazena na katex v 0,1 mol.l^‑1 HCl. Napište, které aminokyseliny se pravděpodobně zachytí a které z kolony vytečou. Poté byla kolona promývána pufrem o pH 6. Které aminokyseliny se uvolní a které zůstanou vázány: Gly, Ala, Glu, Lys, Arg, Ser 9. Směs aminokyselin byla nasazena na anex při pH=11 Arg, Ala, Glu, Tyr, Ser a) Jaký bude celkový náboj každé z aminokyselin? Které aminokyseliny se zachytí na koloně a které vytečou? b) Poté byl na kolonu nasazen pufr o pH=8. Jaký bude celkový náboj každé aminokyseliny a které aminokyseliny z kolony vytečou? 10. Směs aminokyselin byla nasazena na katex v 0,1 M HCl. Vypočítejte izolelektrický bod každé z aminokyselin. Napište pořadí, v jakém se budou tyto látky z kolony eluovat při postupném zvyšováni pH: Glu, Ala, His, Lys, Tyr 11. Směs aminokyselin byla nasazena na anex při pH 10. Které aminokyseliny se nezachytí a které zůstanou vázány: Cys, Glu, Ser, Ala, Lys, His 12. Jaké musí být pH pufru, aby bylo možno od sebe oddělit tyto dva peptidy: a) na sloupci katexu: NH[2]‑Ala‑Glu‑Gly‑Tyr‑Lys‑COOH (I) NH[2]‑Gly‑Asp‑His‑Tyr‑Lys‑COOH (II) b) na sloupci anexu: NH[2]-Ser-Tyr-Met-Glu-His-Phe-Arg-Gly-COOH (III) NH[2]-Val-Cys-Phe-Glu-Ala-Lys-Leu-Gln-Gly-COOH (IV) Jaký bude náboj každého peptidu při tomto pH? Popište, zda se peptid zachytí na koloně nebo vyteče. 13. Směs aminokyselin byla nasazena na katex při pH 1,0. Eluce byla provedena gradientem rostoucího pH. Odhadněte pořadí eluce aminokyselin: Gly, Asp, Tyr, Ala, His, Arg 14. Tetrapeptid byl zpracován 2,4-DNFB a hydrolyzován. Značenou aminokyselinou byl 2,4‑DNFB‑valin a lysin. Hydrolýza trypsinem dala dva štěpy, z nichž první obsahoval aminokyselinu, která po redukci LiBH[4] dává CH[2](NH[2])CH[2]OH a navíc obsahuje aminokyselinu, která se ninhydrinem barví žlutě. Určete sekvenci tohoto peptidu. 15. Napište, jak byste stanovili sekvenci následujícího peptidu pomocí selektivní hydrolýzy trypsinem a 2,4-dinitrifluorbenzenu. NH[2]‑Ala‑Lys‑Glu‑Gly‑COOH Při dělení meziproduktu hydrolýzy trypsinem použijte metodu iontoměničové chromatografie, popište její podmínky. 16. Určete primární strukturu peptidu P na základě následujících reakcí: a) redukce b-merkaptoethanolem pokytne dva peptidy B a C b) Po působení DNFB na peptid P a kyselé hydrolýze v přítomnosti b-merkaptoethanolu získáme následující aminokyseliny: DNP-Asp, DNP-Leu, 2 Lys, 2 Cys, 1 Gly, 1 Glu, 1 Met, 1 Phe, 1 Ala c) peptid B je podroben působení chymotrypsinu , získáme Ala, hydrolýza trypsinem dává 2 tripeptidy. Sangerova metoda aplikovaná na tyto 2 tripeptidy prokázala přítomnost DNP-Leu, DNP-Cys d) působením bromkyanu na peptid C získáme Glu, trypsinolýza dává jeden dipeptid a jeden tripeptid: Sangerova metoda aplikovaná na tento tripeptid prokázala přítomnost DNP-Asp Jaká je struktura, B, C a P? 17. Složení heptapeptidu P je následující: Glu, Ala, Lys, Arg, Cys, Met, Tyr a) aminopeptidáza a karboxypeptidáza nemají žádný účinek b) po působení chymotrypsinu vzniká jeden hexapeptid, který po Sangerově reakci dává DNP-Cys c) po působení trypsinu vznikají dva peptidy: Jeden tripeptid, který po Sangerově reakci a hydrolýze dává DNP-Glu a DNP-Lys a dále jeden tetrapeptid, který působením aminopeptidázy uvolní nejdříve Met a potom Tyr Určete sekvenci peptidu P 18. Polypeptid byl redukován b-merkaptoethanolem a výsledkem reakce byly dva peptidy o následující sekvenci: Asn-Cys-Phe-Thr-Lys-Lys-Trp-Cys-Arg-Ala-Val-Cys Cys-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Pro-Cys Nativní peptid byl hydrolyzován thermolysinem: Za experimentálních podmínek hydrolyzuje tento enzym peptidové vazby v místě aminoskupiny následujících aminokyselin: Leu, Phe, Trp, Tyr, Val. Byly získány 4 peptidy o tomto složení: A) Asn, 2 Cys, Val B) 2 Lys, Phe, Thr C) Arg, Ala, Trp, Tyr, 2 Cys D) 2 Cys, Thr, 2 Pro, Phe Udejte polohu disulfidických můstků nativního peptidu. 19. Po tryptické hydrolýze určitého proteinu byl izolován oligopeptid P o následujícím složení: 1 Lys, 1 Asp(n), 1 Thr, 1 Glu(n), 1 Val, 1 Ile, 1 Phe, 1 Leu Sumární náboj peptidu P při pH 6,5 je negativní. Po reakci peptidu s DNFB byl získán DNP-Thr. Karboxypeptidáza uvolňuje postupně tyto aminokyseliny: Lys, Leu, Ile, Val. Jestliže je peptid P hydrolyzován chymotryspinem, byl získán oligopeptid o následujícím složení: 1 Asp, 1 Val, 1 Leu, 1 Ile, 1 Lys Udejte sekvenci P. 20. Primární struktura bílkoviny, jenž obsahuje prolin a úseky, ve kterých následuje několik aminokyselin se stejným nábojem, znemožňuje tvorbu a-šroubovice. Odhadněte, které úseky následující bílkoviny by mohly mít sekundární strukturu a-šroubovice: ‑ Leu‑Ala‑His‑Thr‑Tyr‑Gly‑Pro‑Phe‑Glu‑Ala‑Ala‑Met‑Cys‑His‑ ‑Glu‑Glu‑Asp‑Pro‑Asp‑Gly‑Met‑Gly‑Cys‑Ala‑Phe‑His‑ Jak by vypadala situace v případě poklesu pH pod oblast disociační konstanty karboxylových skupin? 21. Určitý peptid je silným inhibitorem vedení nervového vzruchu. Analýza prokázala následující aminokyselinové složení: 5 Ala, Lys, Phe. Reakce intaktního peptidu s 2,4-DNFB prokázala po hydrolýze přítomnost DNF-alaninu. Štěpení pomocí trypsinu dalo tripeptid o (Lys, 2 Ala) a tetrapeptid (3 Ala, Phe). Štěpení pomocí chymotrypsinu poskytlo hexapeptid a volný fenylalanin. Napiště sekvenci tohoto peptidu. 22. Určitý protein o sekvenci Met-Ala-(Leu-Phe-Ala)[3]-(Leu-Met-Phe)[3]-Pro-Ans-Gly-Met-Leu-Phe je zakotven svým NH[2] koncem v hydrofobním sektoru cytoplasmatické membrány. Pokuste se předpovědět jeho sekundární strukturu. Po mutaci byly všechny Leu zbytky nahrazeny Asp. Může to způsobit změnu sekundární struktury? 23. Při denaturaci bílkovin dojde vždy a) ke změně primární struktury b) " sekundární struktury c) " terciární struktury d) " kvarterní struktury e) " molekulové hmotnosti 24. Jaká je délka bílkovinného řetězce obsahujícího 153 aminokyselin, a) pokud byl byl zcela ve formě a-šroubovice a zcela ve formě b-skládaného listu b) celková délka molekuly určité bílkoviny (153 aminokyselin) obsahující pouze a-šroubovici a b-skládaný list je 4,2 .10^-6 cm. Vypočítejte, jaká frakce molekuly obsahuje a-šroubovici. 25. Jeden vlas roste průměrnou rychlostí 20 cm za rok. Vlas je tvořen a-keratinem složeným z a-šroubovice. Vypočítejte rychlost syntézy peptidových vazeb za jednu vteřinu. 26. Buňka E. coli obsahuje 25 000 ribosomů. Pokud by strukturální proteiny ze všech těchto ribosomů byly nataženy do maximální délky (b-šroubovice), kolikrát by mohly ovinout buňku E. coli. Předpokládejte průměr ribosomů 18 nm o specifické hmotnosti 1, obsahující 40% hmotnosti strukturálních proteinů. Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny je 120. Buňka E. coli je sférická o průměru 1 mm. 27. Vypočítejte specifickou hmotnost molekuly tropokolagenu, kterou lze považovat za válec o délce 0,28 mm a o průměru 1,4 nm. Obsahuje 3 polypeptidické řetězce se 1000 aminokyselinovými zbytky. Průměrná molekulová hmotnost 1 aminokyseliny je 120. 28. Následující látky jsou velmi často používány při studiu bílkovin : 1/ BrCN (bromkyan) 2/ močovina 3/ merkaptoethanol 4/ karboxypeptidáza 5/ 6 M HCl 6/ ninhydrin 7/ 2,4-dinitrofluorbenzen a) Která z nich se používá označení N-konce bílkoviny? b) Která by byla použita pro štěpení peptidické vazby na C-straně methioninu? c) Která by byla použita pro štěpení intermolekulárních nebo intramolekulárních disulfidických můstků? d) Která látka se používá pro potlačení vodíkových vazeb? B. SACHARIDY struktura a chem.vlastnosti nejdůležitějších sacharidů – viz prezentace ÚLOHY 1. Nejjednodušší ketosa je a) trehalosa b) fruktosa c) erythrulosa d) dihydroxyaceton 2. Ketosy mají hemiacetalový hydroxyl na uhlíku č. a) 1 b) 2 c) 3 d) 6 3. Mutarotace je důsledkem přeměny a) aldosy na ketosu nebo naopak b) hexosy na pentosu " c) formy D- na L- " d) formy a- na b- 4. Napište vzorce následujících disacharidů: a) 4‑O‑a‑D‑glukopyranosyl‑a-D‑glukopyranosa b) 4‑O‑b‑D‑galaktopyranosyl‑a-D‑glukospyranosa c) a‑D‑mannopyranosyl‑a‑D‑glukopyranosid d) 4‑O‑b‑D‑mannopyranosyl‑a-D‑galaktopyranosa e) b‑D‑galaktopyranosyl‑b‑D‑glukopyranosid 5. Která OH skupina glukosy je nejreaktivnější? Napište vzorec reakčního produktu D‑glukosy s methanolem v kyselém prostředí. Napište vzorec produktu reakce galaktosy se silnými alkylačními činidly (CH[3]I, dimethylsulfát). Tento produkt byl dále podroben mírné kyselé hydrolýze. Napište vzorec výsledné látky. 6. Napište vzorec produktu redukce D‑glukosy amalgámem sodíku. Napište vzorec produktu oxidace D‑mannosy slabými oxidačními činidly (NaIO) a silnými oxidačními činidly (HNO[3]). 7. Laktosa byla methylována pomocí dimethylsulfátu a poté hydrolyzována zředěnou HCl. Napište vzorce produktů. 8. Kyselá hydrolýza trisacharidu dává D‑glukopyranosu a D‑galaktopyranosu v poměru koncentrací 2:1. Úplná methylace trisacharidu a následná hydrolýza dává tyto produkty: 2,3,6‑tri‑O‑methyl‑D‑galaktopyranosa 2,3,4,6‑tetra‑O‑methyl‑D‑glukopyranosa 2,3,4‑tri‑O‑methyl‑D‑glukopyranosa Napište vzorec trisacharidu (jsou možné dvě varianty). 9. 3‑O‑a‑D‑mannopyranosyl‑a-D‑glukopyranosa byla methylována pomocí dimethylsulfátu a pak hydrolyzována zředěnou HCl. Napište vzorce výsledných produktů. 10. 6‑O‑a‑D‑galaktopyranosyl‑a-D‑glukopyranosa byla methylována pomocí dimethylsulfátu a pak hydrolyzována zředěnou HCl. Napište vzorce výsledných produktů. 11. Po methylaci disacharidu dimethylsulfátem a jeho hydrolýze zředěnou HCl byly získány následující sacharidy: 2,3,4,6‑tetra‑O‑methylgalaktopyranosa 2,3‑di‑O‑methylribofuranosa Napište vzorec tohoto disacharidu 12. Při úplné metylaci disacharidu a hydrolýze ve zředěné HCl byly získány následující produkty: a) 1,3,6‑tri‑O‑metyl-a-D-fruktofuranosa 2,3,4,6‑tetra‑O‑metyl‑a-D‑galaktopyranosa Napište vzorec tohoto disacharidu. b) kys. 2,3,4‑tri‑O‑methylmannuronová 2,3,4,6-tetra‑O‑methyl-a-D-glukopyranosa Napište vzorec tohoto disacharidu. (Předpokládejte, že eventuální methylester kyseliny se při hydrolýze v HCl zcela hydrolyzoval) 13. Napište vzorec: 3‑O‑b ‑D‑mannopyranosyl‑b-D‑fruktofuranosy. Tento disacharid byl metylován pomocí metyljodidu a hydrolyzován v slabé HCl. Napište vzorec produktu. [DEL: :DEL] [DEL: :DEL] C. LIPIDY Nejdůležitější přirozené mastné kyseliny: FOSFOLIPIDY když když R = ÚLOHY 1. Všechny lipidy jsou po chemické stránce a) amidy b) estery c) etery d) acetaly 2. Tekutost lipidů je úměrná obsahu a) vody b) volného glycerolu c) nasycených mastných kyselin d) nenasycených mastných kyselin [DEL: :DEL] 3. Napište vzorce těchto mastných kyselin: kys. olejová (18:1)^D^9, kys. linolová (18:2)^D^9,12 kys. palmitolejová (16:1)^D^9, kys. linolenová (18:3)^D^9,12,15 4. Napište vzorce těchto fosfolipidů: a) kys. dipalmitoylfosfatidová b) 1‑palmitoyl‑2‑oleylfosfatidylcholin[DEL: :DEL] c) dipalmitoylfosfatidylethanolamin d) 1‑stearoyl‑2‑palmitoylfosfatidylglycerol e) dioleylfosfatidylserin f) 1‑stearoyl-2‑linoloylfosfatidylserin [kys. linolová: (18:2)^D^9,12] g) 1‑palmitoyl-2‑oleylfosfatidylglycerol [kys. olejová (18:1)^D^9] Jaký bude celkový náboj fosfolipidů při pH 7,5? Hodnoty pK[a]: 1x substituovaný fosfát pK[a1]= 6,8, pK[a2]=12,3 2x substituovaný fosfát pK[a1]= 6,8 serin: pK[a1]=2,1, pK[a2]=9,2 5. Napište vzorec cholesterolu a očíslujte jej. 6. Fosfolipidy jsou důležitými složkami biomembrán, kterým udělují kladné nebo záporné náboje. Jaký bude celkový náboj jednotlivých fosfolipidů a)‑c) v úloze 4, bude ‑li pH prostředí 5 a 8. (pK[a] fosfátové skupiny je v oblasti 6‑7). 7. Vaječný lecithin je heterogenní směs diacylfosfatidylcholinů, z nichž 70% má v poloze 1 kys. palmitovou a 61% v poloze 2 kys. olejovou. Tento lecithin je dostupným zdrojem při syntéze definovaných fosfolipidů. Navrhněte metody syntézy: a) dipalmitoylfosfatidylcholinu b) 1‑palmitoyl‑2‑stearoylfosfatidylcholinu c) distearoylfosfatidylethanolaminu Použijte těchto údajů: 1. Selektivního odštěpení acylu v poloze 1 lze dosáhnout fosfolipázou A[1], v poloze 2 fosfolipázou A[2]. 2. Chemicky lze obě mastné kyseliny odštěpit mírnou alkalickou hydrolýzou za katalýzy tetrabutylamonium hydroxidem. 3. Acylace glycerolu se provádí příslušnými acylchloridy. 4. Hydrolýzu vazby mezi fosfátem a bazí katalyzuje fosfolipasa D. Rovnovážná konstanta této reakce je rovna 1. D. NUKLEOVÉ KYSELINY Nukleové baze Nukleosidy Primární struktura nukleových kyselin -struktura vazby mezi nukleotidy: viz prezentace Metody studia primární struktury nukleových kyselin: Enzymy používané k hydrolýze nukleových kyselin (mohou být specifické na DNA, RNA, nebo bez specifity): -Fosfomonoesterázy hydrolyzují terminální fosfátovou skupinu -Fosfodiesterázy: hydrolyzují fosfodiesterovou vazbu: exonukleázy (5´- exonukleázy uvolňují 3´P nukleosidy, 3´- exonukleázy uvolňují 5´P nukleosidy) endonukleázy uvolňují oligonukleotidy, jsou obvykle substrátově specifické (deoxyribonukleáza, ribonukleáza) -Polynukleotidkináza: Fosforyluje volnou 5´OH skupinu pentózy pomocí ATP Maxam-Gilbertova metoda sekvenace nukleových kyselin: 1. Označení konce nukleové kyseliny pomocí ATP (^32P) 2. Specifická chemická hydrolýza před (=na 5’ straně): G: působením DMS za tepla G + A: působením kyseliny a DMS C: působením hydrazinu v prostředí 5 M NaCl C + T: působením hydrazinu 3. Elektroforéza získaných fragmentů za denaturačních podmínek (rychlost migrace je nepřímo úměrná počtu nukleotidů) 4. Skenování gelů na fosfoimageru (detekce radioaktivity) Dnes se používají automatické sekvenátory v servisních laboratořích na bázi modifikované Maxam-Gilbertovy metody (kapilární elektroforéza s laserem indukovanou fluorescencí). Sekundární struktura DNA Základní strukturou DNA je dvojitá šroubovice stabilizovaná vodíkovými vazbami mezi A-T a G-C (Chargaffova pravidla). Základní dvojitá šroubovice (B-DNA) obsahuje 10 bp (base pair=pár bazí) na jednu otáčku a vzdálenost mezi dvěma následujícími páry bazí je 0,34 nm. Méně běžné typy: A-DNA šroubovice obsahuje 11 bp/otáčka a vzdálenost mezi sousedními bp je 0,23 nm. Z-DNA šroubovice obsahuje 12 bp/otáčka a vzdálenost mezi sousedními bp je 0,38 nm. Genetický kód mRNA prokaryot: 1. Napište vzorce adeninu, nukleosidu a nukleotidu od něho odvozeného. 2. Roztok obsahující AMP a GMP měl absorbanci A[260] = 0,652 a A[280] = 0,284, vypočítejte koncentraci AMP a GMP v roztoku, jestliže pro AMP je e při 260 = 15,4 x 10^3 M^-1.cm^-1, e při 280 = 2,5 x 10^3 M^-1.cm^-1. Pro GMP e při 260= 11,7 x 10^3 M^-1.cm^-1, e při 280 = 7,7 x 10^3 M^ -1.cm^-1. 3. Napište úplnou strukturu ribodinukleotidu a desoxyribodinukleotidu složeného z A a C. 4. Vypočítejte průměrnou molekulovou hmotnost jednoho nukleotidového zbytku DNA a RNA, za předpokladu, že baze jsou přítomny v ekvimolárních koncentracích. Nezapomeňte na kondenzaci vody při vytvoření esterové vazby! (Molekulové hmotnosti složek: A = 135, G = 151, C = 111, U = 112, T = 126, ribóza 150, kys. fosforečná = 98). 5. Schematické znázornění sekvence RNA (zapsáno od volného 3' konce k 5' konci) je následující: UpCpUpApGpAp Napište produkty hydrolýzy této RNA pomocí následujících enzymů: a) fosfomonoesteráza b) fosfodiesteráza hadího jedu (3´- exonukleáza) c) fosfodiesteráza ze sleziny (5´- exonukleáza) d) ribonukleáza T1 (hydrolýza v místě G, vznik 3´P oligonukleotidu) e) ribonukleáza U2 (hydrolýza v místě A nebo G, vznik 3´P oligonukleotidu) 6. Oligonukleotid pocházející z DNA má následující sekvenci (zapsáno od volného 5' konce k 3' konci): pApCpTpTpApG 5´ terminální nukleotid byl označen ^32P. Jaké oligonukleotidy získáme po působení fosfodiesterázy hadího jedu (viz výše). Které z nich budou značeny ^32P? Které oligonukleotidy získáme hydrolýzou pomocí desoxyribonukleázy II a které z nich budou značeny ^32P (desoxyribonukleáza II je endonukleáza uvolňující 3´P oligonukleotidy). 7. Oligoribonukleotid X je složen z následujících bazí: 2A, 2C, U, G. a) po působení fosfodiesterázy z hadího jedu se po krátké době uvolní pC. b) hydrolýzou pomocí pankreatické ribonukleázy získánme C, dinukleotid obsahující A a C a dále trinukleotid obsahující A, G a U. (penkreatická ribonukleáza je endonukleáza a působí v místě C a U za vzniku 3´P oligonukleotidů). c) hydrolýzou pomocí ribonukleázy T2 (hydrolýza v místě A za vzniku 3´P oligonukleotidů) získáme pAp, dinukleotid obsahující U a C a trinukleotid obsahující A, G a C. Určete sekvenci oligoribonukleotidu 8. Udejte sekvenci oligodesoxyribonukleotidu stanovovanou Maxam-Gilbertovou metodou. Na fosfoimageru byl získán následující obraz: G + A G C + T C start E. TERMODYNAMIKA ENZYMOVÝCH REAKCÍ Standardní stav v biochemii: * t=25°C * p=0,101 MPa * pH=7 (koncentrace [H^+] a iontové stavy disociabilních látek) * jednotkové koncentrace látek * koncentrace H[2]O zahrnuta do hodnoty rovnovážné konstanty Základní vztahy E aA + bB Û cC + dD [C]^c[D]^d DG’ = DG^0’ + RT ln -------- [A]^a[B]^b povaha aktuální reakce podmínky (rovnováha) V rovnovážném stavu platí DG’=0, proto DG°’ = ‑RT ln K’[eq ] DG<0 ... exergonická reakce, samovolně probíhá v daném směru DG=0 ... reakce v rovnováze DG>0 ... endergonická reakce, samovolně probíhá v opačném směru Hodnoty DG°’ hydrolýzy důležitých makroergických vazeb DG°‘ [kJ.mol^‑1] fosfoenolpyruvát Û pyruvát ‑61,8 karbamoylfosfát Û karbamát ‑51,4 acetylfosfát Û k.octová ‑43,0 kreatinfosfát Û kreatin ‑43,0 difosfát Û fosfát ‑33,4 acetylCoA Û acetát ‑31,3 ATP Û ADP -30,5 ADP Û AMP ‑30,5 glukosa‑1‑fosfát Û glukosa ‑20,9 glukosa‑6‑fosfát Û glukosa ‑12,5 (glycerol‑3‑ fosfát Û glycerol ‑8,4) Struktury některých makroergických sloučenin Spřažené reakce Podle zákona zachování energie nezávisí energetická bilance změny systému na cestě, kterou tato změna nastala. Aditivita změn volné energie umožňuje, aby endergonické reakce byly za jistých podmínek poháněny reakcemi exergonickými. ÚLOHY 1. Vypočítejte DG°’ reakce přeměny dihydroxyacetonfosfátu na glyceraldehydfosfát, je‑li K‘[eq]= 0,0475 při 25^oC. Vypočítejte DG‘ reakce, je‑li koncentrace dihydroxyacetonfosfátu 2.10^‑4mol.l^‑1 a glyceraldehydfosfátu 3.10^‑6 mol.l^‑1. 2. Vypočítejte DG‘ hydrolýzy ATP na ADP a P[i], jsou‑li koncentrace ADP a ATP ekvimolární a koncentrace fosfátu při 25^ oC: a) 1 mol.l^‑1, b) 0,001 mol.l^‑1. c) Jaká je DG‘ hydrolýzy za aktuálních podmínek hydrolýzy ve svalu, kde je koncentrace [ATP] = 5 mmol.l^‑1, [ADP] = 0,5 mmol.l^‑1, [P[i]]= 1 mmol.l^‑1při 25^oC. 3. Vypočítejte DG’ hydrolýzy difosfátu na fosfát, je‑li aktuální koncentrace difosfátu 1 mmol.l^‑1, koncentrace fosfátu 150 mmol.l^‑1. DG°’ reakce je ‑33,4 kJ.mol^‑1, teplota 25^oC. Vypočítejte rovnovážnou konstantu reakce. 4. Jaká musí být koncentrace malátu, aby reakce: malát Û fumarát + H[2]O byla v rovnováze, je-li koncentrace fumarátu 1 mmol.l^‑1, DG°’ reakce je +3,1 kJ.mol^‑1, t= 25^oC? 5. Vypočítejte DG°’ a K[eq] reakce při 25^oC: ATP + CH[3]COCOOH Û ADP + CH[2]C(OP)‑COOH Jaký je rovnovážný poměr koncentrací [pyr]/[PEP], je‑li poměr [ATP]/[ADP]=10? 6. Tvorba acetyl‑CoA probíhá v přítomnosti ATP: CH[3]COOH + ATP + HS-CoA Û CH[3]CO-CoA + AMP + PP[i] (PP[i] je difosfát). Vypočítejte DG°’ reakce (předpokládejte, že DG°’ hydrolýzy ATP‑Û AMP + PPi je stejné jako při vzniku ADP a Pi; PPi je hydrolyzován pyrofosfatázou). Vypočítejte celkové DG°’ reakce při 25^oC. Jaký je vliv hydrolýzy difosfátu? 7. Vypočítejte DG°’ izomerace: glukosa‑6‑fosfát Û glukosa‑1‑ fosfát Jaký je rovnovážný poměr koncentrace obou látek při 25^oC. Jaké je DG’ reakce, je‑li koncentrace glukosa‑6‑fosfátu 10 mmol.l^‑1 a koncentrace glukosa‑1‑fosfátu 2 mmol.l^‑1? 8. Kreatinfosfát je hlavní zásobní látkou svalu. Jaké je DG°’ reakce: ATP + kreatin Û ADP + kreatinfosfát Jaký je rovnovážný poměr kreatin‑ fosfát /kreatin při 25^oC, jsou‑li koncentrace ADP a ATP ekvimolární? 9. Koncentrace glukosy v buňce je 1 mmol.l^‑1, koncentrace glukosa‑1‑fosfátu 0,05 mmol.l^‑1. Jaký musí být poměr koncentrací ATP/ADP, aby reakce: ATP + glukosa Û glukosa‑1‑fosfát + ADP byla při 25^oC v rovnováze? 10. Vypočítejte DG°’ reakce při 25^oC: sacharosa + P[i] Û glukosa‑1‑ fosfát + fruktosa K dispozici máte tyto údaje: 1/ sacharosa Û glukosa + fruktosa K’[eq]= 1,35.10^5 2/ glukosa‑1‑ fosfát Û glukosa + P[i] DG°’ = ‑20,9 kJ.mol^-1 Jaká bude volná energie reakce DG’ za aktuálních podmínek: Koncentrace [P[i]]=1 mmol.l^-1, [sacharosa]=0,5 mmol.l^-1, [glukosa‑1‑ fosfát]=[fruktosa]= =4 mmol.l^-1. Je možno glykosidovou vazbu sacharosy počítat mezi makroergickou vazbu, pokud mezi makroergické vazby počítáme vazby se standardní volnou energií hydrolýzy nižší než ‑10 kJ.mol^-1? 11. Vypočítejte DG°’ tvorby aktivované glukosy při 25°C: glukosa‑1‑P + ATP Û ADP‑glukosa + PPi K dispozici máte tyto údaje: 1/ ADP‑glukosa Û glukosa + ADP K’[eq]= 722 2/ ATP Û ADP + Pi DG°’= ‑ 30,5 kJ/mol 3/ glukosa‑1‑P Û glukosa + Pi DG°’ = ‑20,9 kJ.mol^-1 4/ hydrolýza PP[i]: PPi Û 2 Pi DG°’ = ‑33,4 kJ.mol^-1 Vypočítejte DG’ hydrolýzy difosfátu za aktuálních podmínek koncentrace při 25^oC: [P[i]] = 5 mmol.l^-1, [PP[i]] = 2 mmol.l^-1. 12. Vypočítejte DG°’ hydrolýzy aktivované glukosy při 25°C: ADP‑glukosa + H[2]O Û glukosa + ADP K dispozici máte tyto údaje: 1/ Glukosa‑1‑ fosfát + ATP Û ADP‑glukosa + PP[i] K’[eq] = 2 2/ hydrolýza difosfátu: PP[i] Û 2 Pi DG°’ = ‑ 33,4 kJ.mol^-1 3/ Glukosa‑1‑ fosfát Û glukosa + P[i] DG°’ = ‑20,9 kJ.mol^-1 4/ ATP Û ADP + P[i] DG°’[ ]= ‑30,5 kJ.mol^-1 F ÚVOD DO ENZYMOLOGIE TŘÍDY ENZYMŮ A JEJICH SYSTEMATICKÉ NÁZVOSLOVÍ 1. Oxidoreduktasy A^-+ B Û A + B^- donor:akceptor-oxidoreduktasa např. glukosa:O[2]-oxidoreduktasa, triviálně glukosaoxidasa Pozor: U reakcí s NADH jako donorem resp. NAD^+ jako akceptorem se upřednostňuje systematický název donor:NAD^+-oxidoreduktasa před NADH:akceptor-oxidoreduktasa 2. Transferasy A-B + C Û A + B-C donor:akceptor-skupinatransferasa např. ATP:glukosa-6-fosfotransferasa, triviálně glukokinasa či hexokinasa 3. Hydrolasy A-B + H[2]O Û A-H + B-OH substrát-skupinahydrolasa např. protein-amidohydrolasa, triviálně proteasa 4. Lyasy (synthasy) X Y ½ ½ A –B Û A - B + X-Y substrát-skupinalyasa např. citrát-oxalacetátlyasa, triviálně citrátsynthasa 5. Isomerasy X Y Y X ½ ½ ½ ½ A –B Û A - B komplikované názvosloví, enzym může končit názvem: racemasa (katalyzuje stereochemické změny substrátu, např. alaninracemasa) epimerasa (např. UDP-glukosa-4-epimerasa) isomerasa (obecně substrát-děj-isomerasa, např. maleinát-cis-trans-isomerasa) mutasa (např. chorismátmutasa) 6. Ligasy (synthetasy) A + B Û A-B substrát:substrát-ligasa(tvořící nukleotid) např. alanin:tRNA^Ala-ligasa(tvořící AMP), triviálně alanyl-tRNA-synthetasa KINETIKA ENZYMOVÝCH REAKCÍ v[o] ... počáteční rychlost enzymové reakce (odpovídá počáteční koncentraci substrátu) K[M] ... Michaelisova konstanta: Koncentrace substrátu, při níž enzymová reakce probíhá rychlostí rovnou 1/2 v[lim] v[lim] ... limitní počáteční rychlost v[lim] [S] v[o ]= --------------- Rovnice Michaelise‑Mentenové K[M] + [S] Jestliže platí [S] ® ¥ a enzymová reakce probíhá za optimálních podmínek (teplota, pH), pak v[o]= v[lim] = k[kat][E][t] (limitní počáteční rychlost je za těchto podmínek přímo úměrná koncentraci enzymu [E][t]). Limitní rychlost lze tedy za podmínek [S] ® ¥ , teplotní a pH optimum ztotožnit s enzymovou aktivitou. Jednotky enzymové aktivity: 1 katal = 1 mol.s^‑1 1 IU = 1 mmol.min^‑1 (IU=Mezinárodní jednotka) Konstanta k[kat] [s^-1] vyjadřuje molekulární aktivitu enzymu (dříve označována jako číslo přeměny)=počet molekul (resp. molů) substrátu přeměněných za jednu sekundu jednou molekulou (resp. jedním molem) enzymu. Enzymová inhibice Inhibice kompetitivní: K[m] E + S Û ES ® E + P K[i] E + I Û EI Jestliže S® ¥ , pak [EI] ® 0 , a v[o ]= v[lim] Inhibice nekompetitivní: K[m] E + S Û ES ® E + P K[i] +S E + I Û EI Û EIS K[m] +I E + S Û ES Û EIS Bílkovinné a nebílkovinné složky enzymů holoenzym kofaktor apoenzym ionty kovů koenzym kosubstrát prostetická skupina (podléhá cyklické regeneraci) ÚLOHY 1. Enzymy v uzavřeném systému a) posunují rovnováhu reakce ve směru tvorby produktu b) neovlivňují rovnovážný stav reakce c) zvyšují DG°’ reakce d) snižují " 2. Pojmenujte enzymy katalyzující následující reakce a zařaďte je podle enzymové nomenklatury (tj. hydrolasa, transferasa, oxidoreduktasa, apod.): a) oxalacetát + NADH + H^+ ® malát + NAD^+ b) glutamát + pyruvát ® 2-oxoglutarát + alanin c) škrob + nH[2]O® n(maltosa) d) formaldehyd + NADH + H^+ ® methanol + NAD^+ e) fruktosa + ATP ® fruktosa-6-fosfát + ADP f)[ ]močovina + H[2]O ® amoniak + CO[2] g) glukosa-6-fosfát ® glukosa-1-fosfát h) D-alanin + D-alanin + ATP ® D-alanyl-D-alanin + ADP + P[i] 3. Glukokinasa a hexokinasa jsou enzymy katalyzující tutéž reakci: ATP + glukosa Û glukosa‑6‑P + ADP Glukokinasa z jater má K[M] pro glukosu 10 mmol.l^‑1, enzymová aktivita je 1,5 mmol.min^‑1. Hexokinasa má K[M] 0,1 mmol.l^‑1, enzymová aktivita je 0,1 mmol.min^‑1. Vypočítejte počáteční rychlost přeměny glukosy při její následující koncentraci (ATP je v nadbytku) a srovnejte hodnoty pro oba enzymy. a) 0,1 mmol.l^‑1 b) 1 mmol.l^‑1 c) 5 mmol.l^‑1 normální hodnota d) 30 mmol.l^‑1 diabetes 4. Aktivita enzymu v roztoku je 0,2 mmol.min^‑1, Michaelisova konstanta enzymu pro daný substrát je 0,2 mmol.l^‑1. Vypočítejte, jakou počáteční rychlostí bude enzymová reakce probíhat, je‑li koncentrace substrátu 0,005 mmol.l^‑1. 5. Na základě měření vypočítejte kinetické parametry enzymu, tj. K[M ]a limitní počáteční rychlost. Použijte např. grafické vynesení podle Lineweaver-Burka. konc. substrátu (mol.l^‑1) v[o] (mmol.min^‑1) 0.3,10^‑5 10,4 0.5,10^‑5 14,5 1.10^‑5 22,5 3.10^‑5 33,8 9.10^‑5 40,5 6. Jak byste eliminovali působení a) kompetitivního b) nekompetitivního inhibitoru? 7. Při kinetickém měření závislosti reakční rychlosti na koncentraci substrátu byly zjištěny následující hodnoty: [S] (mmol.l^-1) v[o] (mmol.min^-1) 0,1 0,046 0,2 0,086 0,4 0,150 1,0 0,270 2,0 0,370 Vypočítejte Michaelisovu konstantu enzymu pro tento substrát. 8. Určete K[M] a aktivitu enzymu na základě kinetických měření. Použijte např. grafické vynesení podle Lineweaver-Burka. [S] (mol.l^-1) v[o](mmol.min^-1) 0,0003 0,026 0,001 0,054 0,002 0,070 9. Vypočítejte Michaelisovu konstantu a maximální rychlost reakce na základě kinetických měření. Použijte např. grafické vynesení podle Lineweaver-Burka. [S] (mol.l^-1) počáteční rychlost (nmol.s^-1) 1.10^‑4 0,45 5.10^‑4 2,3 2.10^‑3 5,3 4.10^‑3 6,5 10. Vypočítejte, jakou aktivitu (mmol/min) bude mít 2,5.10^‑4 mg zcela čistého enzymu o molek. hmotnosti 400 000, je‑li molekulární aktivita (číslo přeměny) 2500 s^‑1. 11. Vypočítejte molekulární aktivitu enzymu, jestliže 5.10^‑4 mg zcela čistého enzymu má aktivitu 20 mezinárodních jednotek. Molekulová hmostnost enzymu je 240000. VÝSLEDKY ÚLOH A. 1. a) Phe, Tyr, Try, His b) Cys, Met c) His, Lys, Arg d) Ala, Gly, Phe, Ser, Val, Asp, Glu, Cys, Tyr, Asn, Gln, Try, Leu, Ile, Met, Thr, Pro e) Gly, Ala, Leu, Ile, Val f) žádný asymetrický uhlíkový atom: Gly dva asymetrické uhlíkové atomy: Ile, Thr 2. 3. postupná disociace glycinu: A^+® A ® A^- K[1]=[A].[H^+]/[A^+] K[2]=[A^-].[H^+]/[A] Vztahy pro disociační konstanty se pak využijí k výpočtu procenta disociované formy (po dosazení za jednotlivé formy glycinu se [A] nakonec vykrátí): [A].100/([A^+]+[A]+[A^-])=79.9% disociované formy karboxylové skupiny při pH=3 [A].100/([A^+]+[A]+[A^-])=0.99% NH[3]^+ při pH 11 4. NH[2]-Thr-Gly-COOH; pI=6,385 (pro NH[2]-Gly-Thr-COOH by byl pI=6,115) 5. Přibližný náboj jednotlivých aminokyselin v peptidickém řetězci lze určit na základě disociačních konstant postranních skupin. Pokud je uvažované pH roztoku vyšší než hodnota pK[3 ]postranní -COOH skupiny, pak proběhne její disociace na -COO^-. Pokud je pH roztoku nižší než pK[3]postranní aminoskupiny, pak tato skupina přejde na formu -NH[3]^+. při pH=5: Arg^++-His^+-Gly^0-Phe^0-Gly^0-Glu^1--Lys^+-Tyr^0-Cys^0-Ala^1-, celkem 2+ při pH=9: Arg^1,5+-His^0-Gly^0-Phe^0-Gly^0-Glu^1--Lys^+-Tyr^0-Cys^1--Ala^1-, celkem 0-1- Z výše uvedeného vyplývá, že pI tohoto peptidu se nachází mírně pod pH=9. Hodnotu pI lze spočítat pouze přibližně, protože nemáme možnost brát v úvahu vliv sekundární struktury peptidu, vliv ostatních aminokyselinových zbytků na hodnoty disociačních konstant apod. Při porovnání disociačních konstant jednotlivých disociabilních skupin peptidu zjistíme, že nejvíce se pH9 přibližují: disociační konstanta argininu pK[2]=9,0 a disociační konstanta cysteinu pK[3]=8,3. Právě disociace -SH skupiny cysteinu bude hrát významnou úlohu ve změně náboje peptidu při hodnotách pH blízkých pI. Při poklesu pH pod 8,3 by se měl ztratit záporný náboj cysteinu a tím by měl peptid dosáhnout elektroneutrality. pI£8,3 Pokud je izoelektrický bod přibližným aritmetickým průměrem pK[A] neutrální formy, pak bude první uvažovanou disociací deprotonace cysteinu (pK[3]=8,3) při pH vyšším než pI a druhou reakcí bude protonace koncové skupiny o pK[a2]=7,9 při pH nižším než pI. Výsledný izoelektrický bod: pI=8,1. 6. disociabilní skupiny v peptidech A a B: A) Ser-NH[2](9,2), Tyr-OH(10,9), Glu-COOH(4,3), His-NH(6,0), Arg=NH(12,5), Gly-COOH(2,4) B) Val-NH[2](9,6), Cys-SH(8,3), Glu-COOH(4,3), Lys-NH[2](10,8), Gly-COOH(2,4) náboje při pH 9: A) Ser^1+‑Tyr^0‑Ser^0‑Met^0‑Glu^1-‑His^0‑Phe^0‑Arg^1+‑Gly^1- 0 B) Val^1+‑Cys^1-‑Phe^0‑Glu^1-‑Ala^0‑Lys^1+‑Leu^0‑Gln^0‑Gly^1- 1- náboje při pH 5: A) Ser^1+‑Tyr^0‑Ser^0‑Met^0‑Glu^1-‑His^1+‑Phe^0‑Arg^1+‑Gly^1- 1+ B) Val^1+‑Cys^0‑Phe^0‑Glu^1-‑Ala^0‑Lys^1+‑Leu^0‑Gln^0‑Gly^1- 0 Elektroforézu lze provést např. při pH=5. 7. Izoelektrické body: Gly(6,1), Ala(6,1), Glu(3,25) , Lys(10,0), Arg(10,75), Ser(5,65), Asp(2,95), Asn(5,4). Aminokyseliny mají v prostředí o vyšším pH než je jejich pI náboj záporný, při nižším pH náboj kladný. pH 3: anoda: Asp katoda: Arg, Lys, Ala, Gly, Ser, Asn, Glu (Glu a Asp mají izoelektrické body jen málo odlišné od 3, budou migrovat menší rychlostí než ostatní aminokyseliny) pH 7: anoda: Asp, Glu, Asn, Ser, Gly, Ala katoda: Arg, Lys (Gly a Ala budou díky svým izoelektrickým bodům migrovat pomaleji než ostatní aminokyseliny) 8. Izoelektrické body: Gly(6,1), Ala(6,1), Glu(3,25), Lys(10,0), Arg(10,75), Ser(5,65). Při pH=1 se díky svému kladnému náboji zachytí všechny. Při pH=6 se eluují Glu, Ser a také Gly, Ala, neboť jsou téměř v izoelektrickém bodě. 9. Izoelektrické body: Arg(10,75), Ala(6,1), Glu(3,25), Tyr(5,65), Ser(5,65) a) pH=11: Arg^0, Ala^1- , Glu^2- , Tyr^2- , Ser^1- (hodnota náboje určena na základě jednotlivých pKa). Vyteče Arg, ostatní aminokyseliny se zachytí na koloně. b) pH=8: Ala^1- , Glu^1- , Tyr^1- , Ser^1-. Žádná aminokyselina nevyteče. 10. Izoelektrické body: Glu(3,25), Ala(6,1), His(7,6), Lys(10), Tyr(5,65) Pořadí eluce: Glu, Tyr, Ala, His, Lys. 11. Izoelektrické body: Cys(5,05), Glu(3,25), Ser(5,65), Ala(6,1), Lys(10,0), His(7,6). Nezachytí se Lys, ostatní se zachytí. 12. a) disociabilní skupiny peptidu (I): Ala-NH[2](9,9), Glu-COOH(4,3), Tyr-OH(10,9), Lys-NH[2](10,8), Lys-COOH(2,2) disociabilní skupiny peptidu (II): Gly-NH[2](9,8), Asp-COOH(3,9), His-NH(6), Tyr-OH(10,9), Lys-NH[2](10,8), Lys-COOH(2,2) Podstatný rozdíl je v přítomnosti histidinu v peptidu(II) na rozdíl od peptidu(I). Pro dosažení kladného náboje histidinu zvolíme např. pH=5: Ala^1+‑Glu^1-‑Gly^0‑Tyr^0‑Lys^0 0 Gly^1+‑Asp^1-‑His^1+-Tyr^0‑Lys^0 1+ Peptid(II) se na katexu zachytí. b) disociabilní skupiny peptidu (III): Ser-NH[2](9,2), Tyr-OH(10,9), Glu-COOH(4,3), His-NH(6), Arg=NH(12,5), Gly-COOH(2,4) disociabilní skupiny peptidu (IV): Val-NH[2](9,6), Cys-SH(8,3), Glu-COOH(4,3), Lys-NH[2](10,8), Gly-COOH(2,4) Nemůžeme využít rozdílu v přítomnosti histidinu ke zvýšení náboje peptidu(III) o +1, neboť potřebujeme dělit anionty. Využijeme rozdílu disociačních konstant OH skupiny tyrosinu a SH skupiny cysteinu. Zvolíme pH=9: Ser^0-1+-Tyr^0-Met^0-Glu^1--His^0-Phe^0-Arg^1+-Gly^1- -1-0 Val^1+-Cys^1--Phe^0-Glu^1--Ala^0-Lys^1+-Leu^0-Gln^0-Gly^1- -1 Pokud je pK blízké zvolenému pH, pak je přibližně polovina molekul v disociovaném stavu a druhá polovina v nedisociovaném stavu. Peptid s nábojem -1 až 0 nakonec vyteče, neboť se postupně naprotonují všechny aminoskupiny serinu. Peptid s nábojem -1 se na anexu zachytí. 13. Izoelektrické body: Gly(6,1), Asp(2,95), Tyr(5,65), Ala(6,1), His(7,6), Arg(10,75) Pořadí eluce: 1.Asp, 2.Tyr , 3.Ala,Gly, 4.His, 5.Arg 14. NH[2]-Val‑Lys‑Pro‑Gly-COOH, popř. NH[2]-Val‑Lys‑Gly‑Pro-COOH 15. Po označení 2,4-dinitrofluorbenzenem a úplné hydrolýze získáme ve směsi (Ala+Lys+Glu+Gly) značený alanin a značený lysin, víme také o přítomnosti Glu a Gly. Alanin je tedy na N-konci. Trypsinovou hydrolýzou získáme dva dipeptidy, které rozdělíme iontoměničovou chromatografií při pH=5: NH[2]-Ala^1+-Lys^0-COOH +1 zachytí se na katexu NH[2]-Glu^0-Gly^1--COOH -1 vyteče z kolony Každý z těchto oddělených dipeptidů pak označíme 2,4-dinitrofluorbenzenem a hydrolyzujeme. První peptid poskytne značený alanin a lysin (NH[2]-Ala-Lys-?-?). Druhý peptid poskytne značenou kyselinu glutamovou. Výsledná sekvence je tedy: Ala-Lys-Glu-Gly. Určení sekvence peptidu lze rovněž provést v sekvenátoru za použití Edmanova odbourání (fenylisothiokyanátová metoda). Pro určování primární struktury peptidů lze využít i reakce s LiBH[4] (redukce -COOH skupiny na -CH[2]OH), nebo hydrazinolýzy (všechny aminokyseliny se objeví ve výsledné směsi jako hydrazidy, kromě C-koncové aminokyseliny). 16. a) merkaptoethanol: B-S-S-C ® B-SH + C-SH b) N-konce: Asp, Leu c) peptid B: ?-?-?-?-Phe-Ala (chymotrypsin) ?-?-Lys-?-Phe-Ala (trypsin) NH[2]-Leu-?-Lys-Cys-Phe-Ala-COOH (Sangerova metoda) d) peptid C: aminokyseliny připadající v úvahu: Asp, Lys(?), Cys (určitě, S-S můstek), Gly(?), Glu(?), Met(?)…jedna z aminokyselin(?) bude součástí peptidu B NH[2]-Asp-?-?-?-? bromkyan: NH[2]-Asp-?-?-Met-Glu-COOH trypsin: NH[2]-Asp-Cys-Lys-Met-Glu-COOH peptid B je tedy: NH[2]-Leu-Gly-Lys-Cys-Phe-Ala-COOH struktura peptidu P: (NH2-Asp-Cys-Lys-Met-Glu-COOH SS NH2-Leu-Gly-Lys-Cys-Phe-Ala-COOH) 17. a) cyklický peptid b) NH2-Cys-?-?-?-?-?-Tyr-COOH c) tripeptid: NH2-Glu-?-Lys-COOH tetrapeptid: NH2-Met-Tyr-?-Arg-COOH sekvence -Glu-Ala-Lys-Met-Tyr-Cys-Arg- 18. thermolysin hydrolyzuje před Leu, Phe, Trp, Tyr, Val označení aminokyselin ve štěpech po b-merkaptoethanolu: Asn^1-Cys^2-Phe^3-Thr^4-Lys^5-Lys^6-Trp^7-Cys^8-Arg^9-Ala^10-Val^11-Cys^12 Cys^13-Thr^14-Pro^15-Tyr^16-Cys^17-Phe^18-Pro^19-Cys^20 A) NH[2]-Val^11-Cys^12-Cys^2- Asn^1-COOH B) NH[2]-Phe^3-Thr^4-Lys^5-Lys^6-COOH C) NH[2]-Trp^7-Cys^8-Arg^9-Ala^10-COOH SS NH[2]-Tyr^16-Cys^17-COOH D) NH[2]-Phe^18-Pro^19-Cys^20-S-S-Cys^13-Thr^14-Pro^15-COOH disulfidické můstky mezi: Cys^2-Cys^12 Cys^8-Cys^17 Cys^13-Cys^20 NH[2]-Asn-Cys-Phe-Thr-Lys-Lys-Trp-Cys-Arg-Ala-Val-Cys-COOH NH[2]-Cys-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Pro-Cys-COOH 19. N-konec: Thr C-konec: Val-Ile-Leu-Lys-COOH hydrolýza chymotrypsinem: NH[2]-Phe-Asp-Val-Ile-Leu-Lys-COOH sekvence P: NH2-Thr-Glu-Phe-Asp-Val-Ile-Leu-Lys-COOH náboj při pH=6,5: Thr^1+-Glu^1--Phe^0-Asp^1--Val^0-Ile^0-Leu^0-Lys^0, celkově 1- Pokud by byla Glu nahrazena Gln a Asp nahrazena Asn, tak by měl peptid při pH=6,5 náboj 1+, což by nebylo v souladu s podmínkami v zadání úlohy. 20. možné úseky a-šroubovice označeny silně: ‑ Leu‑Ala‑His‑Thr‑Tyr‑Gly‑Pro‑Phe‑Glu‑Ala‑Ala‑Met‑Cys‑His‑ ‑Glu‑Glu‑Asp‑Pro‑Asp‑Gly‑Met‑Gly‑Cys‑Ala‑Phe‑His‑ při poklesu pH pod disociační konstanty karboxylových kyselin: ‑ Leu‑Ala‑His‑Thr‑Tyr‑Gly‑Pro‑Phe‑Glu‑Ala‑Ala‑Met‑Cys‑His‑ ‑Glu‑Glu‑Asp‑Pro‑Asp‑Gly‑Met‑Gly‑Cys‑Ala‑Phe‑His‑ Přesné určení sekundární struktury bílkoviny je úkolem pro počítačové modelování. 21. NH[2]-Ala-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Phe-COOH 22. Protein má poměrně hodně hydrofobních skupin, díky kterým může dobře kotvit v cytoplasmatické membráně. K určení sekundární struktury by mohla být využita statistická metoda P.Choua a G.Fasmana (1974). Prvním krokem je simultánní hledání "zárodků" tvorby a- a b-struktur. Tvoří je úseky (penta- až hexapeptidy) obsahující minimálně čtyři (u b-struktur tři) zbytky s velkou tendencí tvořit příslušný typ pravidelné sekundární struktury. Největší snahu tvořit a-helix mají methionin, glutamát, leucin a alanin, v b-strukturách se vyskytují hlavně valin, isoleucin, fenylalanin a tyrosin. V dalším kroku se "zárodky" rozšiřují na obě strany, dokud průměrný sklon tetrapeptidu k vytváření a-, resp. b-struktury neklesne pod kritickou hodnotu. Posléze se vyhledají oblasti protisměrných ohybů, obsahující především glycin a prolin. Silně vyznačený úsek bude mít tendenci tvořit a-helix: Met-Ala-(Leu-Phe-Ala)[3]-(Leu-Met-Phe)[3]-Pro-Ans-Gly-Met-Leu-Phe Při nahrazení Leu zbytkem Asp se sníží hydrofobnost proteinu, zřejmě se také sníží schopnost tvořit a-helix. 23. b,c,d 24. a) a-šroubovice: 153.0,15 = 22,95nm = 23nm b-skládaný list: 153.0,36= 55,08nm = 55,1nm b) a+b=153 a.0,15+b.0,36=42nm a=62 zbytků tvoří a-šroubovici b=91 zbytků tvoří b-skládaný list 25. počet aminokyselin=(0,2.10^9nm)/0,15nm= 1,3333.10^9 rychlost syntézy=1,3333.10^9/(365.24.3600)=42,3 zbytků/sec 26. hmotnost ribozomálních proteinů=25000.(4/3).p.(9.10^-7cm)^3.1g/cm^3.0,4 = 3,0536.10^-14g délka b-šroubovice=(3,0536.10^-14/120).6,023.10^23.0,36=5,5176.10^7nm=0,055m délka jednoho ovinutí=p.1=3,1416mm=3141,6nm počet ovinutí=5,5176.10^7/3141,6=1,76.10^4 krát 27. V=p.0,7^2.280=431,027nm^3=4,3103.10^-19cm^3 m=3.1000.120/(6,023.10^23)=5,9771.10^-19g r=m/V=5,9771.10^-19g/4,3103.10^-19cm^3=1,39 g/cm^3 28. a)7, b)1, c)3, d)2 B. 1d 2b 3d 5. 1‑O‑methylglukosa;1,2,3,4,6‑penta‑O‑methylgalaktosa; 2,3,4,6‑tetra‑O‑methylgalaktosa 6. glucitol, kys. mannonová, kys. mannarová 7. 2,3,4,6‑tetra‑O‑methylgalaktopyranosa, 2,3,6‑tri‑O‑methylglukopyranosa 9. 2,4,6-tri-O-methyl -D-glukopyranosa, 2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-mannopyranosa 10. 2,3,4-tri-O-methyl-D-glukopyranosa, 2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-galaktopyranosa 11. 5-O-galaktosyl-D-ribofuranosa 12. 4-O-galaktosyl-D-fruktofuranosa D-glukopyranosyl-D-mannopyranosid uronát 13. 1,4,6-tri-O-methyl-D-fruktosa, 2,3,4,6-tetra-O-methylmannopyranosa C 1.b)estery 2.d) 4. Pro disociaci první volné –OH skupiny fosfolipidu platí pKa=6,8, pokud je přítomna i poslední –OH skupina v disociovatelné formě, odpovídá její disociační konstanta pK[3]=12,3. a)1-, b)0, c) 0, d) 1-, e) 2-, f) 2-, g) 1- 6. pH 5: a)O, b)1+, c)1+, d)0, e)0, f)0, g)0. pH 8: a)1‑, b)0, c)0, d)1-, e)2-,f)2‑,g)1‑. 7. a)1-palmitoyl-2-oleylfosfatidylcholin+tetrabutylamonium hydroxid= glycerolfosfocholin glycerolfosfocholin+2 palmitoylchlorid= dipalmitoylfosfatidylcholin b) 1-palmitoyl-2-oleylfosfatidylcholin+fosfolipáza A[2]= 1-palmitoylfosfatidylcholin 1-palmitoylfosfatidylcholin+ stearoylchlorid=1-palmitoyl-2-stearoylfosfatidylcholin c)1-palmitoyl-2-oleylfosfatidylcholin+ tetrabutylamonium hydroxid= glycerolfosfocholin glycerolfosfocholin+ stearoylchlorid=distearoylfosfatidylcholin distearoylfosfatidylcholin+ fosfolipáza D=distearoylfosfatidová kyselina distearoylfosfatidová kyselina+ethanolamin=distearoylfosfatidylethanolamin D 2. A[260]=[AMP][ ]× e[260](AMP) + [GMP][ ]× e[260](GMP) A[280]=[AMP][ ]× e[280](AMP) + [GMP][ ]× e[280](GMP) [GMP]=3,07.10^-5 mol/l, [AMP]=1,90.10^-5 mol/l 4. RNA 321, DNA 309 5. a/ UpCpUpApGpA b/ Up+ CpUpApGpAp, Up+Cp+UpApGpAp, Up+Cp+Up+ApGpAp atd. c/ UpCpUpApG+pAp, UpCpUpA+pG+pAp, UpCpU+pA+pG+pAp atd. d/ UpCpUpA+pGpAp e/ UpCpU+pA+pG+pAp 6. fosfodiesteráza hadího jedu: ^32pApCpTpTpA+pG, ^32pApCpTpT+pA+pG,^ 32pApCpT+pT+pA+pG, ^32pApC+pT+pT+pA+pG (poslední dinukleotid nechá nerozštěpený) desoxyribonukleáza II: ^32pAp+CpTpTpApG, ^32pApCp+TpTpApG, ^32pApCpTp+TpApG, ^32pApCpTpTp+ApG,^32pApCpTpTpAp+G a další 8. a) pC…je na volném 3´ konci RNA b) pankreatická ribonukleáza rozštěpí polynukleotid (psáno od 5´konce k 3´konci) za U a C možnosti: ACAGUC ACGAUC GAUACC AGUACC c) A bude na začátku možnosti: AGCAUC…vyřazeno z důvodů b) ACGAUC AGCACU…nesplňuje podmínku a) ACGACU…nesplňuje podmínku a) řešení:(pApCpGpApUpC) 8. (-ATAGGCTTAGTACCA-) E 1. +7,55 kJ.mol^-1, ‑2,85 kJ.mol^-1 2. a) ‑30,5 kJ.mol^-1, b) ‑47,6 kJ.mol^-1, c) ‑53,3 kJ.mol^-1 3. ‑25,7 kJ.mol^-1, 7,2.10^5 mol.l^-1 4. 3,5 mmol.l^-1 5. +31,3 kJ.mol^-1, 3,08.10^4 6. +0,8 kJ.mol^-1, ‑32,6 kJ.mol^-1 Hydrolýza difosfátu usnadňuje průběh reakce zleva doprava, posunuje rovnováhu směrem k produktům. 7. +8,4 kJ.mol^-1, 0,034, +4,41 kJ.mol^-1 8. DG^0’=12,5 kJ.mol^-1, 6,42.10^‑3 9. DG^0’= -9,6 kJ.mol^-1, 1,04.10^‑3 10. DG^0’(1)=-29,25 J.mol^-1, DG^0=-8,35 J.mol^-1, DG=241 J.mol^-1 Glykosidovou vazbu sacharosy lze dle standartní volné energie hydrolýzy považovat za makroergickou vazbu, ale sacharosa se nepovažuje za makroergickou sloučeninu. 11. DG^0’(1)= -16,3 kJ.mol^-1 DG^0’= -DG^0(1)+ +DG^0(2)+DG^0(3)-DG^0(4) DG^0’= -1,7 kJ.mol^-1 Za podmínek zadaných koncentrací je DG’= -27,1 kJ.mol^-1 12. DG^0’(1)= -1,7 kJ.mol^-1 DG^0’(spřažená reakce)= -16,3 kJ.mol^-1 F 1b 2. a-oxidoredutasa triviálně malátdehydrogenasa systematicky malát :NAD^+-oxidoreduktasa (u reakcí s NADH jako donorem, či NAD^+ jako akceptorem se upřednostňuje systematický název donor:NAD^+-oxidoreduktasa, a ne NADH:akceptor-oxidoreduktasa) b-transferasa triviálně alaninaminotransferasa systematicky L-alanin:2-oxoglutarát-aminotransferasa jiný název glutamát-pyruvát transaminasa c-hydrolasa triviálně exoamylasa nebo b-amylasa systematicky 1,4-a-D-glukan-maltohydrolasa jiné názvy glykogenasa nebo sacharogenamylasa d- oxidoreduktasa triviálně methanoldehydrogenasa systematicky methanol:NAD^+-oxidoreduktasa jiný název formaldehydreduktasa e-transferasa triviálně hexokinasa systematicky ATP:fruktosa-fosfotransferasa f-hydrolasa triviálně ureasa systematicky močovina-amidohydrolasa g-izomerasa triviálně fosfoglukomutasa systematicky a-D-glukosa-1,6-fosfomutasa jiný název glukosafosfomutasa h-ligasa (syntetasa) triviálně D-alanin-D-alanin ligasa systematicky D-alanin:D-alanin-ligasa (tvořící ADP) jiný název D-alanylalanin syntetasa 3. glukokinasa: v=1,5×10^-6×[S]/([S]+10×10^-3) hexokinasa: v=0,1×10^-6×[S]/([S]+0,1×10^-3) mmol.min-1: a) 0,015, 0,05; b) 0,136, 0,0909; c) 0,50, 0,098; d) 1,125, 0,0997 Hexokinasa je při nízkých koncentracích glukosy mnohem výkonnější než glukokinasa, což jí umožňuje zásobovat mozek glukosa-6-fosfátem pro anaerobní glykolýzu i při poklesu hladiny glukosy v krvi. Tím je mozek chráněn proti náhlému nedostatku energie. Glukokinasa v játrech se podílí na regulaci glukosy v krvi tím, že ji při vysokých koncentracích intenzivně převádí na glukosa-6-fosfát jako výchozí sloučeninu pro syntézu glykogenu. 4. 0,00488 mmol.min^-1 5. K[M]=9,009×10^-6 mol l^-1, v[lim]=45,045 mmol.min^-1 6. kompetitivní inhibici lze zrušit přebytkem substrátu 7. K[M]=1,17 mmol.l^-1, v[lim] =0,586 mmol.min^-1 8. K[M] = 0,85 mmol.l^-1, v[lim] = 0,100 mmol.min^-1 9. K[M] = 1,76mmol.l^-1, v[lim] = 9,52 nmol.s^-1 10. látkové množství enzymu: 6,25×10^-13 mol aktivita=6,25×10^-13×2500=1,56nkat=0,0936 mmol.min^-1 11. látkové množství enzymu: 2,0833×10^-12 mol číslo přeměny=20×10^-6/(60×2,0833×10^-12)=160 000 s^-1