Winter  School  on  Structural  Cell  Biology   Prac%cal  course  on  liquid  NMR  spectroscopy  of  proteins     Learning  about  the  hardware  –    20-­‐30  minutes   A)  NMR  Spectrometer   1)  Magnet   2)  Console   3)  Probehead   i.  Cryoprobe  vs.  room  temperature   ii.  TXI  vs.  TXO   iii.  1H,  13C,  15N,  19F,  31P   4)  Tubes   i.  3  mm     ii.  5  mm   iii.  Shigemmi   iv.  1.7  mm,  10  mm,  shaped  tube   B)  Before  the  measurement  –      15-­‐20  minutes   ⇒ get  to  know  as  much  about  the  sample  as  possible   1)  Op%mal  temperature   2)  Salinity   3)  Concentra%on   4)  Buffer  (phosphate,  Tris,  Hepes  etc.)   5)  Solvent  for  lock  (D2O  vs.  H2O/D2O  90/10)   6)  Isotopes  that  can  be  measured  (what  has  been  labeled   i.  1H   ii.  15N  only   iii.  13C+15N   iv.  Specific  labeling  (ILV  –  Ile-­‐Leu-­‐Val)   C)  Preparing  the  sample  –      10-­‐15  minutes   1)  Measure  the  pH  of  the  sample   2)  Transfer  the  sample  into  the  NMR  tube   3)  Spin  the  tube  (op%onal)  in  the  hand-­‐driven  centrifuge   4)  Check  the  difference  between  the  rotors   i.  White  (5  mm  /  3  mm)  ~21  g   ii.  Blue  ~  14.5  g   iii.  Porcelain  –  for  high  temp.   iv.  1.7  mm  rotor  (curiosity)   v.  Shaped  tube  rotor  –  for  salty  samples  (see  the  posi%oning  )   5)  Adjust  the  rotor  posi%on  with  the  tube  in  the  gauge       1  –  Menu/submenu  bar   2  –  Windows  navigator   3  –  Toolbar   4  –  Browser   5  –  Data/window  area   6  –  Command  line   7–  Status  panel   5   2   3   4   1   7   6   Topspin  3.X  –  layout   descripKon   Right  mouse  click  in  the   status  bar  area  toggles  it   on/off   1  –  Menu  bar   2  –  Windows  navigator   3  –  Toolbar   4  –  Browser   5  –  Data/window  area   6  –  Command  line   7–  Status  panel   5   2   3   4   1   7   6   Topspin  3.X  –  layout   descripKon   •  Prior  any  manipula%on  with  the  spectrometer  or  TopSpin,   check  the  status  panel  first  –  namely,  what  is  the   acquisi%on  status,  temperature  and  what  is  the  lock  signal   status.   •  In  case  there  is  a  sample  of  your  colleague  s%ll  in  the   magnet,  take  it  out  from  the  magnet  (vide  infra)  and  take   best  care  about  the  sample.   Sample  status:                                      down                missing                                          up   •  To  eject  the  sample  from  the  magnet  –   assure  yourself  there  is  no  acquisi%on   running,  the  lock  is  off  (no  straight  line  is   sweeping  the  lock  window  but  dispersive   sinusoidal  curves  can  be  seen  in  the  lower   area  of  the  lock  window  –  see  the  figure  on   the  right)  and  there  is  no  mechanical   obstacle  that  could  prevent  sample  ejec%on.   Then  either  type  ej  on  the  cl  or  use  the  BSMS   window  to  manipulate  with  the  lib.   EjecKng  the  sample   •  In  the  Main  panel  of  the  window  B  (BSMS  window  –  Bruker  Smart  Matching  /Shimming   system),  click  Sample  -­‐  Lib    for  turning  on  the  airflow  (budon  turns  green)   •  Sample  mail  will  be  set  in  ac%on  and  brings  the  sample  down   •  Spectrometers  that  have  no  sample  mail  will  announce  the  sample  ejec%on  by  increased   airflow  and  sample  „dancing“  on  the  top  of  the  magnet.  In  this  case,  aber  removing  the   sample  from  the  magnet,  do  not  forget  to  switch  off  the  airflow  by  clicking  the  Lib   budon  once  again  (turns  grey)   Temperature  control   •  Once  there  is  no  sample  in  the  magnet,  set  the  temperature  you  want  for   your  sample/measurement  –  this  is  done  by  opening  the  Temperature   control  window.  This  can  be  done  by  i)  double  click  the  Sample   Temperature  window  in  the  status  panel,  ii)  type  edte  in  the  command  line   (cl).  This  will  open  new  window  called  T.  Set  the  temperature  and  in  the   monitoring  tab  check  first  four  check-­‐boxes  and  control  the  progress  of   temperature.  As  soon  as  the  temperature  is  stabilized,  you  may  insert  your   sample  into  the  magnet.   Sample/tube  handling   •  Inser%ng  the  tube  into  the  spinner     –  Do  not  push  the  tube  straight   down  the  spinner,  the  tube  may   break  down   –  Screw  the  tube  slowly  into  the   spinner  and  at  the  same  %me   gently  push  the  spinner  upward   the  tube   •  Adjus%ng/centering  the  tube  in  the  spinner   –  Put  the  tube  with  the  spinner   into  a  depth  gauge  and  screw   the  tube  un%l  the  length  of  the   sample  is  symmetrical  around   the  middle  line  crossing  the  coil-­‐ represen%ng  boxes   InserKng  the  sample   •  Aber  the  desired  temperature  is  reached,  in  the  Main  panel  of  the  window  B   (BSMS  window  –  Bruker  Smart  Magnet  System),  click  (skip  this  in  case  of  sample   mail)  Sample  -­‐  Lib    for  turning  on  the  airflow  (budon  turns  green)   •  Place  the  sample  either  into  the  sample  mail  or  on  the  top  of  the  magnet  bore   when  „maximum“  airflow  is  reached   •  Turn  off  the  airflow  by  clicking  the  Lib  budon  again  (goes  gray  again)   •  For  the  magnets  equipped  with        sample  mail,  place  the  spinner  with        the  tube  into  the  sample  rack  and  close  it   •  Wait  un%l  the  sample  is  posi%oned          in  the  probe   Windows  navigator   •  Window  B   –  represents  BSMS  display,  called  by  command  bsmsdisp;  provides  info   about  lock,  field,  shim-­‐control,  etc.   •  Window  T     –  temperature  control  window;  called  by  edte   •  Window  L     –  lock-­‐level  window,  called  by  lockdisp   •  Numbered  windows   –  Spectra,  leb  poin%ng  triangle  indicates  window  with  acquisi%on  in   progress  or  in  no  acquisi%on  running,  where  was  is  running.       As  most  of  the  above  windows  are  needed  every  %me  one  is  measuring  and   typing  the  commands  to  open  them  up  is  boring  and  %mewas%ng,  one  may   write  a  macro  to  open  these  with  on  command  (e.g.  kk,  ‚edmac  kk‘  to  see   details)     Locking  the  magneKc  field   •  Locking  on  the  reference  nuclei  (deuterium)   •  Once  the  sample  is  in  the  magnet  (check  Sample  status  icon  on  status   bar,  status  LED  of  the  sample  mail  etc.),  usually  lock  signal  appears  as   red/green  signal  in  dispersion  mode.  In  case  you  do  not  see  that  line  –   it  may  indicate  that  previous  user  was  using  different  deuterated   solvent  or  there  is  no  2H  in  your  sample   •  Type  lock  on  the  cl     Locking  the  magneKc  field   •  Table  with  solvents  will  pop  up   •  Select  the  right  solvent  from  the  table  and  click  the  OK-­‐budon  or  double   click  the  solvent  of  choice     Homogeneity  of  the  field   Adjus%ng  homogeneity  of  the  magne%c  field  –  as  the  more   homogeneous  magne%c  field  results  in  a  narrower  lock   signal  which  results  in  a  higher  d.c.  voltage,  one  aims  for  an   op%mum  lock  signal  by  adjus%ng  various  shim  currents   •  Should  you  be  brave  and  experienced  enough,  do  it   manually  in  the  BSMS  display  via  the  Shim  tab  or   (recommended)  use  the  topshim  op%on   •  Type  topshim  on  the  cl  –  runs  automa%c  1D  shimming   •  Once  the  topshim  finished  switch  on  the  the  Autoshim   in  the  Autoshim  tab   •  As  there  may  be  needed  to  adjust  the  lock  phase,  lock   gain  and  other  parameters,  type  loopadj  on  the  cl   (op%mizes  lock  phase,  lock  gain,  loop  phase,  ...)  which   will  take  care  about  all  of  it.  In  case  there  is  sufficient   lock  signal,  menu  with  three  lines  will  appear  to  confirm   everything  went  smoothly  and  was  set  up.  Should  there   be  low  lock  signal,  error  message  will  appear.   SelecKng  the  nuclei   •  Prior  star%ng  any  set  up,  pulse  checks  or  measurements,  make  sure  the  channel  rou%ng  is   correct  and  all  the  channels  that  are  going  to  be  measured  are  ac%ve.   •  To  do  so,  type  edasp  on  the  cl   •  set  the  desired    nuclei  from  the  pop-­‐up  menus:  typically  channel  1  –  1H,  channel  2  -­‐  13C,   channel  3  –  15N   •  Click  on  Default  to  set  proper  rou%ng   for  the  channels  and  Save  and  Close   the  seongs.   Tunning  and  matching  the  probe   –  For  obtaining  op%mal  signal-­‐to-­‐noise  ra%o,  one  needs  to  tune  the  probe  with   the  sample  inserted.  It  is  done  by  adjus%ng  two  mutually  interac%ve   capacitors.  One  tunes  the  circuit  to  the  desired  resonance  frequency  (tuning)   and  the  other  matches  the  impedance  (matching).  Tuning/Matching  can  be   achieved  either  manually  directly  on  the  probehead  that  is  NOT  equipped   with  ATM  unit  or  automa%cally  from  a  PC  in  case  the  probehead  IS  equipped   with  the  ATM  unit.    Automa%c  Tuning/Matching  Automa%cally  (atma)   –  Start  with  atma  (AutoTuneMatchAuto)on  the  cl  –  typically,  this  will  tune  the   probehead  automa%cally  without  any  human  interven%on   –  Once  atma  is  done,  it  is  recommended  to  check  the  tuning  manually   –  Type  atmm  (Automa%c  Tuning/Matching  Manual)  on  the  cl  –  window  with  a   black  wobbling  curve  that  needs  to  be  buned  to  the  minimum  indicated  by   ver%cal  red  line  is  opened   –  The  precision  of  the  displayed  curve  is  driven  by  wobble  sweep  width.  Set  it   prior  wobbling  by  command  wbsw  on  the  cl  to  2  MHz  or  click  wbsw  icon  and   set  it  there.   –  N.B.  Some%mes  the  atmm  gets  stuck  when  trying  to  change  the  sweep  width.   Using  of    following  command  and  its  op%on  atmm  manwbsw  has  proven  to   improve  the  wobble  behavior.  Again,  create  own  macro  or  use  wkk.   Tunning  and  matching  the  probe   –  While  tuning  the  probehead  „manually  “  with  atmm,  keep  an  eye  on  the  lock-­‐ level  signal.  It  may  drop  significantly  during  the  tuning  so  once  finished,  run   topshim  once  again.  Typically  one  is  tuning  the  channels  star%ng  at  lowest   frequency  (typically,  15N  followed  by  13C  and  then  1H)  but  in  case  of  (cryo)-­‐ probeheads  with  a  new  design  (lock  signal  is  dropping  while  tuning/matching)   are  supposed  to  be  tuned  from  highest  frequencies  down  (i.e.  1H-­‐>13C-­‐>15N).   In  any  case,  check  the  tuning  curve  of  a  given  nuclei  itera%vely.   –  Tune/match  each  channel  star%ng  from  the  nuclei  with  the  lowest  frequency   (on  the  850/950MHz  spectrometers  in  reversed  order)   –  Adjust  the  displayed  sweep  width  (parameter  WBSW  (wobble  sweep  width)  in   the  upper  right  corner,  vide  infra)   –  Get  the  minimum  of  the  curve  to  required  posi%on  by  clicking  the  arrows  that   represent  expected  step  of  the  tune/match   –  Start  with  matching  (get  the  minimum  to  the  bodom),  then  tune  (center  the   minimum  on  the  reference  line).  As  tune/match  are  interconnected,  the   procedure  becomes  itera%ve  but  op%mum  has  to  be  always  reached.   –  For  samples  with  high  salt  [c(NaCl)>=250~300mM],  use  either  shaped  NMR-­‐ tube  or  3mm  tube.  Both  tubes  require  special  rotors  and  extremely  gentle   handling!   CreaKng  a  dataset   •  Steps  involving  edasp  and  atma/atmm  require  an  exis%ng  dataset.  Each  user   typically  keeps  in  his  data-­‐tree  directory  Setup/Calibra%on  or  something   similar.  In  those  dataset  one  usually  doesn‘t  change  more  than  power-­‐levels,   (de)ac%vates  nuclei  but  not  much  more  ...   •  If  one  wants  to  create  a  dataset,  there  are  several  ways  to  do  it   •  Copy  an  exis%ng  dataset   •  Select  a  dataset  that  was  working  previously  ideally  by  clicking  right   budon  in  the  browser  and  open  a  s  a  new  window.  Oben,  different   set  is  selected  in  browser  and  different  in  the  window.  Always  check   which  spectrum  you  are  working  with!!!   CreaKng  a  dataset   •  Once  being  in  the  right  dataset,  type  edc  on  cl  and  set  the  new   des%na%on  of  the  experiment,  experimental  number,  %tle,  user  ...   •  In  case  dataset  should  be  copied  to  the  next  ExpNo,  use  command   iexpno  which  will  copy  the  dataset  to  next  ExpNo                       •  If  crea%ng  a  new  dataset,  type  rpar  on  cl  to  read  standard  dataset  parameters  of  a   required  pulse  sequence     •  Type  getprosol  on  cl  to  set  actual  pulse  calibra%on.  Should  calibra%on  of  any  nuclei   vary  from  the  standard  ones  (typically  1H),  type  getprosol  1H  13.55  13W  which   means  that  90°  1H  pulse  is  13.55µs@13W  taken  as  reference.   •  Modify  the  rest  of  the  parameters  in  AcquPars  in  Data  area  (TD  –  number  of  points   collected  during  FID,  DS  –  number  of  dummy  scans,  NS  –  number  of  scans,  SW  –   spectral  width,  O1P  –  carrier  frequency,  ...)   CalibraKon  of  90⁰  1H  pulse   –  Automa%c  calibra%on   •  Type  pulsecal  on  cl  –  info-­‐panel  will  pop-­‐up  with  the  length  and  power  of  90⁰  pulse.  The   parameters  will  be  also  automa%cally  updated  within  the  dataset   •  Pulsecal  gives  results  reasonable  enough  to  use  them  for  nD  experiments  or  to  use  them  as  a   star%ng  point  for  manual  calibra%on     –  Manual  calibra%on   •  Type  p1  on  cl,  set  the  pulse  length  1  μs  and  type  zgqfp.  This  will  run  a  macro  that  is   composed  of  zg  (zero  go  -­‐  start  an  experiment),  qsin  (mul%ply  resul%ng  FID  with  QSINE   window  func%on)  and  fp  (perform  Fourier  transforma%on  with  phase  correc%on).   Alterna%vely  zgefp  does  the  same  but  instead  of  qsine  exponen%al  window  func%on  is  used   for  FID  apodiza%on.   •  Water-­‐line  signal  will  appear  at  about  ~4.7  ppm.  Phase  the  line  to  pure  absorp%ve  line  either   manually  through  Process  menu  and  manual  phase  adjus%ng.  Phasing  window    can  also   invoked  by  typing  .ph.  If  there  are  few  signals  in  the  spectrum  automa%c  phase  correc%on  –   apk  command  will  work  well.  Check  also  symmetry  of  the  signal  and/or  any  abnormali%es  of   the  line-­‐shape.  Also  measure  the  LWHH  to  get  an  es%mate  about  the  quality  of  the   shimming.   •  Proton  hard  pulse  (90°or  π/2)  is  strongly  dependent  on  the  tube  diameter,  salt   concentra%on,  temperature  and  solvent  used.  The  pulse-­‐length  can  be  as  short  as  8µs  but   can  reach  ~17µs  for  high  salt  samples.  As  the  90°pulse  is  usually  determined  by  measuring   the  360°  since  the  pulse  gives  a  minimum  signal,  type  p1  on  cl  and  set  it  to  four  %mes  the   expected  length  of  90⁰  1H  hard  pulse  (i.e.  32  to  68µs).  From  the  knowledge  of  sine-­‐func%on   one  can  easily  guess  whether  the  signal  is  longer  360°or  shorter.   •  Once  minimum  in  360°  is  achieved,  take  one  fourth  the  length  of  the  pulse  that  gave  a  zero   signal  to  obtain  length  for  the  90⁰  pulse.   p1   dura%on   CalibraKon  of  90⁰  1H  pulse   Another  op%on  how  to  calibrate  pulse  in  to  use  command  paropt,   which  will  pop-­‐up  a  window  where  one  sets  up  ini%al  value  [of  the   pulse],  increment,  and  number  of  increments.  Result  of  such   paropt  will  provide  similar  output  (ini%al  value:  1µs,  increment:1µs,   number  of  increments:  50).    OpKmizing  acquisiKon  parameters   – Before  star%ng  any  acquisi%on,  it  is  wise  to  check  whether  all  parameters  are  at  their   op%mum  or  can  be  further  improved.  For  the  sake  of  op%miza%on  there  is  command  gs  (go   scan)  that  will  run  an  “infinite”  loop  enabling  real-­‐%me  manipula%on  with  pulse-­‐lengths,   delays,  receiver  gain  etc.  Immediate  impact  on  the  FID  is  observed.   –  Start  with  op%mizing  receiver  gain  –  either  by  typing  rga  prior  running  gs  or  manually  %ll  ADC   overflow  disappears   – The  parameters  can  be  adjusted  by:   •  dragging  the  slider  (not  recommended)   •  directly  typing  desired  value   •  clicking  on  the  slider-­‐scale   (clicking  will  be  affected  by  the  sensi%vity)     OpKmizing  acquisiKon  parameters   –  Other  parameters  that  could  be  set  are  the  exact  posi%on  of  receiver  (Offset-­‐tab),   phase  correc%on  (par%cularly  in  case  of  WATERGATE  water  suppression;   CorPhase)  and  dura%on  of  calculated  shaped  pulses  (Pulse-­‐tab).   –  Always  check  the  Warning  message  and  FIDAREA  which  one  wants  to  reach  as   low  as  possible  as  the  signal  in  biomolecular  samples  is  dominated  by  water   which  is  supposed  to  be  efficiently  suppressed.   Start  of  the  experiment   •  Dura%on  of  the  experiment   –  Type  expt  (experimental  %me)  –  gives  the  experimental  %me,  required  space  on  disc   for  the  current  dataset   –  Type  mulKexpt  –  allows  to  es%mate  dura%on  of  mul%ple  experiments  that  are  in  row   (e.g.  ExpNos  1,  2,  3,  4  ...).  Returns  the  %me  and  date,  when  the  experiments  are   finished.   •  Running  the  experiment   –  Type  zgqfp  –  starts  and  processes  1D  experiment  (composite  macro  of  zg+qsin+fp)  –  in   case  of  low  concentrated  samples,  one  set  number  of  scans  as  high  as  128  or  even   1024.  As  such  experiment  takes  already  a  significant  amount  of  %me,  it  is  wise  to   check  whether  something  is  being  acquired.  Either  check  the  on-­‐line  Fourier  transform   in  the  acquisi%on  window  or  type  tr  to  transfer  the  so  far  acquired  data  from   spectrometer  to  computer  and  process  them  with  efp  or  qsin+fp.     –  Type  zg  –  starts  the  experiment  without  processing  it   –  Type  stop  –  immediately  stops  the  experiment   –  Type  halt  –  stops  the  experiment  aber  the  current  scan       Start  of  the  experiment   •  In  case  of  an  nD  experiment  follow  the  same  steps  as  in  case  of  1D,  i.e.  first   set  all  parameters  properly  and  check  with  gs-­‐command  that  everything  is   correct  and  is  not  hur%ng  sample/probe.  Before  typing  zg,  check  the  dura%on   with  expt  or  mul%expt  to  see  when  the  experiment  is  going  to  finish.   •  When  the  experiment  is  started  with  the  zg-­‐command,  wait  %ll  the  first  FID  is   acquired.  In  the  mean-­‐%me  check  that  the  temperature  and  lock  are  stable   and  not  affected  by  the  running  experiment.   •  Once  first  FID  measured  and  stored,  type  rser  1,  which  will  transfer  the  first   FID  to  ~TEMP  directory  ExpNo  1,  ProcNo  1.  Process  the  FID  with  qsin+fp  and   phase  it.  This  will  give  you  a  rough  informa%on  about  signal/noise  ra%o  of   your  experiment  –  if  there  is  no  signal  in  the  firs  row,  there  will  be  not  much   signal  at  the  end  of  the  experiment  (excep%ons  are,  e.g.  HNCACB  or  DQF   COSY,  but  these  are  not  experiments  for  beginners:-­‐).   Start  of  the  experiment   •  Should  it  be  possible  to  compare  the  running  experiment    with  previous   dataset,  store  the  current  ProcNo  to  ProcNo  2  by  typing  wrp  2  y  –  write   ProcNo  to  2  and  if  there  is  already  ProcNo  2,  yes,  overwrite  it.  Then  go  to  the   previous/reference  experiment,  type  again  rser  1;  qsin;  fp,  phase  the   spectrum.  Type  .md  or  click  the  mul%ple  icon  and  then  type  rep  2  –  read   ProcNo  2.  Of  course  one  can  do  all  the  overlay  with  mouse  only  but  the   clicking  may  be  more  %me  consuming  as  the  directory  gets  filled  with   experiments  and  ~TEMP  remains  at  the  top  (scrolling  up,  double-­‐clicks  …,   keyboard  is  keyboard:-­‐).   Quick  reference:   1)  bsmsdisp  –  open  control  panel   2)  ej  –  eject  sample   3)  edte  –  open  temperature  control  panel   4)  ij  –  inject  sample   5)  lockdisp  –  display  lock  window   6)  lock  –  select  solvent  for  locking  the  magnet   7)  topshim  –  automa%c  shimming   8)  loopadj  –  adjust  lock  parameters   9)  edasp  –  set  up  spectrometer  rou%ng   10)  wbsw  –  set  up  wobble  sweep  width   11)  atma  –  automa%c  tuning/matching   12)  atmm  –  manual  -­‐-­‐-­‐-­‐-­‐”-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐   13)  edc  –  copy  dataset   14)  iexpno  –  copy  dataset  to  next  ExpNo   15)  rpar  –  read  parameter  set   16)  getprosol  –  set  up  pulses  according  to  prosol   17)  pulsecal  -­‐  calibrate  1H  90°  pulse   18)  paropt  –  op%mize  parameter  (e.g.,  p1  length)   19)  rga  –  automa%cally  set  up  receiver  gain     20)  gs  –  go  scan  –  op%mize  acquisi%on  parameters   21)  expt  –  es%mate  dura%on  of  the  experiment   22)  mul%expt  -­‐  -­‐-­‐-­‐-­‐”-­‐-­‐-­‐-­‐  for  mul%ple  expts  in  row   23)  zg  –  start  acquisi%on   24)  zgqfp  –  acquire  1D  and  apply  qsin  apodiza%on   25)  qsin  –  mul%ply  FID  with  qsin  window  func%on   26)  x€  –  process  2D   27)  x€  n  –  process  2D  and  remove  2ri,  2ir,  2ii   28)  tr  –  transfer  data  1D  from  spectrometer  to  PC   29)  edmac  name  –  create  or  edit  macro  name   30)  wrp  2  y  –  write  processed  data  to  ProcNo  2  and   if  exists,  overwrite   31)  rser  1  –  extract  first  FID  of  an  nD  experiment   32)  .ph  –  start  phase  menu   33)  .md  –  spectra  overlay  window   34)  apk  –  automa%c  phase  correc%on   35)  show  –  show  ac%ve  processes   36)  curplot  –  set  up  printer   37)  print  –  print  spectrum   38)  acqu  –  switch  to  acquisi%on  window   39)  ii  –  if  spectrometer  doesn’t  communicate   40)  ii  restart  –  if  ii  doesn’t  help   41)  stop  –  stop  immediately  acquisi%on,  rough   42)  halt  –  stop  it  smoothly,  recommended   43)  pulse  –  calculate  pulse  length  based  on  90°hard   pulse  parameters   44)  calcpowlev  –  similar  to  pulse   Measurements:   1)  zg  –  1D  1H  check  shimming  =>  water  line  shape  -­‐      15  minutes   2)  zgpr  –  1D  1H  with  water  presatura%on      10  minutes   a.  pulsecal b.  gs  –  op%mize     c.  rg  –  receiver  gain   d.  o1  –  carrier  posi%on   e.  PLdB9  –  water  presatura%on  pulse   3)  z  or  zg  or  zgqfp 4)  rpar zggpwg –  read  parameters  for  1D  1H  with  water  presatura%on  using   WATERGATE  pulse  scheme            20  minutes   a.  pulsecal b.  gs  –  op%mize   c.  sp1  –  decrease  the  FID  area   d.  Corphase  2  –  using  the  real  %me  FT  try  to  get  water  signal  in  an%phase   e.  rga 5)  Measure  1D  1H   2D  NMR  Measurements:     1)  15N  HSQC   a.  100-­‐140ppm  in  15N            25  minutes   b.  80-­‐140  ppm  in  15N          30  minutes   2)  13C  HSQC   a.  0-­‐80ppm  in  13C    -­‐  alipha%c  region    20  minutes   b.  100-­‐140ppm  in  13C  -­‐  aroma%c  region  10  minutes   c.  ctHSQC  –  alipha%c  with  d23  13.3  ms  15  minutes   Time  Table  overview   Time  [minutes]   Task   Note   20-­‐30   NMR  Hardware   15-­‐20   Sample  Introduc%on   10-­‐15   Sample  Prepara%on   15-­‐45   TopSpin   15   1D  1H  zg   10   1D  1H  zgpr   Presatura%on   20   1D  1H  zggpwg   WATERGATE   10-­‐20   Break   25   15N  HSQC   Amides+NH2  sc   30   15N  HSQC   Amides+NH2+Arg  NHs   20   13C  HSQC   Alipha%c   10   13C  HSQC   Aroma%c   15   13C  ctHSQC   205-­‐255   Without  break   Recommended  literature:   1)  John  Cavanagh,  Wayne  J.  Fairbrother,  Arthur  G.  Palmer  III,  Mark  Rance,  Nicholas  J.   Skelton:  Protein  NMR  Spectroscopy,  2nd  Edi9on:  Principles  and  Prac9ce,  2005,   Academic  Press   2)  Stefan  Berger,  Siegmar  Braun:  200  and  More  NMR  Experiments:  A  Prac9cal  Course     2004,  Wiley-­‐VCH   3)  Kurt  Wüthrich:  NMR  of  Proteins  and  Nucleic  Acids,  1986,  Wiley  –  Interscience   4)  Gordon  C.  K.  Roberts:  NMR  of  Macromolecules:  A  Prac9cal  Approach  (Prac9cal   Approach  Series),  1993