Dvoudimenzionální elektroforéza Hana Konečná CENTRÁLNÍ LABORATOŘ - PROTEOMIKA CEITEC – Středoevropský technologický institut NCBR – Národní centrum pro výzkum biomolekul PřF proteinový vzorek komplexní směs peptidů komplexní proteinový vzorek jednoduchý směs peptidů jednoduchá databáze identifikace kvantifikace 2D GE proteinové čipy multiD-LC MS MS/MS charakterizace modifikace shotgun ! proteinový vzorek komplexní směs peptidů komplexní proteinový vzorek jednoduchý směs peptidů jednoduchá databáze identifikace kvantifikace 2D GE proteinové čipy multiD-LC MS MS/MS charakterizace modifikace shotgun I. SEPARACE II. PREFRAKCIONACE Dvoudimenzionální elektroforéza 2-DE ? Proteomický experiment extrakce fokusace SDS-PAGE digest MS identifikace neznámý protein HOMOGENIZACE • mechanicky • ultrazvukem • tlakem • zmražením / rozmražením • detergentovou lyzí PŘÍPRAVA VZORKU solubilizace močovina, thiomočovina, detergenty redukce DTT, TBP inhibice proteáz, fosfatáz, glykosyláz odstranění kontaminant MĚŘENÍ KONCENTRACE PROTEINU lyzační pufr vs. hydratační pufr !  žádný celkový náboj  0.5 – 4%  použitelné ve vysokých koncentracích močoviny  neionogenní  zwitterointové  SDS jen v nízkých koncentracích (do 0.25%) DETERGENTY ! ZÁKLADNÍ PRAVIDLA  zabránit proteolýze  jednoduchý postup  čerstvé reagencie  čerstvý vzorek  odstranit pevné částice - centrifugace  odstranit kontaminanty KONTAMINANTY  soli, zbytky pufrů  malé endogenní molekuly  iontové detergenty  nukleové kyseliny  polysacharidy  lipidy  fenolické látky 2-DE • první rozměr • druhý rozměr IEF SDS-PAGE 1. ROZMĚR IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE migrace nabitých částic v gradientu pH v elektrickém poli IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE • imobilizovaný pH gradient • amfolyty + + + - - - ROZSAH STRIPU ROZMĚR STRIPU ! ROZSAH STRIPU denaturace SDS  redukce DTT  alkylace IAA  EKVILIBRACE STRIPU ! 2. ROZMĚR SDS-PAGE migrace aniontů v elektrickém poli podle MW ! STRIP GEL + - + FOKUSACE SDS-PAGE - ekvilibrace orientace gelu KYSELEJŠÍ pI ALKALIČTĚJŠÍ VYŠŠÍ MW NIŽŠÍ ! 2-DE INSTRUMENTACE  Protean IEF  Protean Dodeca Cell  Densitometer GS-800  FLA-7000, STORM PDQuest, Quantity One Protean Plus Dodeca Cell Mini-Protean 3 Dodeca Cell Protean II xi Cell DETEKCE PROTEINU • gel x blot • visualizace barvení radioaktivita imunodetekce • barvení v gelu  po elektroforéze  před elektroforézou  specifické pro protein  specifické pro PTM  viditelné spektrum  fluorescence Sypro Ruby Coomassie silver 1.4 ng 36 ng 0.6 ng DETEKCE PROTEINU V GELU PTM specifická barvení Pro-Q Diamond Pro-Q Emerald BARVENÍ PROTEINU – LINEARITA Sypro Ruby Ag Sypro Ruby • kvalitativní • kvantitativní ANALÝZA OBRAZU biologické replikáty technické replikáty biologická variabilita technická variabilita stejný organismus za stejných podmínek stejný vzorek stejně 2D or not 2D ?  vizuální aspekty  reprodukovatelnost  dynamický rozsah  extrémní proteiny (membránové,basické...)  nesnadná automatizace  postdigesční extrakce MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE  velké objemy vzorku  možnost koncentrace na koloně  membránové proteiny, basické proteiny  není nutno barvit  peptidy – přímo na MS  automatizace  vizuální aspekty ztraceny: pI a Mr  LC - sériová analýza  GE současně pro více vzorků PROTI PRO Difference Gel Electrophoresis DIGE BIOMARKERY … jehly v kupce sena prefrakcionace ▪ separace ▪ identifikace ▪ srovnání kontrola vs.vzorek • seno - proteiny bez vztahu k onemocnění • jehly - specifické proteiny pro onemocnění • potenciální jehly obtížně validovatelné biologická variabilita! • které jehly dále zkoumat? • často PTM, neidentifikovány MS Den 21 – před klinickým projevem Den 44 – po klinickém projevu Biomarkery v lidské plasmě separace identifikace DIGESCE • IN-GEL • IN-SOLUTIONtrypsin Glu-C Asp-N thermolysin MAVEPFPRRPITRPHASIEVDTSGTGGSAGSSE KVFCLIGQAEGGEPNTVYELRNYAQAKRLFRS GELLDAIELAWGSNPNYTAGRILAMRIEDAKP ASAEIGGLKITSKIYGNVANNIQVGLEKNTLSD SLRLRVIFQDDRFNEVYDNIGNIFTIKYKGEEA NATFSVEHDEETQKASRLVLKVGDQEVKSYD LTGGAYDYTNAIITDINQLPDFEAKLSPFGDKN LESSKLDKIENANIKDKAVYVKAVFGDLEKQT AYNGIVSFEQLNAEGEVPSNVEVEAGEESATV TATSPIKTIEPFELTKLKGGTNGEPPATWADKL DKFAHEGGYYIVPLSSKQSVHAEVASFVKERS DAGEPMRAIVGGGFNESKEQLFGRQASLSNPR VSLVANSGTFVMDDGRKNHVPAYMVAVALGG LASGLEIGESITFKPLRVSSLDQIYESIDLDELN ENGIISIEFVRNRTNTFFRIVDDVTTFNDKSDPV KAEMAVGEANDFLVSELKVQLEDQFIGTRTIN TSASIIKDFIQSYLGRKKRDNEIQDFPAEDVQVI VEGNEARISMTVYPIRSFKKISVSLVYKQQTLQ A MS G I G O GARBAGE IN - GARBAGE OUT G I G O • R.M. Twyman: Principles of Proteomics • R.Westermeier, T.Naven, H-R Höpker: Proteomics in Practice • A.J.Link: 2D Proteome Analysis Protocols • Current Protocols in Protein Science • R.J.Simpson: Proteins and Proteomics • T.Rabilloud: Proteome Research: Two-dimensional Gel • Electrophoresis and Identification Methods • A. Görg, W. Weiss, M.J.Dunn: Proteomics 2004, 4, 3665, rev. • I. Miller, J. Crawford, E. Gianazza: Proteomics 2006, 6, rev. • F.Chevalier: Proteome Science 2010, 8:23, review • R. Burgess, M. Deutscher: Guide to Protein Purification LITERATURA I. SEPARACE II. PREFRAKCIONACE GENOM PROTEOM IZOFORMY PTM asi 200 typů (fosforylace, glykosylace, acylace, methylace…) KONCENTRAČNÍ ROZSAH asi deset řádů PREFRAKCIONACE MS 10 000km 100km 10km 10cm 1 000km 1km 100m 10m 1m 1cm Abundantní proteiny v lidské plazmě odstranění abundantních proteinů afinitní chromatografií HSA IgG AFINITNÍ DEPLECE Apolipoprotein Immunoglobulin kappa light chain Immunoglobulin light chain albumin Lidská plazma - vázaná frakce po afinitní depleci ALBUMIN IgG Barvení: CB G-250 CPPL Combinatorial Peptide Ligand Library PROTEOMINERPREFRAKCIONACE PREFRAKCIONACE MicroRotofor OffGel Fractionator IEF • prefrakcionace v roztoku • prefrakcionace v roztoku na IPG stripu offgel pivo 70 proteinů OFFGEL IEF prefrakcionace proteinů nebo peptidů digest směsi proteinů IEF směsi peptidů na IPG stripu frakce stripu IPG-IEF SDS 8M Urea Peptides DTT IAA spin spin spin incubation spin proteins nucleic acids Lysate 8M Urea Ammonium Trypsin SDS DTT IAA bicarbonate PROTEINS PEPTIDES Nature Methods 6, 359 - 362 (2009) Filter Aided Sample Preparation FASPFASP Filter aided sample preparation PREFRAKCIONACE MIKRO ROZSAHY pI GELOVÁ CHROMATOGRAFIE INSPIRATIVNÍ LITERATURA PRO MÍRNĚ POKROČILÉ Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: A tutorial Thierry Rabilloud et al. Journal of Proteomics 2011 Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: past, present and future Thierry Rabilloud et al. Journal of Proteomics 2010 Proteomic biomarker discovery: It's more than just mass spectrometry Josip Blonder et al. Electrophoresis 2011 Basics and recent advances of two dimensional – polyacrylamide gel electrophoresis Sameh Magdeldin et al. Clinical Proteomics 2014 For all the complex problems and difficult questions there is always one simple, easily comprehensible w r o n g answer.