Lecture 3:  Sample Preparation 1. Traditional Thin Section Techniques 2. Staining / Shadowing Techniques 3. Plunge Freezing Techniques 4. High Pressure Freezing Techniques 5. Focus-Ion-Beam Milling Techniques HOW TO PRESERVE A BIOLOGICAL SAMPLE IN HIGH VACUUM ?? Sample Preparation Techniques Biological sample Pilhofer et. al (2010) Methods Cell Biol. 96, 21 Thin Sectioning Techniques A. Chemical fixation (aldehydes, osmium) B. Sample dehydration (EtOH, acetone) C. Plastic embedment (epon) D. Sectioning (ultramicrotome) E. Staining (uranyl acetate, lead citrate) Chemical Fixation Chemical fixatives: a) Coagulators : cause protein denaturation and  aggregation (MetOH, EtOH, HCl) b) Non‐coagulators:  polymerization of macromolecules (aldehydes, osmium oxide) Factors affecting fixation: ‐ fixative reagent and sample size ‐ fixation procedure (fixative concentration, additives) ‐ external conditions (pH, temperature, duration, osmosity) 1) Primary aldehyde fixation (proteins, nucleic acids): 1‐3% solution 2) Secondary OsO4 fixation (membranes, proteins): 1‐2% solution Dehydration and Plastic Embedding DEHYDRATION:  successive washing with 30, 50, 70, 80, 90, 95% solutions EtOH: most common, least extraction of cellular material reactive with OsO4, immiscible with epoxy resins Acetone: more extraction of cellular material than EtOH less shrinking artifacts, miscible with epoxy resins Common artifacts due to dehydration: ‐ extraction of proteins, lipids, etc.  ‐ sample shrinking up to 40 % ‐ formation of various precipitates Plastic Embedding:  epoxy, acryl or polyester resins Penetration:        successive washes with incresing concentrations of resin Polymerization:   initiated by heat (60°C), UV radiation, catalysts NB:  ultrastructure observed in EM is highly affected by the choice of resin !!!  Ultramicrotomy / Sectioning 1) Initial trimming of the plastic block 2) Initial slicing of 500 nm sections 3) Thin sectioning of 50‐100 nm sections 4) Recovery of sections and transfer to EM Ultramicrotomy / Sectioning 1) Initial triming of the plastic block 2) Slicing intial 500 nm sections 3) Thin sectioning of 50‐100 nm sections 4) Recovery of sections and transfer to EM Staining and Immuno‐labeling Staining: a) uranyl acetate in alcohol solution: staining of proteins and nucleic acids b) lead citrate in aqueous solution: staining of membranes and lipids Immuno‐labeling: a) pre‐embedding protocols (labeling of 50‐um sections before fixation) b) post‐embedding protocols (thin sections on a EM grid before staining) Mouse melanocytes labeled for copper transporter  ATP7A (PAG 15 nm) and Tyrp 1 (PAG 10 nm) Negative Staining of Proteins electrons • sample is embedded in a layer of heavy metal salts • reveals overall shape and solvent excluded surface Negative Staining of Proteins Challenges: even and uniform layer of stain good adsorption of sample to carbon stability of the protein sample Advantages: quick method to screen sample conditions very high amplitude contrast stain protects the sample from beam damage Disadvantages: limited resolution due to stain grain size (20 Å) flattening and denaturation of proteins uneven staining  complicates image processing Typical stains: uranyl acetate (stable, high contrast, pH 4) uranyl formate (fine grain, precipitates, pH 4) ammonium molybdate (neutral pH, unstable) phosphorus tungstate (neutral pH, fine grain) Negative Staining of Proteins Ohi, Cheng, Walz (2004) Metal Shadowing DNA + RNA polymerase Annu. Rev.  Biophys. Bioeng. (1978) 7, 19 Pt shadowing Principle of rotary shadowing Trendelenburg, MF et al, Histochem. Cell Biol. (1996) 106, 167 Transcribed DNA gene Cryo Plunging Techniques • Sample is rapidly frozen in buffer => direct imaging in near‐native conditions • Amorphous water prevents sample damage and is transparent to electrons • Vitrification is a fast (10‐4 s) process => freezing rates of 105‐106 K/s • Liquid nitrogen is not suitable due to low heat conductivity => ethane • Aqueous samples are properly frozen only up to 1 um thickness • Plunge freezing using automated or manual plungers Cryo Plunging Techniques Sample on the EM grid is blotted to  thin layer of solution in a Vitrobot … Sample on the EM grid is blotted to a thin layer of solution using a Vitrobot … e– e– e– 2D projections with all 3D information 200nm … and plunged into liquid ethane. The  sample is vitrified in amorphous ice. Cryo Plunging Techniques Ice thickness Extrusion of particles from thin ice Denaturation at water‐air interface Cryo Plunging Techniques Defitrification Cryo Plunging Techniques Grid hydrophilicity Types of EM grids EM grid material: copper, gold, molybdenum Mesh sizes: 200, 300, 400 grid‐bars per inch Support film: continuous carbon, graphene, gold Support film: C‐flat, Quantifoil, lacey, holey Hole size: 1‐2 um Cryo Plunging Techniques Challenges: prevent devitrification at increased tempartures avoid ice contamination during transfers prepare grids with the right ice thickness Optimization: sample concentration on the grid minimize preferred orientations ice thickness and quality Advantages: sample is preserved in hydrated state internal structures are imaged high resolution information is preserved Disadvantages: low dose imaging due to radiation damage low signal‐to‐noise ratio in images laborious and prone for error only few samples can be examined a day High Pressure Freezing Techniques • High pressure freezing and freeze substitution • High pressure freezing and cryo‐ultramicrotomy Freezing in 20 ms at 2000 bars (samples up to 200 um) High Pressure Freezing Techniques • Freezing cell tissue at high pressure in liquid nitrogen • Dehydration of frozen sample at low temperatures • Plastic embedding at room temperature • Staining at room temperature High Pressure Freezing Techniques Freeze substitution (below ‐70°C) • reduced ultra‐structural changes due to dehydration as seen at room temperature • fixatives are evenly distributed before crosslinking occurs at elevated temperatures • embedding at low temperature may better preserve epitopes for immunolabeling Typical freeze substitution protocol • 1% osmium oxide in anhydrous aceton at ‐90°C substituted for 3 days • 0.1–0.5% gluteraldehyde in acetone at ‐90°C substituted for 3 days • warm to room temperature and rinse with acetone • plastic embedding at room temperature using standard protocols CEMOVIS Advantages:   no chemicals or fixatives imaging of unstained structures Artifacts:  compression, crevasses Cryo‐sectioning of high‐pressure frozen samples vitreous section of yeast cells (SEM and TEM) Cryo‐FIB Milling 11 22 33 Vitrified cells Lamella (FIB) Lamella (SEM) Golgi nucleus MT actin Authors: W. Baumeister, F. Bauerlein, J. Plitzko, A. Rigort, E. Villa (MPI-Biochemistry)