Ko-lokalizace a proximity ligation assay - Sekundární protilátky obsahují oligonukleotidy komplementární k olignukleotidům schopným tvořit kruhovou DNA – pouze pokud jsou sekundární protilátky blízko sebe (<16nm) - po ligaci může polymeráza obihat po kružnici ligace hybridizace polymerace/rolling circle •Přednáška 5.5.2015 od 15.00 v A11, 205 • •prof. A.R. Lehmann, FRS • •Xeroderma pigmentosum: in-depth molecular, cellular and clinical analysis of a DNA repair disorder. • • •přednáška 7.5. (10.00 v A2, 211) •Evoluce proteinů a proteinových komplexů - komplexy podílející se na replikaci DNA - komplexy účastnící se přepisu informace - komplexy opravující poškozenou DNA - komplexy vytvářející strukturu chromosomu - samotný chromosom je obrovským dynamickým nukleoproteinovým komplexem (nikoli holá DNA) REPLIKACE OPRAVA DNA Co zde schází?? Chromatin = histony … - komplexy podílející se na replikaci DNA - komplexy účastnící se přepisu informace - komplexy opravující poškozenou DNA cover popup TFIIB Rpb4/7 RNA pol II TFIIE TFIIF TFIIH kvasinkový PIC komplex Gibbons et al, PNAS, 2012 TBP TFIIA TRANSKRIPCE - Samotný chromosom je obrovským dynamickým nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi - DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými komplexy – (lidský genom 3x109bp – natažený řetězec 1chromosomu cca 4cm!!) - komplexy vytvářející strukturu chromosomu - vytváří základní strukturu - nukleosomy (histonový oktamer) a histony (H1) - HMG, HP proteiny - vytváří specializované domény - centromery, telomery - podílí se na dynamice struktury - kohesin, kondensin a SMC5-6 komplex chromosomy přednášky prof. Fajkuse: Struktura a funkce eukaryotických chromozomů (C9041) Nukleosom oktamer histonů H2A, H2B, H3, H4 histon fold komplexy vytvářející strukturu chromosomu Figure 4-72 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) figure 4-72 - 146bp – histon fold - centrální část DNA váže tetramer H3-H4 - okraje DNA vážou dimery H2A-H2B - 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice H3 (acetylovaný K56) Skládání histonů do nukleosomu (komplexu) - 146bp - centrální část DNA váže tetramer H3-H4 - H3 dimerizuje přes postraní šroubovici - okraje DNA vážou dimery H2A-H2B - 10bp konce DNA vážou šroubovice H3 (acetylovaný K56) - - - - Ransom et al, Cell, 2010 H3-H4 Figure 4-26 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) figure 4-26 Sestavování nukleozomu: - Silnější je interakce mezi H3-H4 - H3 dimerizuje přes postraní šroubovici a vytváří tetramer který asociuje s DNA - dimery H2A-H2B se vážou následně z obou stran tetrameru (H3-H4)2 - - - při uvolňování odpadají nejdříve dimery H2A-H2B - H2A a H3 existují ve více variantách, které mohou být zaměněny v nukleosomu Ransom et al, Cell, 2010 Nabalování a rozbalování histonů Histonové H3-H4 chaperony - Postupné sestavování (a uvolňování) histonů je zprostředkováno různými chaperony (+ ATP-dependent remodeling “stroji”) – „chaperony pro komplexy“ - ASF1 (antisilencing function, tetramerizace) => CAF1 (chromatin assambly factor, vazba k DNA) Ransom et al, Cell, 2010 Histon chaperony - replikace - na ssDNA nukleosomy nejsou: replikace, transkripce, oprava DNA ... - před těmito procesy se musí histony odstranit a poté zase nabalit … (feedback: inhibice chromatin assembly inhibuje disassembly nukleosomů) - 1. ASF1 (váže MCM a PCNA) a 2. CAF1 (assembly) pro H3-H4 disassembly a assembly 250-300bp – cca nukleosom H3K56Ac - histon chaperon komplex FACT (facilitates chromatin transcription) je složen ze 2 podjednotek (Spt16 a Pob3/SSRP1) - dimerizační část také interaguje s DNA-polymerásou (spojení s replikací) - rozeznává histon H2A-H2B heterodimer (interferuje s vazbou na DNA tzn. rozrušení vazby H2A-H2B s DNA) C:\Documents and Settings\Administrator\Desktop\New Folder\completed\nature12242-f1.2.jpg FACT komplex Hondele et al., Nature, 2013 disassembly a assembly - histon chaperon komplex FACT (facilitates chromatin transcription) je složen ze 2 podjednotek (Spt16 a Pob3/SSRP1) - dimerizační část také interaguje s DNA-polymerásou (spojení s replikací) - rozeznává histon H2A-H2B heterodimer (interferuje s vazbou na DNA tzn. rozrušení vazby H2A-H2B s DNA) C:\Documents and Settings\Administrator\Desktop\New Folder\completed\nature12242-f1.2.jpg FACT komplex Hondele et al., Nature, 2013 disassembly a assembly Histon chaperony - nově syntetizované H3 (replikace) jsou acetylované na K56 – jsou specificky rozeznávány a zainkorporovávány CAF-1 komplexem - acetylace K56 (šroubovice) interferuje s vazbou na DNA (cca 8x slabší) - pozice nukleosomu je náhodná a následně je „upravená“ pomocí remodelačních komplexů (a teprve poté je H3 K56 deacetylován a stabilizován) - pozdější acetylace (Gcn5-HAT) rozvolňuje nukleosomy v místech transkripce Figure 4-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) figure 4-41 Histonové varianty (u kvasinek gH2A fosforylovaný H2A) - možnost nově zabudovat histonové varianty pomocí chaperonů a remodelačních komplexů - nejznámější: CenH3/CENP-A (specificky v centromerách – ukotvení kinetochor – klíčový pro segregaci chromosomu) - H2A.X klíčový v opravě DNA - H2A.Z v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu Ransom et al, Cell, 2010 - poškozená DNA signalizuje/spouští „DNA damage checkpoint“ - kinasy - H2A.X varianta je fosforylována (v okolí poškození ~50kb během 15min; H2A u kvasinek) - po opravě poškození je gH2A.X vyměněn FACT komplexem za nefosforylovaný H2A.X (a H2A) - nefosforylovaný H2A.X je chráněn před FACT ribosylací (PARP1) - H2A.Z varianta je zainkorporována v okolí poškození (SWR a Chz1) a pomáhá resekci DNA - ukončení opravy je signalizováno až dokončením chromatinového vlákna Oprava poškozené DNA – H2A histony Tsabar & Haber, CO in GD, 2013 Oprava poškozené DNA - chromatin Upravené z Tatum & Li, 2011 - na ssDNA nukleosomy nejsou … oprava DNA - před těmito procesy se musí histony odstranit a poté zase nabalit … - pro malá poškození (NER, BER) postačí menší změny chromatinu zatímco pro větší (DSB - resekce DNA tj. vznik ssDNA) musí nukleosomy odstranit - NER (BER) doprovázeno acetylací histonů a remodelací (posuvem) - při DSB musí být odstraněny nukleosomy pomocí ASF1 a CAF-1, aby mohlo dojít k účinné resekci (patrně fyzicky spojené procesy) - po opravě poškozené DNA jsou nukleosomy uloženy zpět (díky interakci PCNA s ASF1 a CAF-1 – i zde je H3 K56 acetylován) - Sgs1/BLM interaguje s CAF-1 a reguluje jeho funkci - až kompletní reassembly chromatinu signalizuje dokončení opravy! - Billon a Cote, BBA, 2012 Bao a Shen, Snapshot in Cell, 2010 Remodelovací komplexy - ATP-dependentní remodelace (SWI2/SNF superrodina) - „sklouznutí“, rozložení, odstranění nukleosomu nebo „výměna“ histonových dimerů - SWR komplex specificky zaměňuje H2A-H2B dimer za H2A.Z-H2B bromodoména - H2A.Z - v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu (integrita centromer a telomer) - „sklouznutí“, rozložení, odstranění nukleosomu nebo „výměna“ histonových dimerů Bao a Shen, Snapshot in Cell, 2010 Modifikace histonů - acetylace rozvolňuje vazbu oktameru a zpřístupňuje sekvence DNA pro TBP - TFIID se váže na Ac-H4 (K8, K16) prostřednictvím bromodomény TAF1 proteinu Rothbart et al., BBA, 2014 NASP chaperon přidává histon H1 - nukleosom/H1 – další non-histon proteiny – chromatinové vlákno Vazba H1 uzavírá remodelaci chromatinu figure 4-54 Figure 4-54 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) figure 4-72 figure 4-20 Figure 4-20 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) mitotický interfázní SMC6 SMC5 - SMC jsou nezbytné pro vytváření chromatinových smyček - podílí se na regulaci segregace chromosomů a na opravě DSBs - složení SMC komplexů - dlouhá ramena SMC, dimerizace přes hinge, ATPase heads přemostěny ATP a kleisinovou podjednotkou - SMC proteiny vytváří kroužky, které drží DNA Komplexy SMC Složení: SMC dimery (homo- a hetero-) - konzervovanější (starší) než histony non-SMC podjednotky (2 – 6) Prokaryota Eukaryota (esenciální) homodimer 2x > Kohesin „objímá” DNA Haering et al, Mol Cell, 2002 SMC1 Scc1/Rad21 SMC3 Scc3 Použití fůzních proteinů při studiu kohese sesterských chromatid SMC3-Scc1-Frb + SMC1-FKBP12 (vážou rapamycin) Gruber et al., Cell, 2006 Uzamčení je pro buňku letální Full-size image (60 K) - loading přes hinge - exit přes head - Wpl1 destabilizuje Scc1-SMC3 Bonora et al, CO in GD, 2014 Kohesin interaguje s CTCF … - CTCF „izoluje“ transkripční faktory a reguluje trankripci - interaguje s kohesinem a podílí se na utváření vyšších chromatinových struktur Carlsten et al., TiBS, 2013 … a kohesin interaguje s mediatorem - mediator interaguje s GTFs a RNA polymerázou (zprostředkuje interakce mezi GTFs a aktivátory transkripce) - kohesin intergauje s mediátorem a napomáhá tvorbě transkripčních smyček Full-size image (52 K) Bodnar & Spector, Cell, 2013 Phillips-Cremins et al, Cell, 2013 Full-size image (43 K) -kohesin se podílí na regulaci „cell-specific“ transkripce a chromatinové struktury (ukazuje se jak úzký vztah mezi těmito úrovněmi existuje) -kombinace interakcí kohesinu s CTCF a mediátorem jsou klíčové pro „buněčnou specificitu“ Dynamika chromatinu Dr. Grobsky SMC6 SMC5 - SMC jsou nezbytné pro vytváření chromatinových smyček - podílí se na regulaci segregace chromosomů a na opravě DSBs - Kohesin vytváří jednak smyčky (transkripční) a jednak drží sesterské chromatidy při sobě - Kondensin spojuje dále smyčky k sobě (kondensuje chromatin …) 1. model segregace chromosomů (S. cerevisiae) APC=anaphase promoting complex Uhlmann et al., Nature, 1999 Komplex Mad2/Cdc20 inhibuje APC – po jeho uvolnění degraduje (ubiquityluje) sekurin – uvolní se tak separasa – štěpí Scc1 kleisin kohesinového komplexu Separasa-securin Zakari et al., WIREs Dev Biol, 2015 An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is fx1.jpg Yen et al., Cell, 2013 - SMC se podílí na dynamice chromatinu - jsou regulovány v průběhu buněčného cyklu Zakari et al., WIREs Dev Biol, 2015 image Yen et al., Cell, 2013 SMC6 SMC5 SMC komplexy napomáhají při opravě dvou-řetězcových zlomů v G2/M fázi Remeseiro & Losada, CO in Cell Biol, 2012 Mannini et al, Hum Mut, 2013 Remeseiro & Losada, CO in Cell Biol, 2012 Cuylen & Haering, Cell Stem Cell, 2010 mutace v mediatoru: mental retardation syndroms (FGS/Opitz-Kaveggia S., Lujan-Fryns S., schizophrenia) Kim Peek (Rain Man)