Logo1me C8202 Základy proteomiky C8202 Základy proteomiky Proč právě proteomika? Jan Hejátko Logo1me C8202 Základy proteomiky §Zdrojová literatura k první přednášce: §Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, New Jersey §Wang, L. and Wessler, S.R. (1998) Inefficient reinitiation is responsible for upstream open reading frame-mediated translational repression of the maize R gene. Plant Cell, 10, (1733) C8202 Základy proteomiky zdrojová literatura §Friml, J. and Palme, K. (2002) Polar auxin transport. Old questions and new concepts?. Plant Mol. Biol., 49, 273-284 §Mello, C.C. and Conte Jr., D. (2004) Revealing the world of RNA interference. Nature, 431, 338-342 §Surpin, M. and Raikhel, N. (2004) Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nature Reviews/Molecular Cell Biology 5,100-109 Monografie a učebnice Publikace v mezinárodních časopisech §Proteome Research: New Frontiers in Functioonal Genomics, ed. Wilkins, M.R., Wiliams, K.L., Appel, R.D., Hochstrasser, D.F., 1997, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg §Dubová J. , Hejátko J., Friml J. (2005) Reproduction of Plants, in Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine (ed, R. A. Meyers), pp. 249 – 295. Wiley-VCH, Weinheim, Germany Logo1me C8202 Základy proteomiky Proč právě proteomika? §exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů C8202 Základy proteomiky §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět §Přístupy současné proteomiky §analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů §diferenční proteomika §analýza posttranslačních modifikací Logo1me C8202 Základy proteomiky Proč právě proteomika? C8202 Základy proteomiky §PROTEOME = PROTEins expressed by genOME (konference 2-D ELFO, Siena, 1994) §Proč vůbec studovat proteiny, když máme tolik genetických dat? (sekvence genomů, expresní profily genů, fenotypy mutantů,…?) Na konci je vždy BIOLOGICKÝ PROBLÉM !!!! §DNA: GENOME, HAPLOME, EPIGENOME §RNA: TRANSCRIPTOME §PROTEIN: ORFEOME, PROTEOME, LOCALISOME, INTERACTOME, METABOLOME, PHENOME, … V koncovém výsledku, tedy fenotypu, se vždy projeví regulace na všech úrovních, od genu po protein a jeho modifikaci •PHENOME: kombinace různých dat, zahrnujících fenotyp, expresní data různých (ideálně všech) genů daného organismu a proteinová data (interakce, jednotlivé vlastnosti proteinů, …) The actual term 'genomics' is thought to have been coined by Dr. Tom Roderick, a geneticist at the Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) over beer at a meeting held in Maryland on the mapping of the human genome in 1986. (Wikipedia, http://en.wikipedia.org/wiki/Genomics). Logo1me C8202 Základy proteomiky Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §dnes k dispozici v databázích více než 700 000 záznamů (nr databáze) různých organizmů §Získané informace lze zpracovat pomocí bioinformatiky Genome Project at NCBI Anotace genů a odhad aminokyselinových sekvencí předpokládaných proteinů Logo1me C8202 Základy proteomiky Adobe Systems Adobe Systems Predikce funkce genů in silico struktura genů §struktura genů §promotor §počátek transkripce §5´UTR §počátek translace §místa sestřihu §stop kodon §3´UTR §polyadenylační signál TATA ATG….ATTCATCAT ATTATCTGATATA 5´UTR 3´UTR ….ATAAATAAATGCGA Logo1me C8202 Základy proteomiky Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst Anotace genů a odhad aminokyselinových sekvencí předpokládaných proteinů §dnes k dispozici v databázích více než 700 000 záznamů (nr databáze) různých organizmů §Získané informace lze zpracovat pomocí bioinformatiky Logo1me C8202 Základy proteomiky Proč právě proteomika? C8202 Základy proteomiky §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Logo1me C8202 Základy proteomiky §Genom vs. Proteom § monarch_caterpillar monarch_imago Gen Transkript Protein Fenotyp Danaus plexippus (monarch) Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Logo1me C8202 Základy proteomiky Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Možná analogie s textem a jeho interpretací Kdyžadoperbtabijsemdfjfwůcsaknclůsnínjxldalnxckjcnbychcxmasizdciksrdceasnanazxcnlsdlaň. DNA: RNA: Když----------------jsem---------s----------ní-----dal----------bych-------si------srdce-------na-- ------dlaň. Když----------------jsem---------snídal-----------------------------------------------srdce. Když----------------jsem---------s----------ní-----dal----------by----------si------srdce-------na- -------dlaň. PROTEIN: Když jsem s ní, dal bych si srdce na dlaň. Když jsem s ní, dala by si srdce na dlaň. Když jsem snídal srdce. Když jsem s ní, dal by si srdce na dlaň. Kdyžadoperbtabijsemdfjfwůcsaknclůsnínjxldalnxckjcnbychcxmasizdciksrdceasnanazxcnlsdlaň. Logo1me C8202 Základy proteomiky Proč právě proteomika? C8202 Základy proteomiky §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět Logo1me C8202 Základy proteomiky Základní mechanismy regulace genové exprese §regulace transkripce §sestřih RNA Od genu k proteinu a zpět SRBs (suppressor of RNA polymerase B) are proteins interacting with DNA polymerase II. These proteins were isolated in a screen for mutations rescuing the deletion mutants lacking the carboxy-terminal repeat in yeast. Logo1me C8202 Základy proteomiky Základní mechanismy regulace genové exprese §regulace transkripce §sestřih RNA Od genu k proteinu a zpět SRBs (suppressor of RNA polymerase B) are proteins interacting with DNA polymerase II. These proteins were isolated in a screen for mutations rescuing the deletion mutants lacking the carboxy-terminal repeat in yeast. Logo1me C8202 Základy proteomiky Adobe Systems Adobe Systems Základní mechanismy regulace genové exprese struktura genů §struktura genů §promotor §počátek transkripce §5´UTR §počátek translace §místa sestřihu §stop kodon §3´UTR §polyadenylační signál TATA ATG….ATTCATCAT ATTATCTGATATA 5´UTR 3´UTR ….ATAAATAAATGCGA Logo1me C8202 Základy proteomiky §odchylky rozpoznávání míst sestřihu u rostlin v praxi - příklad vývojové plasticity (nejen) rostlin •identifikace mutanta s bodovou mutací (tranzice G→A) přesně v místě sestřihu na 5‘ konci 4. exonu •analýza pomocí RT PCR prokázala přítomnost fragmentu kratšího než by odpovídalo cDNA po normálním sestřihu •sekvenace tohoto fragmentu pak ukázala na alternativní sesřih s využitím nejbližšího možného místa sestřihu v exonu 4 RTPCR_EN •existence podobných obranných mechanizmů prokázána i u jiných organizmů (např. nestabilita mutantní mRNA se vznikem předčasného stopkodonu (> 50-55 bp před normálním stop kodonem) u eukaryot, viz doporučená studijní literatura, Singh and Lykke-Andersen, 2003) Základní mechanismy regulace genové exprese regulace transkripce Logo1me C8202 Základy proteomiky Základní mechanismy regulace genové exprese přeskupování subgenů při produkci protilátek Přeskupování subgenů jako specifický mechanismus při produkci protilátek §protilátky variabilní oblast (V) a konstantní oblast (C) a lehký (L) a těžký (H) řetězec §každá z V oblastí L řetězce u myší je kódována 2 subgeny (V a J) §každá z V oblastí H řetězce u myší je kódována 3 subgeny (V, J a D) §v zárodečných liniích myších B-lymfocytů dochází k tzv. kombinatorické diversifikaci (přeskupování) subgenů (místně-specifickou rekombinací) §L řetězec (κ): cca 300 V sub-genů a 4 J subgeny (300 x 4 = 1200 možností) §H řetězec: cca 500 V sub-genů, 4 J subgeny a 12 D subgenů (500 x 4 x 12 = 24000 možností) Ab7 §celkové množství kombinací u myší: cca 1200 x 24000 = 28 mil. různých V oblastí (protilátek rozpoznávající různé antigeny) MBC_01 §antigen indukuje tzv. afinitní dozrávání mechanismem somatické hypermutace §po aktivaci B-lymf. pomocnými T-lymf. dochází ke zvýšenému výskytu mutací ve V oblastech (1 mutace/V oblast/generaci, cca 1 mil. X vyšší než je obvyklé (např. u tzv. „house-keeping“ genů) a selekci protilátek se zvýšenou afinitou k antigenu V oblasti jsou kódovány jednotlivými subgeny, kdežto C oblasti jsou kódovány pouze C geny. Obrázek ukazuje mechanismus přeskupování subgenů pro lehký řetězec. Logo1me C8202 Základy proteomiky Základní mechanismy regulace genové exprese §regulace transkripce §sestřih RNA Od genu k proteinu a zpět §translační represe Logo1me C8202 Základy proteomiky • Funkční význam sestřihu v nepřekládaných oblastech - důležitá regulační součást genů §Translační represe prostřednictvím krátkých ORF v 5‘UTR §Identifikováno např. u kukuřice (Wang and Wessler, 1998, viz doporučená lit.) §V případě CKI1 pokus prokázat tento způsob regulace genové exprese pomocí transgenních linií nesoucích uidA pod kontrolou dvou verzí promotoru, zatím nepotvrzeno fig_1 ATGaaaagagcttttTAG M K R A F . ATGaaaagagcttttTAG M K R A F . ATGatggtgaaagttaca…. M M V K V T … ATGatggtgaaagttaca…. Regulace genové exprese mechanismem translační represe ATGatggtgaaagttaca…. M M V K V T … Logo1me C8202 Základy proteomiky Expression of CKI1 in Diploid Generative Tissue Inflorescence PR4_GUS_IL_124 fl16 fl2 Logo1me C8202 Základy proteomiky Základní mechanismy regulace genové exprese §regulace transkripce §Sestřih RNA §posttranskripční umlčování mechanizmem siRNA Od genu k proteinu a zpět §translační represe Logo1me C8202 Základy proteomiky Genomika III. mechanismus RNA interference §Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS) §RNAi objevena u Coenorhabditis elegans §umlčování bylo indukováno jak sense tak antisense RNA (pravď. kontaminace obou při in vitro transkripci) §dsRNA indukovala umlčování cca 10-100x účinněji §dsRNA indukce je závislá na vlastních genech-gen. vyhledávání RNAi rnai Logo1me C8202 Základy proteomiky Genomika III. mechanismus RNA interference §Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS) §RNAi objevena u Coenorhabditis elegans §je to přirozený mechanismus regulace genové exprese u všech eukaryot §podstatou je tvorba dsRNA, která může být spuštěna několika způsoby: §přítomnost cizí „aberantní“ DNA §specifické transgeny obsahující obrácené repetice částí cDNA §transkripce vlastních genů pro shRNA (short hairpin RNA) nebo miRNA (micro RNA, endogenní „vlásenková“ RNA) §dsRNA je procesována enzymovým komplexem (DICER), což vede k tvorbě siRNA (short interference RNA), která se pak váže buď na enzymový komplex RITS (RNA-induced transcriptional silencing complex) nebo RISC (RNA-induced silencing komplex) §RISC zprostředkovává buď degradaci mRNA (v případě úplné similarity siRNA a cílové mRNA) nebo vede pouze k zastavení translace (v případě neúplné homologie jako je tomu např. v případě miRNA §RITS zprostředkovává reorganizaci genomové DNA (tvorba heterochromatinu a inhibice transkripce) Logo1me C8202 Základy proteomiky RNA-dependent RNA polymerase short hairpin RNA micro RNA Mello and Conte, Nature (2004) Mechanism of RNA interference + tasiRNAs 21-24 bp It has been found that dsRNA might be either an intermediate or a trigger in PTGS. In the first case, dsRNA is formed by the action of RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs), which use specific transcripts as a template. It is still not clear, how these transcripts are recognized, but it might be e.g. abundant RNA that is a result of viral amplification or transcription of foreign DNA. It is not clear, how the foreign DNA might be recognized, possibly, lack of bound proteins on the foreign “naked” DNA and its subsequent “signature” (e.g. by specific methylation pattern) during packing of the foreign DNA into the chromatin structure might be involved. The highly abundant transcripts might be recruited to the RdRPs by the defects in the RNA processing, e.g. lack of polyadenylation. In the case when dsRNA is a direct trigger, there are two major RNA molecules involved in the process: Short interference RNA (siRNA) and micro RNA (miRNA), both encoded by the endogenous DNA. These two functionally similar molecules differ in their origin: siRNAs are dominantly product of the cleavage of the long dsRNA that are produced by the action of cellular or viral RdRPs. However, there are also endogenous genes, e.g. short hairpin RNAs (shRNAs) allowing production of the siRNA (see the figure). miRNAs are involved in the developmental-specific regulations and are product of transcription of endogenous genes encoding for small dsRNAs with specific structure (see the figure). In addition to siRNAs, there are trans-acting siRNAs (tasiRNAs) that are a special class of siRNAs that appear to function in development (much like miRNAs) but have a unique mode of origin involving components of both miRNA and siRNA pathways. Developmental regulations via miRNAs are more often used in animals then in plants. The dsRNAs of all origins and pre miRNAs are cleaved by DICER or DICER-like (DCL) enzyme complexes with RNAse activity, leading to production of siRNAs and miRNA, respectively. These small RNAs are of 21-24 bp long and bind either to RNA-induced transcriptional silencing complex (RITS) or RNA-induced silencing komplex (RISC). Logo1me C8202 Základy proteomiky The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" Andrew Z. Fire Craig C. Mello USA USA Stanford University School of Medicine Stanford, CA, USA University of Massachusetts Medical School Worcester, MA, USA b. 1959 b. 1960 Andrew Z. Fire Craig C. Mello Logo1me C8202 Základy proteomiky Regulace vývoje květů u Arabidopsis prostřednictvím miRNA §ABC model vývoje květních orgánů u rostlin §během vývoje květních orgánů dochází k určování identity jednotlivých květních orgánů kombinací exprese tzv. homeiotických genů §homeiotické geny kódují většinou rostlinné homolgy MADS-box transkripčních faktorů §mezi jednotlivými homeiotickými geny dochází k tzv. katastrálním interakcím, kdy exprese jednoho genu inhibuje expresi dalšího §např. AP1 je nejprve aktivní v celém květním meristému, po indukci exprese AG pak AG inhibuje expresi AP1 ve vnitřních dvou kruzích) § Od genu k proteinu a zpět posttranskripční umlčování mechanizmem siRNA §výjimkou je exprese genu AP2, jehož mRNA je přítomná v celém květním meristému, ale exprese AP2 je regulována na úrovni translace prostředictvím miRNA (gen miRNA 172) wt ap2 35S::miRNA 172 in situ lokalizace miRNA172 v 3. a 4. kruhu Logo1me C8202 Základy proteomiky Základní mechanismy regulace genové exprese §regulace transkripce §Sestřih RNA §posttranskripční umlčování mechanizmem siRNA §směřování proteinů Od genu k proteinu a zpět §translační represe Logo1me C8202 Základy proteomiky §Intracelulární lokalizace proteinů §v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům, zprostředkovávaným zejména tzv. endomembránovým transportem (viz film, GFP směřované do ER) §endomembránový transport je důležitým regulačním mechanismem při přenosu signálu a regulaci buněčných procesů secretion_pthways Od genu k proteinu a zpět směřování (cílování) proteinů CV, central vacuole; DV, dense vesicle; ER, endoplasmic reticulum; GA, Golgi apparatus; LV, lytic vacuole; N, nucleus; PAC, precursor-accumulating compartment; PB, protein body; PCR, partially coated reticulum; PSV, protein-storage vacuole; PVC, pre-vacuolar compartment; SV, secretory vesicle. Surpin and Raikhel, 2004. §Pro funkci proteinů v buňkách je zásadní jejich správná lokalizace prostřednictvím tzv. signálních sekvencí Logo1me C8202 Základy proteomiky Od genu k proteinu a zpět směřování (cílování) proteinů §Cyklování auxinových přenašečů u Arabidopsis §auxin je rostlinný hormon se silným morfogenním účinkem §proteiny podílející se na transportu proteinů jsou tzv. PIN proteiny, polárně lokalizované v bunňkách kořene u Arabidopsis §v přítomnosti inhibitorů endocytózy (BFA) dochází k akumulaci těchto proteinů v intracelulárních kompartmentech…. §….čímž je zároveň negativně ovlivněn gravitropizmus u rostlin §PIN proteiny cyklují v endomembránovém systému rostlinné buńky Logo1me C8202 Základy proteomiky Základní mechanismy regulace genové exprese §regulace transkripce §sestřih RNA §posttranskripční umlčování mechanizmem siRNA §směřování proteinů §posttranslační modifikace proteinů Od genu k proteinu a zpět §translační represe Logo1me C8202 Základy proteomiky Význam posttranslačních modifikací proteinů §regulace enzymové aktivity §regulace interakcí proteinu s dalšími proteiny nebo jinými biomolekulami §přenos signálu Od genu k proteinu a zpět postranslační modifikace proteinů §lokalizace proteinu v buňce §změna mechanických vlastností proteinu Logo1me C8202 Základy proteomiky Typy posttranslačních modifikací proteinů §přidání glykosylfosfatidylinositolové (GPI) kotvy §fosforylace §N-myristolyace Od genu k proteinu a zpět postranslační modifikace proteinů §sulfonace §glykosylace §N-metylace §hydroxylace §karboxylace §prenylace §…. Logo1me C8202 Základy proteomiky Přenos signálu a regulace genové exprese prostřednictvím fosforylace §přenos cytokininového signálu u rostlin § Od genu k proteinu a zpět postranslační modifikace proteinů FGP_logo_color Signal Transduction via TCS NUCLEUS Adobe Systems PM AHK sensor histidine kinases • AHK2 • AHK3 • CRE1/AHK4/WOL REGULATION OF TRANSCRIPTION INTERACTION WITH EFFECTOR PROTEINS HPt Proteins • AHP1-6 Response Regulators • ARR1-24 Recent Model of the CK Signaling via TCS Pathway D’Agostino et al., Plant Physiol, 2000 CK primary response genes - Type-A ARRs expression Logo1me C8202 Základy proteomiky Přenos signálu a regulace genové exprese prostřednictvím fosforylace §přenos signálu prostřednictvím TGFβ (Transforming Growth Factor) u živočichů § Od genu k proteinu a zpět postranslační modifikace proteinů Logo1me C8202 Základy proteomiky Proč právě proteomika? §exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů Základy proteomiky 2012 §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět §Přístupy současné proteomiky Logo1me C8202 Základy proteomiky Technologie rekombinatních proteinů § §umožňuje získat velké množství analyzovaného proteinu ve velké čistotě § Přístupy současné proteomiky exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů §využívá technologie rekombinantní DNA §principem je vložení „přívěsku“ prostřednictvím přípravy rekombinantní DNA, který usnadní purifikaci (afinitní purifikace) §možnost využití „přívěsku“ i pro lokalizaci a další analýzu proteinu v in vivo systémech Logo1me C8202 Základy proteomiky Proč právě proteomika? §exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů Základy proteomiky 2012 §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět §Přístupy současné proteomiky §analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů Logo1me C8202 Základy proteomiky Analýza vztahu mezi funkcí a strukturou proteinu § §využívá technologie produkce rekombinantních proteinů a místně řízené mutageneze § Přístupy současné proteomiky analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů §umožňuje analyzovat strukturu rekombinantního proteinu pomocí rentgenové krystalografie nebo NMR §kopmparativní analýzou lze pak analyzovat strukturu a funkci jak u strandardního typu tak i mutantního proteinu ahp5-det productive_nonproductive_popisky Logo1me C8202 Základy proteomiky Proč právě proteomika? §exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů Základy proteomiky 2012 §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět §Přístupy současné proteomiky §analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů §diferenční proteomika FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development Tissue Specificity of CK Response □Cytokinins are supposed to play opposite role in the control of shoot and root development 35S:AtCKX3 WT WT 35S:AtCKX3 35S:AtCKX3 WT Werner et al., Plant Cell (2003) FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development Shoot- and Root-Specificity of Proteome Response to CK □Is there a shoot- and root-specificity in a proteome response to CK ? 6-days-old seedlings Incubation in MS+5 µM BA tissue separation ROOT sample SHOOT sample 30 min. (early response) 120 min. (delayed response) -BA +BA -BA +BA FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development SHOOT: 43/18 (early/delayed) ROOT: 31/21 Shoot- and Root-Specificity of Proteome Response to CK Žďárská et al., Plant Physiology, 2012 FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development Shoot- and Root-Specificity of Proteome Response to CK Žďárská et al., Plant Physiology, 2012 □Transcriptional vs post-transcriptional type of regulations FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development Shoot- and Root-Specificity of Proteome Response to CK SHOOT Carbohydrate Metabolism Žďárská et al., Plant Physiology, 2012 FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development Shoot- and Root-Specificity of Proteome Response to CK SHOOT Carbohydrate Metabolism Žďárská et al., Plant Physiology, 2012 FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development Shoot and Root Specificity of CK Response ROOT Protein Synthesis and Destination Žďárská et al., Plant Physiology, 2012 FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development Shoot and Root Specificity of CK Response ROOT Protein Synthesis and Destination Žďárská et al., Plant Physiology, 2012 FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development Shoot and Root Specificity of CK Response Hormonal Metabolism Žďárská et al., Plant Physiology, 2012 FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development Shoot and Root Specificity of CK Response SHOOT: MAV pathway ROOT: C2H4 Žďárská et al., Plant Physiology, 2012 Hormonal Metabolism FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development Shoot and Root Specificity of CK Response Endogenous Hormone Levels Žďárská et al., Plant Physiology, 2012 FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development Ethylene in the RAM Development Žďárská et al., Plant Physiology, 2012 Ruzicka et al., Plant Cell, 2007 Ruzicka et al., PNAS, 2009 FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development CK/Ethylene Crosstalk in the RAM C2H4 ? C2H4 ? Perilli et al., Curr. Biol. 2010 FGP_logo LMFR_con Signaling and Hormonal Regulation of Plant Development Shoot and Root Specificity of CK Response Žďárská et al., Plant Physiology, 2012 Marketa_Z.jpg Pavla_K.jpg Logo1me C8202 Základy proteomiky Proč právě proteomika? §exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů Základy proteomiky 2012 §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět §Přístupy současné proteomiky §analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů §diferenční proteomika §analýza posttranslačních modifikací Logo1me C8202 Základy proteomiky Analýza posttranslačních modifikací § §pomocí specifických metod lze identifikovat kotranslační a posttransalční modifikace, buď v gelu nebo po blotování na membránu (barvení spec. barvičkami) § Přístupy současné proteomiky analýza posttrranslačních modifikací §fosforylace Pro-Q Diamond SYPRO Ruby §přenos signálu §regulace chromatinových strruktur a transkripční aktivity prostřednictvím regulace vazby histonů §velice heterogenní (aktivátor plasminogenu 3 místa pro glykosylaci na N-konci, až 11. 520 možných izoforem) §acetylace §glykosylace •mikroheterogenita díky velkému množství různých cukerných zbytků, které se mohou vázat na jednu ak. •makroheterogenita díky rozdílům v přítomnosti různých cukrů na různých ak. na různém počtu kopií daného proteinu §identifikace modifikací pomocí MS technik (MALDI TOF, ESI-MS, …) Logo1me C8202 Základy proteomiky Proč právě proteomika? §exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů Základy proteomiky 2012 shrnutí §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět §Přístupy současné proteomiky §analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů §diferenční proteomika §analýza posttranslačních modifikací