ExpreseExprese aa purifikacepurifikace
rekombinantnrekombinantnííchch
proteinproteinůů
Radka Dopitová
RekombinantnRekombinantníí proteinyproteiny
Rekombinantní DNA je arteficiální DNA sekvence, která vznikla
novou kombinací různých DNA sekvencí.
Rekombinantní proteiny jsou proteiny získané vnesením
rekombinantní DNA do heterologního hostitele (např.
mikroorganismus, kvasinky), ve kterém dojde k expresi genu.
VyuVyužžititíí rekombinantnrekombinantnííchch proteinproteinůů
Nadprodukce a purifikace rekombinantních proteinů jsou nezbytným
předpokladem pro:
• Biochemickou funkční charakteristiku proteinu (určení přesných
kinetických parametrů Km, kcat pro enzymy se substrátem, Ki pro enzymy s
inhibitorem, Kd pro protein - proteinové interakce či ligand -proteinové
interakce)
• Strukturní analýzu (NMR, krystalografie)
• Proteinové inženýrství (zlepšení vlastnosti proteinů – aktivita, stabilita)
• V průmyslovém měřítku jsou produkovány léky, vakcíny a potravinové
doplňky.
CCííl:l: Vysoký výtěžek homogenního proteinu (mg – kg proteinu)
Zachování biologické aktivity
ProPročč vyrvyráábběětt rekombinantnrekombinantníí proteiny?proteiny?
• Obtížně se získavá (tkáně, orgány).
• Obtížně se kultivuje (bakterie, viry, tkáňové kultury).
• Limitovaná exprese
• Často obtížná purifikace proteinu
Přirozený zdroj:
TechnologieTechnologie rekombinantnrekombinantnííchch proteinproteinůů
Hostitelský organismus pro expresiHostitelský organismus pro expresi
rekombinantnrekombinantnííchch proteinproteinůů
• Bakterie
• Kvasinky
• Rostliny
• Savčí buňky
• Hmyzí buňky s bakuloviry
• Transgenní živočichové
• Exprese proteinu in vitro
1. část: Exprese rekombinantních proteinů v E.coli
2. část: Purifikace rekombinantních proteinů
Obsah pObsah přřednednášáškyky
Exprese proteinů fúzovaných s
GFP v E. coli
Purifikace proteinů fúzovaných s GFP
pomocí hydrofóbní matrice
Produkce heterologních proteinů v E. Coli
VÝHODY :
• Vysoká produkce rekombinantních proteinů
• Dobře prostudovaný genom a proteom-usnadnění
genových manipulací
• Design řady vektorů usnadňuje klonování a expresi cizích genů
• Rychlý růst v poměrně levném médiu
• Přizpůsobivost systému
NEVÝHODY:
• Potřeba cDNA zkoumaného proteinu
• Absence eukaryotických posttranslačních systémů
(posttranslační modifikace)
• Tvorba nerozpustných inkluzních tělísek
• Omezená schopnost tvorby disulfidických vazeb
• Chybí sekreční mechanismus pro účinné uvolňování proteinu
do kultivačního média
Produkce heterologních proteinů v E. Coli
ExpresnExpresníí systsystéém pro produkcim pro produkci
rekombinantnrekombinantnííchch proteinproteinůů vv E.E.colicoli
Hostitelský
kmen
Podmínky
kultivace
Vektor
ExpresnExpresníí vektorvektor
= klonovací vektor, který obsahuje nezbytné regulační sekvence k
tomu, aby podporoval expresi inzertů cizích genů.
KlonovacKlonovacíí mmíístosto
FFúúznzníí/purifika/purifikaččnníí
znaznaččky/kotvyky/kotvy
Gen pro rezistenciGen pro rezistenci
k antibiotiku (k antibiotiku (ampicilinampicilin))
RibozomRibozom--vazebnvazebnéé mmíístosto
OperOperáátortor --
vazebnvazebnéé mmíísto prosto pro represorrepresor
Transkripční
terminátor
StrukturaStruktura vektoruvektoru propro úúččinnou expresiinnou expresi rekombinantnrekombinantnííchch proteinproteinůů vv E.E.colicoli
promotorpromotor
OperOperáátortor --
vazebnvazebnéé mmíísto prosto pro represorrepresor
StrukturaStruktura vektoruvektoru propro úúččinnou expresiinnou expresi rekombinantnrekombinantnííchch proteinproteinůů vv E.E.colicoli
promotorpromotor
VlastnostiVlastnosti promotorpromotoru:u:
•• Silný promotorSilný promotor (ptac, ptrp, λpL, pT7 )
- Protein zájmu by měl tvořit 10-30% a více z celkového bakteriálního
proteinu.
•• PPřřenositelný do renositelný do růůzných kmenzných kmenůů E.E.colicoli
•• Vykazuje minimVykazuje minimáálnlníí hladinu bazhladinu bazáálnlníí expreseexprese
- Pokud jsou proteiny netoxické dosahuje se vysokých výtěžků proteinů
růstem buněk do vysokých hustot s následnou indukcí aktivity promotoru.
- U toxických proteinů pro je nutná minimalizace bazální transkripce před
přídavkem indukčního činidla pomocí vhodného represoru.
•• JednoduJednodušše a levne a levněě inducibilninducibilníí
- Teplotní indukce (λpL)
- Chemická indukce (ptac, ptrp, pT7): IPTG (isopropyl-β-D-
thiogalaktopyranozid)
RibozomRibozom--vazebnvazebnéé mmíístosto
Transkripční
terminátor
StrukturaStruktura vektoruvektoru propro úúččinnou expresiinnou expresi rekombinantnrekombinantnííchch proteinproteinůů vv E.E.colicoli
StrukturaStruktura vektoruvektoru propro úúččinnou expresiinnou expresi rekombinantnrekombinantnííchch proteinproteinůů vv E.E.colicoli
RibozomRibozom--vazebnvazebnéé mmíístosto: zahrnuje Shine-Dalgarnova (SD) sekvenci a
translační iniciační kodon
Vzdálenost mezi SD sekvencí a iniciačním kodonem AUG je 4-13 nukleotidů,
tato vzdálenost ovlivňuje účinnost iniciace translace (optimální vzdálenost je
4-8 nukleotidů), oblast bohatá na AT páry.
TranskripTranskripččnníí termintermináátortor T7 term, rrnT1,T2
(zabraňuje okluzi promotoru, zvyšuje stabilitu mRNA)
VýbVýběěr hostitelskr hostitelskéého kmeneho kmene E.E.colicoli
Hostitelský
kmen
Podmínky
kultivace
Vektor
ExpreseExprese rekombinantnrekombinantnííhoho proteinu v hostitelskproteinu v hostitelskéém kmenim kmeni E.E. colicoli
BL21(DE3)
ToxicitaToxicita rekombinantnrekombinantnííhoho proteinu pro hostitelský kmenproteinu pro hostitelský kmen
• Není omezena na pouhý fakt, že je protein je pro buňku cizí, ale
může být způsobena i tím, že je nadprodukován určitý nativní gen.
Pro hostitele jsou smrtelnPro hostitele jsou smrtelnéé::
• Rekombinantní proteiny s hydrofóbními oblastmi mají toxický
účinek - asociují s membránou nebo se inkorporují do membránového
systému buňky (porušení membránového potenciálu).
• Proteiny, které inaktivují ribozomy.
VýbVýběěr hostitelskr hostitelskéého kmeneho kmene E.E.colicoli s ohledems ohledem
na toxicitu proteinu pro hostitelena toxicitu proteinu pro hostitele
BL21(DE3) firma Novagen
BL21(DE3)pLysS firma Novagen
Komerčně dostupné bakteriální kmeny s různými úrovněmi regulace
exprese, zajišťujícími minimalizaci bazální exprese.
• Nutná přísná regulace expresního systému
RRůůznznéé úúrovnrovněě minimalizace bazminimalizace bazáálnlníí expreseexprese
BL21(DE3)BL21(DE3)
BL21(DE3)pLysS/E
BL21
Cca 10 % hladina bazální exprese (před indukcí exprese) klonovaného
genu.
BL21(DE3)
BL21(DE3)BL21(DE3)pLysSpLysS/E/E
BL21
Cca 1-3% hladina bazální (před indukcí exprese) exprese klonovaného
genu.
RRůůznznéé úúrovnrovněě minimalizace bazminimalizace bazáálnlníí expreseexprese
• Expresní kmen obsahující plazmidy pLysS nebo pLysE umožňující přísnou regulaci
expresního systému využívající T7 promotor. Tyto plazmidy kódují lysozym, který se
váže na T7 RNA polymerasu a inaktivuje ji a minimalizuje se tak bazální exprese.
BL21(DE3)
BL21(DE3)pLysS/E
BL21BL21
• Indukce exprese infekcí bakteriofágem CEG (gen pro T7 RNA
polymerasu)
RRůůznznéé úúrovnrovněě minimalizace bazminimalizace bazáálnlníí expreseexprese
Nejvyšší úroveň represe!!
Arabidopsis thaliana [gbpln]: 80395 CDS's (31098475 codons)
fields: [triplet] [frequency: per thousand] ([number])
UUU 21.8(678320) UCU 25.2(782818) UAU 14.6(455089) UGU 10.5(327640)
UUC 20.7(642407) UCC 11.2(348173) UAC 13.7(427132) UGC 7.2(222769)
UUA 12.7(394867) UCA 18.3(568570) UAA 0.9( 29405) UGA 1.2( 36260)
UUG 20.9(649150) UCG 9.3(290158) UAG 0.5( 16417) UGG 12.5(388049)
CUU 24.1(750114) CCU 18.7(580962) CAU 13.8(428694) CGU 9.0(280392)
CUC 16.1(500524) CCC 5.3(165252) CAC 8.7(271155) CGC 3.8(117543)
CUA 9.9(307000) CCA 16.1(502101) CAA 19.4(604800) CGA 6.3(195736)
CUG 9.8(305822) CCG 8.6(268115) CAG 15.2(473809) CGG 4.9(151572)
AUU 21.5(668227) ACU 17.5(544807) AAU 22.3(693344) AGU 14.0(435738)
AUC 18.5(576287) ACC 10.3(321640) AAC 20.9(650826) AGC 11.3(352568)
AUA 12.6(391867) ACA 15.7(487161) AAA 30.8(957374) AGA 19.0(589788)
AUG 24.5(762852) ACG 7.7(240652) AAG 32.7(1016176) AGG 11.0(340922)
GUU 27.2(847061) GCU 28.3(880808) GAU 36.6(1139637) GGU 22.2(689891)
GUC 12.8(397008) GCC 10.3(321500) GAC 17.2(535668) GGC 9.2(284681)
GUA 9.9(308605) GCA 17.5(543180) GAA 34.3(1068012) GGA 24.2(751489)
GUG 17.4(539873) GCG 9.0(280804) GAG 32.2(1002594) GGG 10.2(316620)
Coding GC 44.59% 1st letter GC 50.84% 2nd letter GC 40.54% 3rd letter GC 42.38%
Escherichia coli K12 [gbbct]: 14 CDS's (5122 codons)
fields: [triplet] [frequency: per thousand] ([number])
UUU 19.7( 101) UCU 5.7( 29) UAU 16.8( 86) UGU 5.9( 30)
UUC 15.0( 77) UCC 5.5( 28) UAC 14.6( 75) UGC 8.0( 41)
UUA 15.2( 78) UCA 7.8( 40) UAA 1.8( 9) UGA 1.0( 5)
UUG 11.9( 61) UCG 8.0( 41) UAG 0.0( 0) UGG 10.7( 55)
CUU 11.9( 61) CCU 8.4( 43) CAU 15.8( 81) CGU 21.1( 108)
CUC 10.5( 54) CCC 6.4( 33) CAC 13.1( 67) CGC 26.0( 133)
CUA 5.3( 27) CCA 6.6( 34) CAA 12.1( 62) CGA 4.3( 22)
CUG 46.9( 240) CCG 26.7( 137) CAG 27.7( 142) CGG 4.1( 21)
AUU 30.5( 156) ACU 8.0( 41) AAU 21.9( 112) AGU 7.2( 37)
AUC 18.2( 93) ACC 22.8( 117) AAC 24.4( 125) AGC 16.6( 85)
AUA 3.7( 19) ACA 6.4( 33) AAA 33.2( 170) AGA 1.4( 7)
AUG 24.8( 127) ACG 11.5( 59) AAG 12.1( 62) AGG 1.6( 8)
GUU 16.8( 86) GCU 10.7( 55) GAU 37.9( 194) GGU 21.3( 109)
GUC 11.7( 60) GCC 31.6( 162) GAC 20.5( 105) GGC 33.4( 171)
GUA 11.5( 59) GCA 21.1( 108) GAA 43.7( 224) GGA 9.2( 47)
GUG 26.4( 135) GCG 38.5( 197) GAG 18.4( 94) GGG 8.6( 44)
Coding GC 52.35% 1st letter GC 60.82% 2nd letter GC 40.61% 3rd letter GC 55.62%
VyuVyužžíívváánníí kodonkodonůů E.E.colicoli ((codoncodon usageusage))
• Geny u prokaryot a eukaryot se vyznačují nenáhodným využíváním synonymních
kodonů.
• Kodony zřídka využívané u E. Coli se mohou hojně vyskytovat u heterologních genů
pocházejících z eukaryot, archebakterií aj.
• Frekvence využití synonymních kodonů obvykle odráží zastoupení jejich tRNA v
cytoplazmě.
http://www.kazusa.or.ip/codon/
MMáálo preferovanlo preferovanéé kodonykodony uu E.E.colicoli
Exprese heterologní genů obsahujících málo preferované kodony vede k translačním
chybách !
• Předčasné ukončení translace (zkrácený produkt)
• Posunutí čtecího rámce (posun až o 2 AK v místě kodonu AGA)
• Záměna aminokyseliny - často arginin (kodon AGA) za lyzin
Makrides, 1996
VýbVýběěr hostitelskr hostitelskéého kmeneho kmene E.E.colicoli
•BL21 (DE3)
CodonPlus-RIL
•AGG/AGA (arginine,R), AUA
(isoleucine, I) and CUA (leucine, L)
firma Stratagene
•BL21 (DE3)
CodonPlus-RP
•AGG/AGA (arginine, R) and CCC
(proline, P)
firma Stratagene
•Rosetta or
Rosetta (DE3)
•AGG/AGA (arginine, R), CGG
(arginine, R), AUA (isoleucine, I)
CUA (leucine, L)CCC (proline), and
GGA (glycine, G)
firma Novagen
• Pro produkci genPro produkci genůů obsahujobsahujííccíí velkvelkéé mnomnožžstvstvíí kodonkodonůů, kter, kteréé jsou mjsou máálolo
vyuvyužžíívanvanéé E.E.colicoli, je možné použít komerčně dodávané kmeny, které produkují
tRNA málo užívaných kodonů.
NEBO: Místně řízená mutageneze - záměna málo využívaného kodonu.
Plasmidy komplementující tRNA.
OptimalizaceOptimalizace kodonkodonůů –– syntsyntééza genza genůů
Optimální složení kodonů pro produkci v jednom či více organismech s ohledem na vznik
sekundárních struktur a stabilitu mRNA.
DDegradaceegradace proteinuproteinu
Bakteriální proteolytický systém:
- E. coli obsahuje velké množství proteas, nejvíce v cytoplazmě
- Selektivně odstraňuje „abnormální“ proteiny:
• Nekompletní polypeptidy
• Proteiny se zaměněnými AK
• Nadměrně syntetizované podjednotky multimerních proteinů
• Proteiny poškozené oxidací nebo volnými radikály
• Cizí, rekombinantní proteiny (problémem jsou proteiny < 10 kDa)
VýbVýběěr hostitelskr hostitelskéého kmeneho kmene E.E.colicoli
KmenyKmeny deficideficienentntníí nana proteasyproteasy
• Mutace, eliminující produkci proteas a tím proteolytickou
degradaci rekombinantních proteinů.
Expresní kmeny BL21 jsou deficientní na:
cytoplazmatickou proteasu lon
periplazmatickou proteasu ompT
Aminokyseliny redukujAminokyseliny redukujííccíí stabilitustabilitu heterolognheterolognííhoho proteinuproteinu
1. N-koncové pravidlo
• Stabilita proteinu je ovlivněna aminokyselinou, která následuje první
aminokyselinu polypeptidového řetězce (methionin).
• Aminokyseliny na této pozici redukují stabilitu proteinu:
Arg, Lys, Leu, Phe, Tyr a Trp
• Poločas rozpadu proteinu pouze 2 min
2. Lysin ve vnitřní sekvenci poblíž N-konce proteinu
• Degradace ubiqutin-dependentními proteasami
3. PEST hypotéza
• Oblasti bohaté na Pro (P), Glu (E), Ser (S), Thr (T)
• Po fosforylaci PEST degradace proteinu Ca-dependentními proteasami
CCíílenlenáá exprese proteinuexprese proteinu
Cytoplazmatická exprese
Periplazmatická exprese
Extracelulární exprese
(do kultivačního média)
CytoplazmatickCytoplazmatickáá expreseexprese
VýhodyVýhody
• Vysoký výtěžek proteinu
• Jednodušší plazmidové konstrukty
• Inkluzní tělíska
NevýhodyNevýhody
• Inkluzní tělíska
• Redukční prostředí
• Proteolýza
• Více komplexní purifikace
• Preferovaný způsob
InkluznInkluzníí ttěěllíískaska
•• NerozpustnNerozpustnéé shlukyshluky ššpatnpatněě posklposkláádandanééhoho rekombinantnrekombinantnííhoho proteinu.proteinu.
CoCo zpzpůůsobuje jejich tvorbu?sobuje jejich tvorbu?
• Rychlá nadprodukce proteinu
• Absence eukaryotních chaperonů
• Omezená tvorba disulfidických vazeb v redukujícím prostředí cytoplazmy
• Ví se málo o mechanismu tvorby a struktuře inkluzních tělísek.
• Intramolekulární asociace exponovaných hydrofóbních domén nesbalených řetězců
Inkluzní tělíska – nerozpustný protein
Rozpustný protein
Výhody
• Snadná izolace ve vysoké čistotě a koncentraci
• Ochrana před proteasami
• Pro produkci proteinů, jejichž aktivita je pro buňku letální
Nevýhody
• Proteinová nerozpustnost
• Refolding pro opětné získání biologické aktivity
• Refolding nemusí vést k zaktivování proteinu
• Redukce výtěžku proteinu
• Zvyšují se náklady
InkluznInkluzníí ttěěllíískaska
MoMožžnosti minimalizace tvorbynosti minimalizace tvorby inkluzninkluznííchch ttěěllííseksek
• Snížení teploty kultivace bakteriální kultury
• Koprodukce chaperonů
• Použití fúzního partnera zlepšujícího solubilizaci (thioredoxin)
• Selekce různých kmenů E.coli kmenů - např. bakteriální
kmene deficientní na thioredoxin reduktasu
Inkluzní tělíska
Rozpustný proteinExprese
rekombinantního
proteinu v E. coli
Izolace a následný
refolding
Modifikace expresních podmínek
Rozpustný protein
• Pokud protein obsahuje jeden nebo více disulfidických vazeb, správné poskládání
proteinu je stimulováno v hostiteli s více oxidujícím prostředí cytoplazmy.
•AD494 • Mutace v genu pro
thioredoxinreduktasu (trxB)
• Novagen
•Origami • Dvojitá mutace v genu pro thioredoxin
reduktasu (trxB) and glutathionreduktasu
(gor)
• Novagen
VýbVýběěr hostitelskr hostitelskéého kmeneho kmene E.E.colicoli
MoMožžnosti minimalizace tvorbynosti minimalizace tvorby inkluzninkluznííchch ttěěllííseksek
PeriplazmatickPeriplazmatickáá expreseexprese
Výhody
• Jednodušší purifikace
• Není zde tak rozsáhlá proteolýza
• Zlepšení tvorby disulfidických můstků/foldingu
Nevýhody
• Signální peptid nezajistí vždy transport do periplazmy
• Mohou se také tvořit inkluzní tělíska
• Periplazma obsahuje jen 4% všech buněčných proteinů (cca 100 proteinů)
• Transmembránový transport je zprostředkován signálním peptidem na N-konci
proteinu
• Prokaryotické signální peptidy úspěšně použité v E.coli (ompA, ompT z E.coli,
protein A z S. Aureus, endoglukanasa z B.subtilis)
ExtracelulExtraceluláárnrníí expreseexprese
• Sekrece proteinů do kultivačního média
• Chybí účinná cesta pro transport skrz vnější membránu (E.coli sekretuje velmi
málo proteinů).
• Některé proteiny sekretované do periplazmy pasivně difundují do média.
• Zatím spíše neúspěšná manipulace s různými transportními cestami, které by
usnadňovaly sekreci cizího proteinu.
VýhodyVýhody
• Minimální kontaminace ostatními proteiny (jednodušší
purifikace)
• Nejmenší hladina proteolýzy
• Zlepšení foldingu
NevýhodyNevýhody
• Často nízká sekrece
• Hodně zředěný protein
Modifikace růstových podmínek
Hostitelský
kmen
Podmínky
kultivace
Vektor
PodmPodmíínky kultivacenky kultivace
Možnosti zvýšení produkce rozpustného proteinu
Experimentálně se testuje:
• Vysoká hustota buněčné kultury
• Složení média (pH, přídavek specifických substrátů, kofaktorů,
složení živin-bohaté či minimální média)
• Optimalizace teploty růstu bakterií a teploty na indukci exprese
• Koncentrace indukčního činidla na indukci, délka indukce exprese
podmínky Specifická
aktivita
(nkat/mg)
kontrola 1,9
LB médium pH 6 2,0
LB médium pH 7 4,2
LB médium pH 8 2,8
1% celobiosa (na
indukci exprese)
2,7
• pH LB média
• Přítomnost substrátu
(celobiosa na indukci
exprese)
Vliv různých podmínek exprese na aktivitu mutantní formy kukuřičné βglukosidasy
F461L.
Specifická aktivita byla po expresi za uvedených
podmínek měřena v nativních lyzátech použitím
substrátu PNPG.
VVliv složení média na produkci rostlinnné ββββglukosidasy
vv E. coliE. coli
1. Médium: LB médium, bakteriální kmen BL21(DE3)pLysS
Růst (OD600~0.5-0.6) Indukce 0,4 mM IPTG/3hodiny
22°C 22°C (3)
37°C 22°C (2)
37°C 28°C (1)
2. Příprava proteinových lyzátů za silně denaturačních podmínek (celková produkce
proteinu= rozpustná+nerozpustná forma) a za nativních podmínek (rozpustná forma
proteinu).
3. SDS PAGE denaturačních a nativních proteinových lyzátů
s následnou analýzou western blotingem.
4. Detekce proteinu pomocí série protilátek a kvantifikace signálů pomocí programu
pro analýzu 1-D gelů (př. Quantity One- BioRad, Quanti Scan-přístupný na
internetu).
1 2 3
Podmínky:
Test rozpustnosti:
Rozpustná forma proteinu
Celková produkce proteinu
VVliv teploty růstu bakterií a indukce exprese na
produkci rostlinnných AHPAHP proteinproteinůů vv E. coliE. coli
73 %81 %30 %100%78 %71 %22°C/22°C
51 %81 %0100%73 %82 %37°C/22°C
076 %0100%85 %8 %
37°C/28°C
AHP6AHP5AHP4AHP3AHP2AHP1
t(°C)
Růst/indukce
Procenta produkce AHP proteinů v rozpustné formě
VVliv teploty růstu bakterií a indukce exprese na
produkci rostlinnných AHPAHP proteinproteinůů vv E. coliE. coli
2.2. ččáást: Purifikacest: Purifikace rekombinantnrekombinantnííchch proteinproteinůů
Purifikace proteinů fúzovaných s GFP
pomocí hydrofóbní matrice
Purifikace proteinu z komplexní směsi makromolekul přítomných v
biologickém vzorku (buněčný nebo tkáňový extrakt)
• Několik tisíc proteinů z různými vlastnostmi (~5000-8000) a v různých množstvích
(aktin ~ 10%, unikátní trankripční faktor < 0,001% z celkového proteinů)
• DNA, RNA, polysacharidy, lipidy
Analýza buněčného extraktu 2D elektroforézou
NeNežž zazaččnemeneme………………………………………………
1.1. ProPročč?????? Pro jakýPro jaký úúččel ?el ?
2.2. Co???Co??? JakJakéé vlastnosti mvlastnosti máá protein ?protein ?
3.3. Jak???Jak??? Jak protein detekovat?Jak protein detekovat?
1.1. ProPročč?????? ProPro jakýjaký úúččel ?el ?
AplikaceAplikace MnoMnožžstvstvíí ČČistotaistota PoznPoznáámkamka
IdentifikaceIdentifikace 0,0020,002--0,20,2 µµµµµµµµgg vvysokysokáá
((>>95%95%))
• Edmanovo odbourávání (5-10 pmol),
přístupy hmotnostní spektroskopie (0,2-1
pmol)
Produkce protilProdukce protiláátektek µµµµµµµµgg--mgmg ststřřednedníí--vysokvysokáá • Pro imunizaci: ~ 0,1 µg proteinu
• Čím větší čistota tím větší a rychlejší šance
pro zisk vysoce specifické imunitní odpovědi.
EnzymologieEnzymologie 11--5 mg5 mg vvysokysokáá >> 95 %95 % • Množství proteinu závisí na citlivosti
analýzy.
• Čistota závisí na specificitě analýzy a
ovlivnění výsledků analýzy kontaminacemi.
BiofyzikBiofyzikáálnlníí studiestudie mgmg--gg vvysokysokáá
((>>95%95%))
• CD spektroskopie, rezonance povrchových
plasmonů, fluorimetrie, analytická
ultracentrifugace, UV spektroskopie
3D struktura3D struktura
(krystalizace, NMR)(krystalizace, NMR)
1010--20 mg20 mg vysokvysokáá
((>>95%)95%)
• Hledání krystalizačních podmínek ~ 1-2 mg
proteinu, zisk krystalu o velikosti dostatečné
pro rentgenovou difrakci 5-10 mg proteinu
• Pro první 1-D NMR spektra se vyžaduje ~
0,5 µmol proteinu, protein (velikost 5-20kDa)
značený 15 N / 13C je nutný pro vyřešení
struktury.
FarmaceutickFarmaceutickéé
úúččelyely
mgmg--kgkg vysokvysokáá
(99,9%)(99,9%)
• Pro klinické účely nesmí proteiny obsahovat
pyrogeny a bakteriální toxiny a musí být
velmi stabilní kvůli dlouhodobému
skladování.
2. Co??? Jaké vlastnosti má protein ?
InformaceInformace o proteinu zo proteinu záájmu a pjmu a přřííbuzných proteinechbuzných proteinech zz databdatabáázzíí nebo znebo z
pilotnpilotníích experimentch experimentůů::
• Velikost proteinu (SDS PAGE, gelová filtrace nebo analytická centrifugace)
• Izoelektrický bod (izoelektrická fokusace)
• Stabilita (pH, teplota, přítomnost solí, proteas, additiv zajišťujících
rozpustnost proteinu)
2D a nativn2D a nativníí PAGEPAGE
• Komplexita vzorku, vlastnosti proteinu zájmu a i ostatních
kontaminujících proteinů
InformaceInformace o proteinu zo proteinu záájmu a o pjmu a o přřííbuzných proteinechbuzných proteinech zz literatury:literatury:
• Strategie purifikace (metody, pufry, stabilita proteinu, …..)
Vlastnosti/purifikační metody
Rozpustnost precipitace např. síranem amonným, nízké/vyskoké pH
Stabilita teplotní precipitace
Velikost/tvar gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
pI (povrchový náboj) iontově výměnná chromatografie
Hydrofobicita hydrofóbní chromatografie
Specifická vazba afinitní chromatografie
Posttranslační modifikace afinitní chromatografie
Vlastnosti/purifikační metody
Rozpustnost precipitace např. síranem amonným, nízké/vyskoké pH
Stabilita teplotní precipitace
Velikost/tvar gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
pI (povrchový náboj) iontově výměnná chromatografie
Hydrofobicita hydrofóbní chromatografie
Specifická vazba afinitní chromatografie
Posttranslační modifikace afinitní chromatografie
Vlastnosti/purifikační metody
Rozpustnost precipitace např. síranem amonným, nízké/vyskoké pH
Stabilita teplotní precipitace
Velikost/tvar gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
pI (povrchový náboj) iontově výměnná chromatografie
Hydrofobicita hydrofóbní chromatografie
Specifická vazba afinitní chromatografie
Posttranslační modifikace afinitní chromatografie
Vlastnosti/purifikační metody
Rozpustnost precipitace např. síranem amonným, nízké/vyskoké pH
Stabilita teplotní precipitace
Velikost/tvar gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
pI (povrchový náboj) iontově výměnná chromatografie
Hydrofobicita hydrofóbní chromatografie
Specifická vazba afinitní chromatografie
Posttranslační modifikace afinitní chromatografie
Vlastnosti/purifikační metody
Rozpustnost precipitace např. síranem amonným, nízké/vyskoké pH
Stabilita teplotní precipitace
Velikost/tvar gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
pI (povrchový náboj) iontově výměnná chromatografie
Hydrofobicita hydrofóbní chromatografie
Specifická vazba afinitní chromatografie
Posttranslační modifikace afinitní chromatografie
Kolik purifikačních kroků je potřeba?
Obohacení vzorku cílovým proteinem,
zakoncentrování a stabilizace cílového proteinu
Odstranění většiny nečistot – jiné
proteiny, nukleové kyseliny……, další
zakoncentrování cílového proteinu
Vysoká čistota cílového proteinuodstranění
drobných nečistot,
proteinů podobných vlastností
purifikační kroky
Čistotaproteinu
ZISK CÍLOVÉHO PROTEINU
DALŠÍ PURIFIKACE
DOČIŠTĚNÍ
PŘÍPRAVA VZORKU PRO CHROMATOGRAFII
Odstranění nesolubilních podílu hrubého extraktu, lipidů,
zakoncentrování vzorku (precipitace solemi nebo ultrafiltrace)
Většina proteinů je purifikována
minimálně ve čtyřech krocích.
Rychlost
Rozlišení
Kapacita
Výtěžek
LogickLogickáá kombinace purifikakombinace purifikaččnníích krokch krokůů
Rozlišení je rozsah separace mezi
dvěma chromatografickými píky
(bez dostatečného rozlišení
nedochází k separaci proteinů).
Kapacita (max.) je
maximální množství vzorku,
které může být navázáno na
chromatografickou kolonu.
Rychlost kroku je
důležitá zejména v
kvůli možné
degradaci cílového
proteinu působením
proteas v
komplexním vzorku.
Výtěžek-minimalizace
ztráty proteinu během
purifikace.
Každá separační technika je vyznačuje rovnováhou mezi čtyřmi parametry.
Rozlišení
Rychlost Kapacita
Výtěžek
Zisk cZisk cíílovlovéého proteinu z proteinovho proteinu z proteinovéého extraktuho extraktu
Cíl: rychlá izolace, stabilizace a zakoncentrování.
Purifikační techniky: afinitní chromatografie
iontoměničová chromatografie
hydrofóbní chromatografie
Rozlišení
Rychlost Kapacita
Výtěžek
DalDalšíší purifikace proteinupurifikace proteinu
Cíl: Purifikace a zakoncentrování.
Purifikační techniky: iontoměničová chromatografie
hydrofóbní chromatografie
gelová filtrace
afinitní purifikace
Rozlišení
Rychlost Kapacita
Výtěžek
Dočištění proteinu a úprava podmínek pro
jeho skladování (pH, soli, additiva)
Cíl: Produkt o požadované vysoké čistotě.
Purifikační techniky: gelová filtrace
afinitní purifikace
ZZáákladnkladníí zzáásady pro posady pro pořřadadíí purifikapurifikaččnníích krokch krokůů
• Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a
rozlišením → velké množství levného vstupního materiálu.
• Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná
→ ve vzorku již investovaná práce, množství proteinu je menší.
• Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků,
jako je výměna pufru mezi jednotlivými separačními technikami
příklad: po precipitaci síranem amonným nebo iontoměničové chromatografii (protein je
eluován z kolony za vysokých koncenracích soli) zařadit hydrofóbní chromatografii (vzorek
dávkován na kolonu ve vysoké koncentraci soli)
• Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat.
• Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu.
3.3. JakJak?????? Jak budeme proteinJak budeme protein analyzovatanalyzovat??
1. Specifická detekce:
Detekce proteinu zájmu během purifikace
• Pomocí protilátek
Sledování biologické aktivity proteinu
• U enzymů např. barvení v gelu nebo stanovení
specifických konstant v komplexních vzorcích
pomocí chromogenních substrátů
2. Nespecifická detekce:
Sledování čistoty
• Barvení pomocí Coommasie blue, stříbra,...
3. Stanovení koncentrace proteinu
• Nejvíce využívané metody: dle Bradfordové, Lowryho metoda,….
Polyakrylamidová gelová elektroforéza
SDS PAGE s následných
westernovým přenosem
SDS PAGE
nativní PAGE
SledovSledováánníí ččistoty proteinistoty proteinůů
28% purity 80% purity 95% purity
SDS PAGE
Nativní PAGE
Dimer
Monomer
FFúúznzníí proteinyproteiny
Translační fúze sekvencí kódujících rekombinantní protein a
a) krátký peptid [př. (His)n, (Asp)n, (Arg)n ... ]
b) přirozený oligopeptid [př. MBP, GST, thioredoxin …]
• usnadnění purifikace (uniformita purifikace) rekombinantního proteinu
• zvýšení výtěžku
• zlepšení rozpustnosti
• umožnění detekce
• umožnění sekrece
• Fúzního partnera lze obvykle selektivně odštěpit.
FFúúznzníí partnerpartner VelikostVelikost UmUmííststěěnníí VyuVyužžititíí
His-tag 6, 8, or 10 aa N-, C-, internal purifikace
thioredoxin 109 aa (11.7 kDa) N-,C- purifikace, zvýšení solubility
proteinu
His-patch thioredoxin 109 aa (11.7 kDa) N-,Cpurifikace,
zvýšení solubility
proteinu
chloramfenikol acetyltransferasa 24 kDa N- sekrece, purifikace, detekce
avidin/streptavidin Strep-tag purifikace, sekrece
glutathion-S-transferasa-GST 26 kDa N- purifikace
maltosu vázající protein (MBP) 40 kDa N-, C- purifikace, sekrece
zeleně fluoreskující protein (GFP) 220 aa N-, C- detekce, purifikace
polyasparagová kyselina 5-16 aa C- purifikace
ompT /ompA 22 aa /21 aa N- sekrece
Kotva (tag) Typ chromatografie Princip separační techniky
poly [His] afinitní vazba na kov
IgG vazná doména afinitní vazba na protilátku
Poly [Asp] iontoměničová vazba na anion vázající matrici
Poly [Phe] hydrofóbní vazba na hydrofóbní matrici
Strep-tag afinitní vazba na streptavidin
Poly [Arg] iontoměničová vazba na kation vázající matrici
Fúzní kotvy (tagy) využívající se k purifikaci
Kapacita
Rozlišení
Rychlost
Výtěžek
Separační techniky charakteristické
rovnováhou všech parametrů.
Odstranění fúzní kotvy (tagu) – proteolytické štěpení
MetalochelataMetalochelataččnníí afinitnafinitníí chromatografiechromatografie
• R.1975- uveřejnil Porath a kol. metodu frakcionace sérových proteinů
• Konstrukce umělých oligohistidinových domén fúzovaných k N- nebo
C- konci proteinu metodami mol. biologie
• Nyní jeden ze základních purifikačních postupů rekombinantních
proteinů
•Interakce proteinu s matricí je zprostředkovaná neobsazenými d-orbitaly iontů
přechodných kovů, které vážou volné elektronové páry převážně z dusíkového
atomu imidazolových skupin histidinových zbytků v proteinu.
Podpůrná matrice
(agarosa)
„oddělovací
raménko“
Funkční/reaktivní
skupina
Ligand
(Ni2+)
Protein s histidinovou
kotvou
Matrice pro IMACMatrice pro IMAC
Zn2+ Ni2+ Co2+ Cu2+
Síla vazby: Cu2+ > Ni2+ > Zn2+ ~ Co2+
Efekt kovovEfekt kovovéého iontu navho iontu naváázanzanéého na matriciho na matrici
Podpůrná matrice
(agarosa)
„oddělovací
raménko“
Funkční/reaktivní
skupina
Ligand
(Ni2+)
Protein s histidinovou
kotvou
(IMAC)
MetalochelataMetalochelataččnníí afinitnafinitníí chromatografiechromatografie
Purifikace za nativních podmínek
Protokol nativní IMAC konkrétního proteinu je zčásti nepřenosný na jiné proteiny!
Obecně lze navrhnout:
Pufry o pH 7-8 pro vazbu rek. proteinu s kovovým iontem
Pufry s vysokou koncentrací solí (např. 0,5-1 mol/l NaCl)
Nižší koncentrace imidazolu nebo snížení pH pro odstranění
balastních proteinů
Eluce použitím gradientu imidazolu (0-1 mol/l),
výrazným snížením pH nebo využitím EDTA
MetalochelataMetalochelataččnníí afinitnafinitníí chromatografiechromatografie
Purifikace za denaturačních podmínek
Denaturační IMAC – purifikace proteinů v inkluzních tělíscích
Purifikace za vysokých koncentrací močoviny nebo
guanidinium chloridu
čistý protein, ale porušení kvartérní struktury
(postačí však např. na imunizace)
Zisk nativního konformeru: - Nutné pro měření enzymové kinetiky, rtg analýza,…
- Eluce proteinu z kolony a jeho renaturace dialýzou
nebo výrazným zředěním v renaturačních pufrech
- Renaturace enzymu vázaného na matrici:
Gradient z denaturačních do renaturačních pufrů
Pulzní renaturace
Metalochelatační afinitní chromatografie
Gelová filtrace Anion výměnná chromatografie
4L bakteriální kultury
15% SDS PAGE 15 % SDS PAGE10% NATIVE PAGE
10% NATIVE PAGE
66 kDa
45 kDa
36 kDa
29 kDa
24 kDa
20 kDa
14 kDa
Pufr: 20 mM Tris pH 7.9, 250 mM NaCl
Isocratická eluce
Pufr: 20 mM Tris pH 7.9
Gradientová eluce: 0 - 1M NaCl
Puer: 50 mM Tris pH 7.9, 300 mM
NaCl, 10 % glycerol, 20 mM
imidazol, 3.9 mM mercaptoethanol
Gradientová eluce: 20 -500 mM
imidazol
PurifikacePurifikace proteinuproteinu AHP2AHP2 ((ArabidopsisArabidopsis histidinhistidin phosphotransferphosphotransfer protein 2)protein 2)
One-step purification of maize ββββ-glucosidase
Perfusion matrix: POROS MC/M
Functional group: iminodiacetate, metal ion Zn2+
Removing contaminated proteins: linear gradient of imidazole (0–50 mM) and pH (pH 6.1–7)
Protein elution: 0.1 M EDTA
80% recovery, 95 fold purification
Common production and isolation of wild type protein and soluble mutant form for enzymatic
measurements and crystallization.
His-tagged protein and IMAC under native conditions
(Zouhar et al., 1999)
Doporučená literatura
Makrides SV (1996) Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in
Escherichia coli. Microb.Review 60, (512-538).
Simpson RJ; Adams PD; Golemis E
Basic methods in protein purification and analysis: a laboratory manual,
Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009,
436 s., ISBN 978-0-87969-868-3