8.4.2016 1 Buněčné terapie a tkáňové inženýrství Jaroslav PETR VÚŽV Uhříněves petr@vuzv.cz Buněčné terapie  Při onemocnění nebo poranění je zničena, poškozena nebo správně nefunguje řada buněk, tkání či orgánů.  Buněčná terapie se je snaží buňky nahradit 8.4.2016 2 Buněčné terapie  Transfuze krve  Transplantace kostní dřeně Zdroje buněk pro terapii  Embryo  Plod  Novorozenec  Dospělý dárce 8.4.2016 3 Terminálně diferencované buňky dospělého dárce Má svá omezení - transfuze krve - transplantace buněk kosterního svalu do srdce Kmenové buňky dospělého dárce  Tzv. orgánové kmenové buňky (dospělé kmenové buňky – adult stem cells) se nacházejí prakticky ve všech tkáních  Zajišťují regeneraci tkání  Vyskytují se i v tkáních s minimální regenerační kapacitou  Podílejí se na nádorových onemocněních 8.4.2016 4 Dospělé (orgánové) kmenové buňky Asymetrické buněčné dělení  Kmenovost jim dává nika  Opuštění niky – diferenciace  Vyskytují se v různých tkáních např. mozek, tuk, kostní dřeň … Dospělé kmenové buňky  Mají schopnost rediferenciace  Migrují na postižené místo 8.4.2016 5 Osud ASC byl sledován pomocí exprese GFP „Nové“ buňky v postiženém místě vznikají i fúzí. Jsou tetraplodiní. Myogenní buňky v mozku  Bez fúze  S fúzí 8.4.2016 6 Myogenní buňky vnesené do mozku novorozených myší V mozku diferencují na „neurony“ Exprese markerů zralých neuronů v buňkách myogenního původu Degenerace sítnice léčba -potkan  Potkanům s degenerativním onemocněním sítnice byly do ocasní žíly injikovány mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně (MSC)  Zákrok byl proveden před nástupem degenerace světločivných buněk  Zabudování buněk do sítnice MSC MSC sítnice 8.4.2016 7 Degenerace sítnice léčba -potkan  Neošetřená zvířata degenerace abnormální cévy přednostně v okolí nervů  Ošetřená zvířata bez degenerace Degenerace sítnice léčba -potkan  MSC zabrání redukci vrstvy světločivných buněk v sítnici Ošetřené zvíře Neošetřené zvíře 8.4.2016 8 Degenerace sítnice léčba -potkan  MSC zvýší produkci trofických faktorů v sítnici Ošetřené zvíře Neošetřené zvíře Kenneth Chien Massachsetts General Hospital Boston  Přetrvávají z organogeneze ve stěnách srdečních komor  Diferencují na hladkou svalovinu cév endotel cév svalovinu síně svalovinu komory Srdeční kmenové buňky 8.4.2016 9 Léčba poškozené rohovky  Poškození rohovky včetně kmenových buněk rohovky  Odběr kmenových buněk ze zdravého oka  Kultivace kmenových buněk na fibrinu  Transplantace kultivovaných buněk na poraněné oko (Rama et al.: NEJM, 2010) Buňky novorozence Pupečníková krev  Darování veřejné bance  Uskladnění v soukromé bance pro vlastní potřebu za 20-40 tis. Kč a roční poplatky 8.4.2016 10 Proč darovat pupečníkovou krev?  Pupečníková krev je náhrada za kostní dřeň  Pacient jí lépe přijme – není nutná tak velká shoda jako u kostní dřeně  Šance využití vlastní „odložené“ krve je 1:200 tisícům  Odebere se max. 1 dl stačí jen dítěti (vyvíjí se metoda expanze kmenových buněk stimulací Notch receptoru)  Existuje mezinárodní síť Soukromé banky  Verbují klienty v citlivém životním údobí - těhotenství  Slibují využití léčby, která ještě neexistuje (Parkinsonismus apod.)  Co bude s krví zkrachovalých bank? 8.4.2016 11 Fetální buňky - neurony pro Parkinsonovu chorobu Komplikace léčby fetálními buňkami  Chlapec s ataxia-telangiectasia  Dědičná porucha imunitního systému provázená poruchami koordinace pohybu  Léčen injekcemi nervových buněk plodů do mozku i pod mozkové pleny v 9, 10 a 12 letech 2005 2008 Ve třinácti letech tvorba nádorů v mozku Nádory odvozené z buněk nejméně dvou dárců 8.4.2016 12 Typy buněk dle potenciálu diferenciace  Totipotentní – vývoj v celého jedince  Pluripotentní – ve všechny typy buněk např. ICM, ESC  Lineage-restricted stem cells mezodermální, ektodermální, entodermální  Committed stem cells – vyvinou se v daný typ buňky  Progenitorové buňky – dělí se, nejsou kmenové  Terminálně diferencované buňky – krvinka, neuron Pluripotentní ASC (?)  Mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně  Buňky získané z amniové tekutiny (AFS buňky amnionic fluid-derived stem cells) 8.4.2016 13 AFS buňky Diferenciace Tuk Kost Sval Neurony Cévy Játra Intezivní množení – zdojnásobení počtu za 36 hod. Stabilita – 250 generací bez zkrácení telomer Množí se bez „feeder layer“ Buňky z AFS jsou funkční  Formování kosti v těle myši na algináto-kolaganovém podkladu  Integrace do mozku in vivo  Produkce močoviny z hepatocytů 8.4.2016 14 AFS buňky  Vnesení vzniklých neuromů do hipokampu myši  Vnesení osteogenních buněk na podkladu do těla myši AFS buňky  Hojení zlomeniny stehenní kosti Scaffold scaffold scaffold + kostní dřeň + AFS buňky 8.4.2016 15 Mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně  Tvoří zlomek populace buněk kostní dřeně  Při přenosu do blastocysty – kompletní rejstřík diferenciací Catherine Verfaillieová Mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně  Potíže se zopakováním pokusů  Nejasnosti v publikacích 8.4.2016 16 Embryonální kmenové buňky  Bez omezení se množí  Diferenciace na typy buněk – Entoderm – Mezoderm – Ektoderm Lze je vypěstovat  z embryoblastu blastocysty 8.4.2016 17 Lidská blastocysta Blastocysta zbavená ZP ICM 8.4.2016 18 Kultivace izolované ICM Kultivace 7 dní 8.4.2016 19 Kultivace 10 dní Kolonie ESC 3 dny po první pasáži 8.4.2016 20 Zdroje blastocyst  „nadbytečná“ embrya z IVF  cíleně tvořená embrya IVF klonování 8.4.2016 21 Diferenciace pluripotentních kmenových buněk na orgán  Xenopus- pluripotentní kmenové buňky  Exprese 7 genů typických pro „eye-field“  Po transplantaci pluripotentních buněk – vznik epitelu  Po transplantaci pluripotentních buněk s expresí 7 genů „eye-field“ - vznik oka Diferenciace pluripotentních kmenových buněk na orgán 8.4.2016 22 Diferenciace pluripotentních kmenových buněk na orgán  Přenos pluripotentních buněk s expresí genů eye-field do slabiny pulce  Tvorba struktury podobné oku Diferenciace pluripotentních kmenových buněk na orgán  Náhrada zničeného oka pulce pluripotentními buňkami s expresí genů eye-field  Vznik funkčního oka 8.4.2016 23 Diferenciace ESC in vitro  Myší ESC  Extracelulární matrix jako podklad  Diferenciační růstové faktory  Diferenciace buněk na optický váček (optic vesicle) Organogeneze in vitro Další kultivace  Vchlípení stěny  Tvorba optického pohárku (optic cup) 8.4.2016 24 Organogeneze in vitro  Tvorba sítnice Etické problémy  Je blastocysta člověk? 8.4.2016 25 Jak prověřit ESC?  Markery – dokážou vyloučit, nikoli potvrdit  Zvířecí ESC Injekce do blastocysty Injekce do varlat imunodeficitních myší Prověřování lidských ESC  Diferenciace in vitro  Injekce do myší blastocysty  Injekce do zvířecího plodu (ovce)  Vznikají chiméry s různým podílem lidských buněk a tkání 8.4.2016 26 A) Diferenciace není dokonalá z ESC může vzniknout teratom  Řešení: Zdokonalit diferenciaci Selekce diferencovaných buněk Potlačení exprese genu survivin – aktivní v embryu a nádorech, inaktivní v diferencovaných tkáních Technické problémy Technické problémy  Imunitní bariéra  Řešení - příprava příjemce přenosem kmenových buněk kostní dřeně - universální ESC - ESC „na míru“ přenos genů pro MHC - široký sortiment ESC - terapeutické klonování 8.4.2016 27 První klinické zkoušky léčby buňkami z hESC  2009 - americká firma Geron  Léčba poraněné míchy progenitorovými buňkami dendrocytů  Obnova myelinizace  Produkce růstových faktorů  Obnova funkce neuronů První klinické zkoušky léčby buňkami z hESC 8.4.2016 28 Prověrka bezpečnosti léčby buňkami z hESC Myelinizace neuronů poraněné míchy - potkan 8.4.2016 29 První zkoušky Produkce prekurzorových buněk  Testy zastaveny 2011 8.4.2016 30 Léčba makulární degenerace  Kultivace pigmentovaných buněk sítnice z lidských ESC MITF/PAX6 ZO-1 DAPI DAPI DAPI Bestrophin/ PAX6 Léčba makulární degenerace Pigmentovné buňky sítnice po transplantaci přežívají, množí se a funkčně se zapojily do sítnice před 1. týden 6. týden 3. měsíc 6. týden 8.4.2016 31 Léčba makulární degenerace  Průkazná obnova zraku operovaného oka Odběr buněk pokožky Potřebuje srdeční svalovinu Pacient Terapeutické klonování 8.4.2016 32 Pokožka Oocyt Embryonální kmenové buňky 8.4.2016 33 chrupavka Sval kosterní Langerhansovy ostrůvky Srdeční sval ESC DiferenciaceDiferenciace Pacient Makak nejde klonovat. Půjde člověk? Gerald Schatten 8.4.2016 34 Korejsko-americký tým Národní universita Soul Woo Suk Hwang José Cibelli Únor 2004 8.4.2016 35 Květen 2005 – zvýšena účinnost (až 100%) Listopad 2005 - skandál dárcovství vajíček Woo Suk Hwang Sung Il Roh National Soul University Klinika MizMedi 8.4.2016 36 Show must go on! Listopad 2001 - ACT Pokus o terapeutické klonování Fiasko 8.4.2016 37 2007 – ESC z embrya NTSC - makak  304 oocytů  35 blastocyst  2 linie ESC  Vyšší účinnosti dosaženo šetrnějším nakládáním s oocyty a embryi  Nebarví se chromatin pro enukleaci oocytu Shoukrat Mitalipov Oregon National Primate Research Center ESC z embrya NTSC - člověk Tachibana et al. Cell (2013) Shoukhrat Mitalipov Oregon National Primate Research Center Somatické buňky Defektní blastocysta získaná tradičním postupem postrádá embryoblast 8.4.2016 38 ESC z embrya NTSC - člověk Kvalitní ESC blastocysta Embryoblast ESC z embrya NTSC - člověk Markery pluripotence TERATOMY Chrupavka střevo Nerv Sval 8.4.2016 39 Cybridy  Embryo je vytvořeno přenosem jádra lidské somatické buňky do oocytu cizího druhu (myš, králík, skot)  Omezený vývoj embrya Myš – blok vývoje ve 2 blastomerách Králík, skot – blok vývoje v 8-16 blast.  Velké poruchy v expresi genů Výrazné odchylky v expresi 2 – 3 tis. genů Jen výjimečně exprese nanog, Oct-4, Sox-2 Indukované pluripotentní kmenové buňky  Nobelova cenu za fyziologii a medicínu 2012 Shinya Yamanaka John Gurdon 8.4.2016 40 Indukované pluripotentní kmenové buňky  Indukovaná exprese vybraných transkripčních faktorů Fibroblasty indukované pluripotentní buňky Oct3/4 Sox2 c-Myc Klf4 nikoli Nanog ? c-Myc aktivní v řadě typů nádorových buněk ?  Po vnesení do blastocysty vytvoří se chiméra  iPSC diferencují na všechny tkáně  U 20% chimér - nádory pocházející z iPSC Indukované pluripotentní kmenové buňky (iPSC) 8.4.2016 41 2007 - zopakováno u lidských somatických buněk  Retrovirové vektory  Vneseny geny pro transkripční faktory Shinya Yamanaka Universita Kjóto Vznik indukovaných pluripotentních buněk iPC Kožní buňky iPC Větší zvětšení Spontánní diferenciace 8.4.2016 42 Řízená diferenciace iPC iPC Kožní epitel Dopaminergní neurony Kardiomyocyty Teratomy z lidských iPC ve varleti myši Může pomoci náhrada onkogenu c-Myc za gen Wnt 8.4.2016 43 Lidské iPSC  Retrovirové vektory  Přenos transkripčních faktorů OCT4, SOX2, NANOG a LIN28 Obešel se bez c-MYC, který indukuje nádorové bujení Pro tvorbu iPC lze použít různé kombinace transkripčních faktorů James Thomson University of Wisconsin iPSC – beze změn v dědičné informaci  Transpozony (2009) piggyBac – zabuduje geny do chromozomů na přechodnou dobu. Po vzniku iPSC opět „vyskočí“ z chromozomu, je v buňce rozložen a dědičná informace buněk je díky tomu „čistá“ 8.4.2016 44 iPSC – beze změn v dědičné informaci  Vnesení proteinů Oct4,Sox2, Klf4 a c-Myc  2009 – u myší i člověka  Proteiny jsou modifikovány. Mají polyargininový konec z 11 argininů s pozitivním nábojem. Ten proniká přes membrány a „protáhne“ protein do nitra buňky.  Kultivace somatických buněk na 12 hodin s proteiny, pak 36 hodin kultivace bez proteinů. Vše se 4krát opakuje.  Účinnost nižší než při použití genů, ale vyšší než u adenovirů iPSC přenosem proteinů GFP+ iPSC Vneseny do myší blastocysty Chiméra plod 8.4.2016 45 Řízená diferenciace iPSC Tkáň tenkého střeva  Zajištění exprese genů klíčových pro vývoj střeva v přesně určené sekvenci  In vitro vznik útvaru s markery a morfologií tenkého střeva organoid Den 0 1 2 3 4 9 13 embryo Mládě dvou samců  Tvorba iPSC z fibroblastu samce  Selekce linie buněk, které ztratily Y chromozom (XO)  Přenos XO iPSC do samičí blastocysty 8.4.2016 46 Mládě dvou samců  Vznik chiméry s dvěma populacemi oocytů  Páření chiméry samcem  Potomci nesou dědičnou informaci dvou samců Chiméra Potenciálně využitelné u člověka 8.4.2016 47 Porovnání potenciálu hESC a hiPSC Diferenciace na buňky, znichž se tvoří cévy a krvinky Rovnocenná u buněk z ESC a iPSC hESC hiIPC 8.4.2016 48 Porovnání potenciálu hESC a hiPSC Krvetvorné buňky z iPSC Cévy z iPSC Porovnání potenciálu hESC a hiPSC Buňky z hiPSC mnohem náchylnější k apoptóze Angiogenní marker – Kaspáza 3 + Fragmentace jádra + Apoptotická buňka 8.4.2016 49 Porovnání potenciálu hESC a hiPSC Buňky z hiPSC Omezené dělení Progresivní stárnutí Porovnání potenciálu hESC a hiPSC Množení buněk diferencovaných na erytrocyty 8.4.2016 50 Hiromitsu Nakuachi Stanford University Lidské iPSC GM blastocysta prasete Prase bez vlastního pankreatu Spontánně vzniklý lidský pankreas Diabetik iPSC diabetika Orgány z lidskoprasečí chiméry STAP-buňky  STAP buňky se nedělí  Jsou pluripotentní  V chiméře se podílejí na všech tkáních těla 8.4.2016 51 STAP-buňky  Po kultivaci v médiu pro udržení pluripotence se začnou dělit  STAP-kmenové buňky – totipotence  V chiméře se podílejí i na placentě STAP - podvod 8.4.2016 52 Rediferenciace buněk in vivo Ostrůvek Beta-buněk Indukované Beta-buňky  Adenovirové vektory  Transkripční faktory Neurog3 Pdx1 Mafa  Rediferenciace na beta-buňky  Indukce tvorby inzulínu Rediferenciace buněk in vivo  Indukované buňky jsou morfologicky i fyziologicky neodlišitelné normálních beta-buněk 8.4.2016 53 Přímá rediferenciace fibroblastů na neurony  Fetální fibroblasty  Transfekce 3 geny transkripční faktory Ascl1, Brn2, Myt1l  Diferenciace na neurony  Neurony jsou funkční tvoří synapse Přímá diferenciace fibroblastů srdce na kardiomyocyty Po infarktu vneseny do fibroblastů srdce myší pomocí retorovirů geny Gata4 Mef2c Tbx5 Vznik kardiomyocytů (2 jádra) 8.4.2016 54 Tkáňové a orgánové inženýrství 8.4.2016 55 Základem jsou vhodné polymery 8.4.2016 56 Polymerové vazy a šlachy Chrupavky z pacientových chondrocytů 8.4.2016 57 Pěstování chrupavky Umělý močový měchýř 8.4.2016 58 In vitro kultivovaný močový měchýř pacientům se spina bifida Močová trubice  Vývojový defekt močovétubice  Nahrazena trubicí vypěstovanou na polymerovém scafoldu in vitro 8.4.2016 59 Průduška  Kolaps průdušky následkem TBC  Základ implantátu trachea dárce zbavená všech jeho buněk  In vitro narostly na průdušnici pacientčiny buňky z kmenových buněk kostní dřeně  Pacientka žije bez imunosupresiv Průduška Před zákrokem Po zákroku 8.4.2016 60 Průduška  Příprava průdušnice dárce začátek 15 cyklů odmývání detergentem 27 cyklů odmývání detergentem Průduška  Bioreaktor Kultivace probíhá z poloviny na vzduchu, aby byly buňky schopny existence v dýchacích cestách. 8.4.2016 61 Uměle pěstované cévy  Pěstují se na trubicích  Vnější vrstva hladké svaloviny  Vnitřní vrstva endotelu  Do trubice je přiváděn živný roztok pod tlakem v pulsech Mechanická stimulace buněk  Je důležitá pro správný vývoj tkání a orgánů  Dokládá to např. řídnutí kostí u astronautů pobývajících delší dobu ve stavu beztíže 8.4.2016 62 Umělé cévy bez polymeru 8.4.2016 63 Sonografie umělé cévy Integra- vyrobená pokožka - kolageny 8.4.2016 64 Popáleniny na velké ploše "( Organogenesis – vypěstovaná kůže - živé buňky 8.4.2016 65 Kultivace keratinocytů a fibroblastů na polymerových membránách Dermagraft 8.4.2016 66 Na vředy vyvolané nedokrvením Umělé náhražky krve 8.4.2016 67 Podnět – virové nákazy při transfuzi hepatitidy HIV- AIDS Perfluorokarbony 8.4.2016 68 Hemoglobiny Problém se stabilitou Poškozují ledviny Umělé erytrocyty Polymer kys. mléčné a glykolové – PLGA  Biokompatibilní, biodegradovatelný  Sférické „balónky“ po kontaktu s rozpouštědlem kolabují do tvaru krvinky  Potažení proteinem  Odmytí PLGA  Vznik nosiče s vlastnostmi erytrocytu  Lze jej plnit hemoglobinem ale i léky 8.4.2016 69 Náhrady kostí „umělé klouby“ Kolenní kloub 8.4.2016 70 Upevnění umělého kloubu Umělá kost  80. léta - syntetický hydroxyapatit  2. generace -syntetická skla (kůstky středního ucha, zuby, obratle)  3. generace resorbovatelné pěny uvolňující růstové faktory 8.4.2016 71 Kost a chrupavka z kmenových buněk chrupavka kost polymer Rekonstrukce zubního alveolu Vyražený řezák Zničený alveol Rekonstrukce alveolu Scafold a buňky Zubní implantát 8.4.2016 72 In vitro vytvořený germon zubu (Ikeda, 2009) Vlasový folikul (Toyoshoma 2012)  Buňky lidské kůže  Kultivace in vitro  Vznik zárodečného folikulu  Po transplantaci – lidský vlas 8.4.2016 73 Čelist Rekonstrukce lícních kostí  Pacient s Treacher-Collinsovým syndromem - absence lícních kostí - ohrožení oka při pádu  Použita - minerální komponenta z kosti dárce - vlastní kmenové buňky tukové tkáně - BMP2 8.4.2016 74 Srdce  Ročně umírá na selhání srdce nebo infarkt 12 milionů lidí  V USA - infarkt 800 000 lidí ročně - celkem 8 milionů lidí po infarktu - 500 000 ročně umírá na selhání srdce  Hustá síť cév, které dodávají srdci kyslík a živiny a odvádějí zplodiny látkové výměny  Velké množství metabolicky vysoce aktivních buněk naměstnaných v malém prostoru  Akce buněk je vzájemně velmi dobře koordinovaná 8.4.2016 75 Srdce - přírodní vs. umělé A – pumpa pro živný roztok B – výměník plynů C – polymerová „kostra“ Osazení buňkami srdeční svaloviny (100 milionů buněk na 1 ml) Tok média 0,1 ml/min Elektrická stimulace buněk Polymer Den 0 Den 7 8.4.2016 76 Elektrická stimulace buněk vede ke změně ultrastruktury kultivovaných buněk. Tvorba sarkomer, buněčných spojů. Exprese myosinu (zeleně). Stimulace Umělé bio-srdce (potkan) Decelularizace srdce  zbaví se buněk  zbude jen extracelulární matrix 8.4.2016 77 Umělé bio-srdce  Napojení na krevní oběh  Recelularizace – buňky srdce plodu a novorozených mláďat Umělé bio-srdce Výsledek 8.4.2016 78 Umělé bio-srdce  Lidské srdce Decelularizovaný scafold lidský prasečí Lidské buňky Prasečí „základ“ Plíce narostlé na extracelulární matrix  Decelularizace plic  Nasazení 9 typů plicních buněk na extracelulární matrix  Při kultivaci in vitro se obnoví struktura plic i funkce.  Po transplantaci - fungují 8.4.2016 79 Regenerace orgánů  Obojživelníci dediferencují specializované buňky  Ploštěnky mobilizují rozptýlené nedifeencované buňkysignálem z poškozené tkáně Regenerace orgánů  Obnova oční čočky čolka  Obnova srdeční svaloviny dania 8.4.2016 80 Regenerace obojživelníci  Musí dojít k apoptóze některých buněk v poraněném místě  Tyto buňky brání množení ostatních buněk a jejich diferenciaci v nenarušené tkáni  Po jejich zániku je umožněno  Množení buněk  Diferenciace  Regenerace Regenerace obojživelníků Čolek ohňobřichý (Cynops pyrrhogaster) Regenerace oční čočky Nenarušena po 18 amputacích Nenarušena ve věku 30 let 8.4.2016 81 Kmen myší MRL  Geneticky podmíněná schopnost vysoké regenerace tkání  Kůže se hojí bez jizev  Srdce regeneruje po spálení tekutým dusíkem MRL - Murphy Roths Large mutace pro autoimunitní onemocnění Regenerace – mutace genu p21 – kontrola buněčného cyklu p21 – je regulován p53 alely genů mmp2, mmp9 a řada dalších Ellen Heber-Katz Wistar Institute 8.4.2016 82 Bodlinaté myši rodu Acomys Myš Kempova (Acomys kempi) Myš Acomys percivali  Mechanicky málo odolná kůže  Trhá se při napadení predátorem  Dovoluje únik Bodlinaté myši rodu Acomys Na kůži se vytváří útvar podobný blastemu obojživelníků Regeneruje bez zjizvení  Kůže  Chlupy  Chrupavka ucha Den 3 Den 30 8.4.2016 83 Technická řešení Kochleární implantáty  Stimulace buněk v hlemýždi  Nestimuluje jeho nejužší část  Část zvukového spektra chybí  Nevadí pro pochopení řeči 8.4.2016 84  Zvuk zachytí mikrofon  Jde do dekodéru  Kódovaný signál přes kůži do přijímače  Impulzy dráždí vnitřní ucho Přímé dráždění sluchového nervu  Lze zajistit vnímání jen určitých frekvencí při zachování původního sluchu – např. pro lidi neslyšící vysoké tóny  Lze využít i po lidi, kteří mají těžce poškozené vnitřní ucho Elektroda pro napojení na sluchový nerv 8.4.2016 85 Auditory brainstem implant  Elektrická stimulace mozku v cochlear nucleus Implantát pro korekci závratí  Koncepčně je podobný kochleárnímu implantátu.  3 elektrody - zavedeny do kanálků labyrintu vnitřního ucha  Dráždí kanálek a navozují pocit rovnováhy  Vzor impulsů určuje mikroprocesor analyzující pohyby  Např. pro pacienty s Menierovou chorobou – prasknutí stěny labyrintu a výtok tekutiny 8.4.2016 86 Umělá sítnice Lidské oko  130 milionů světločivných buněk  1,2 milionu gangliových buněk  ty vytvářejí zrakový nerv  Signál jde do zrakové kůry, ale zpracovávají ho i další centra Narušení kterékoli části - slepota 8.4.2016 87 Umístění  Na sítnici  Pod sítnici Co může být asi vidět? 8.4.2016 88 Signál na umělé sítnici Generovaný obraz Obraz pohybující se tváře Umělá sítnice Univ. Penn.  3,5 x 3,3 mm  5760 fototranzistorů  3 600 tranzistorů pro generování signálu do očního nervu  13 různých typů tranzistorů  Sama se přizpůsobí světlu a kontrastu Kareem Zaghloul V klinických zkouškách  Retinal Implant AG - Tübingen  1500 fotodiod  Zesilovače  Rozměr 3 x 3 mm  Zorné pole 10°  Černobílý obraz 8.4.2016 89 Umělé srdce Jarvik 7 (1982) Barney Clark 8.4.2016 90 Jarvik 7  Dálkové ovládání  Vnější zdroj napájení Jarvik 2000 8.4.2016 91 „Pomocná pumpa“  Voperuje se do nemocného srdce  Pacient s ním může dlouhodobě žít  Indukční dobíjení  Jeho vlastní srdce přitom regeneruje HeartMate (Thoratec) 8.4.2016 92 The New England Journal of Medicine (Birks et al. 2006)  15 pacientů s těžkým postižením srdce  Operace HeartMate + léky  U 11 - HeartMate po roce (320+186 dní) vyňat  U jednoho arytmie a smrt do 24 hod.  Ostatní návrat stavu srdce k normálu Abiocor - r. 2001 8.4.2016 93 Mike Simons – první pacient  Úplná náhrada  Zcela autonomní  Pokud selže, je konec  Pacient nemá tep Bionické protézy  Obsahují senzory svaly terén mikroprocesor motor  Šetří námahu  Jistější pohyb Mark Inglis – NZ Everest - 2006 8.4.2016 94 1 - manžeta 2 – baterie 3 – kabel napájení 4 – ovládací klávesnice 5 – senzory akcelerace, sklonu, detekce schodů 6 – pohon pro patu 7 - při každém kroku uvedeny do pohybu „prsty“ 60 000 liber SenzorHand Speed  Pracuje do -20° C (i v rukavicích)  Napětí: 6/7.2 V  Rozevření 100 mm  Rychlost pohybu prstů 15-300 mm/sec  Síla stisku 0-100 N  Hmotnost 460 g  Levá, pravá  Velikosti: 7 1/4, 7 3/4, 8 1/4 8.4.2016 95 Elektronické zápěstí  Udrží asi 20 kg  Zvedne asi 6 kg  Plný rozsah pohybu za 0,5 sekundy  Přirozené „komíhání“ za chůze Elektronický loket 8.4.2016 96 Programování  Protézy lze uzpůsobit - pacientovi - podle podmínek Ovládání ochromené ruky  Vyřazení nervů ruky z činnosti  Transport signálů z pohybového centra mozku do svalů ruky  Ruka se pohybuje podle instrukcí mozku, i když její nervy nevedou signál Fukční Elektrická Stimulace 8.4.2016 97 SmartHand  Napojení elektrod přímo na nervy končetiny problémy s udržením funkčního spoje  Zpětná vazba (hmat)  Vyvíjená v EU ve spolupráci s dalšími zeměmi (Izrael) Pacient vnímá protézu subjektivně jako vlastní končetinu Interface napojuje protézu přímo na nervy Elektrická stimulace nervů ulevuje od fantómové bolesti  4 servopohony  40 tlakových senzorů  Lze psát tužkou  Funguje hmat SmartHand 8.4.2016 98 eLEGS –Berkeley Bionics  Programovatelná jednotka řídí servomotor v kyčli a koleně.  Dovoluje chůzi s využitím pohybových reflexů, které u ochrnutých zůstaly zachovány  Přístroj může chodit i sám bez člověka BMI - brain machine interface 8.4.2016 99 Převod nervových vzruchů na povely pro elektronická zařízení Vývoj protéz ovládaných myslí 8.4.2016 100 BrainGate 8.4.2016 101 BrainGate – ovládání robotické ruky (2012) BrainGate  Pacienti ochrnutí po mozkové cévní příhodě v mozkovém kmeni  Elektrody voperovány do centra pro ovládání dominantní ruky  Nejprve trénink s ovládáním kurzoru na počítači.  Následně trénink v ovládání robotické ruky 8.4.2016 102 José Delgado – Yale Univ. 1965 8.4.2016 103 Roborat – elektronicky ovládaný potkan Kortiko-spinální protéza Master  Představuje si pohyb končetiny pro pohyb kurzoru  Kontroluje výsledek Avatar  Pod anestezií  Vykonává pohyby po stimulaci míchy i po přímé stimulaci svalu paže Master Avatar Záznam nervové aktivity Určení úmyslu Stimulace Anestezie Maryam Shanechi 2014 8.4.2016 104 Brain-to-brain interface Brain-to-brain interface Miguel Nicolelis 8.4.2016 105 Brain-to-brain interface  Potkan „odesílatel“ dostane signál  Volí naučenou reakci - zmáčkne správnou páku  Dostane odměnu  Vzruchy z jeho mozku jsou sejmuty elektrodami a přeneseny do počítače  Dekódování vzruchů a jejich „překlad“ do stimulačního signálu pro „příjemce“ Brain-to-brain interface  Potkan „příjemce“ reaguje na vzruchy generované počítačem tak, že volí naučenou správnou odpověď, i když nedostal signál (světlo). Dostane odměnu  Pokud dostane odměnu za správné řešení „příjemce“ i „odesilatel“, je příští signál z nervového centra „ostřejší“ a pro „příjemce“ snáze „čitelný“ 8.4.2016 106 Etické otázky kolem kmenových buněk  Primum non nocere především neublížit  ESC - obrovský příslib pro léčbu mnoha chorob  Výzkum probíhá velmi intenzivně  Veřejnost má obavy Etické otázky kolem kmenových buněk  Zdroj kmenových buněk  ESC nebo ASC?  Dárcovství oocytů  Máme prodlužovat lidský život buněčnou terapií? 8.4.2016 107 Zdroj ESC Vědci  Embryo  Rané stádium (blastocysta)  Nejsou vyvinuty orgány  Izolovaná ICM – nemůže z ní vzniknout člověk  Embryo není jedinec, osobnost Některé církve  Embryo  Člověk je osobností od okamžiku oplození  Embryo je jedinec, osobnost  Tvorba ESC je destrukcí člověka Zdroj ESC 8.4.2016 108 Záchrana nadbytečných embryí z IVF Donald Kennedy „Toto vyhlášené dilema (vznik ESC a zničení embrya) nevzniká konfrontací vědy a obecných etických zásad. Naopak, námitky vyvěrají z určitého názoru – víry – na to, co je podstatou lidského života. Tento názor zastávají jen někteří věřící, ale ostatní nikoliv.“ Donald Kennedy Stanford Univ. Chief editor Science 8.4.2016 109 Obecná shoda o lidském embryu  Vyžaduje respekt  Nakládání s ním nelze komercionalizovat  Nesmí se s ním zacházet jako se zbožím  Získávání embryí je eticky citlivá věc Zdroj embryí  Nadbytečná embrya z IVF  Embrya vytvořená jen pro tvorbu ESC IVF, terapeutické klonování 8.4.2016 110 Nadbytečná embrya z IVF  Nakládání s nimi musí provázet respekt k embryu  Rodiče by měli být informováni o možnosti darovat embrya na ESC až ve chvíli, kdy se rozhodnou pro zničení nadpočetných embryí  Za embryo by se nemělo platit Důvody pro tvorbu embryí  Embrya z IVF nemají dostatečné spektrum genotypů pro výzkum  Pro výzkumné účely – vytváření ESC od jedinců stižených dědičnou chorobou  Mezinárodní konvence zakazují tvorbu lidského embrya pro výzkum 8.4.2016 111 Statut embrya z IVF a terapeutického klonování  IVF – kombinace genomu gamet  Terapeutické klonování – rediferenciace somatické buňky  Vzniká terapeutickým klonováním embryo? Embryo vzniklé terapeutickým klonováním  Nevzniklo kombinací genomu gamet  Nevzniklo s cílem narození člověka  Jeho vývojová schopnost je snížena  Oplozením – zygota  Klonováním – klonota (clonote) „je vyrobena spíše než zplozena“ Paul McHugh Johns Hopkins Univ. 8.4.2016 112 „Klonota“ „Zničení lidského embrya vzniklého klonováním a následná tvorba embryonálních kmenových buněk představuje menší etický problém než zničení zamražených embryí na klinikách pro IVF.“ Rudolf Jaenisch Odpůrci terapeutického klonování  Výzkum terapeutického klonování otevírá cestu pro reprodukční klonování, protože vede k vylepšení technik přenosu jader  Reprodukční klonování je nepřijatelné 8.4.2016 113 Odpůrci terapeutického klonování  Lidský život si zaslouží ochranu od okamžiku oplození vajíčka spermií  Při terapeutickém klonování ale nedochází k početí splynutím vajíčka a spermie Tvorba ECS z handicapovaných embryí  Zablokování genu CDX2 nutného pro vývoj trofoblastu - z ICM lze získat ESC  Zatím jen u myši  Má gen CDX2 u člověka stejné funkce?  Ověření – jen pomocí pokusů na lidských embryích  Je funkce genu CDX2 v embryu hranicí, kde začíná morální statut člověka? CDX2 8.4.2016 114 Tvorba ECS z handicapovaných embryí  Embrya vzniklá fúzí lidské somatické buňky a zvířecího cytoplastu (králík, skot)  Není to chiméra  Kombinuje lidský jaderný genom se zvířecí mtDNA  Je riziková - nepovoluje se Julian Savulescu „Je z morálního hlediska něco špatného na výzkumu na buňkách, které jsou odvozeny od somatických buněk a nikdy by se nevyvinuly v embryo? Dnes produkujeme lidské proteiny vnášením lidské DNA do zvířat. Zdá se, že proti tomu nikdo nic nenamítá. Když tak můžeme vyrábět proteiny, tak proč ne třeba krvinky?“ Savulescu University of Melbourne 8.4.2016 115 Dárcovství oocytů  Je zapotřebí velké množství lidských oocytů  Pro dárkyně to představuje rizika  Hyperstimulační syndrom u 1% žen vážné komplikace selhání ledvin, plic, šok, ruptura vaječníku  Platby – motiv pro chudé ženy  (Indie – prodej ledvin na transplantace) Možnosti produkce oocytů in vitro Julang Li University of Guelph 8.4.2016 116 Možnosti produkce oocytů in vitro Možnosti produkce oocytů in vitro iPSC 8.4.2016 117 Prodloužení života zpomalení stárnutí  Co se stane, když bude buněčná terapie pomocí ESC skutečně funkční, levná a tudíž široce dostupná?  Bude využita pro prodloužení života zpomalení stárnutí  Jaké to bude mít následky? Prodloužení života zpomalení stárnutí  Smrt dává životu naléhavost smysl  Bude silně prodloužený život tak plnohodnotný jako ten „krátký“?  Budeme ještě chtít mít děti? 8.4.2016 118 Prodloužení života zpomalení stárnutí  Společnost se „renovuje“ s každou novou generací  Co se stane se společností, která bude stárnout bez dětí?  Naruší se přenos tradic a kultury? Prodloužení života zpomalení stárnutí  Zahlcení společnosti schopnými „glut of able“  Zastaví se střídání generací v řízení firem v politice ve vědě v kultuře Frederick McCubbin An old politician 1879 8.4.2016 119 Prodloužení života zpomalení stárnutí  Charles Mann: The Coming Death Shortage „nástup nedostatku úmrtí“  Prodloužení lidského života vyvolá hlubokou ekonomickou a sociální krizi  Moc a majetek se nahromadí v rukou malé skupinky extrémně starých ale přitom zdravých a pracovně výkonných lidí. Prodloužení života zpomalení stárnutí  Neexistuje sociální potřeba prodlužování lidského života  Lidí s tímto názorem přibývá  Pokrok v medicíně Měl by být využit k tomu, aby lidé umírali přirozenou smrtí v klidu a důstojně. Nikoli k odvracení přirozené smrti. David Callahan 8.4.2016 120 ESC a veřejnost  Většina lidí se v blízkém okolí (rodině) setkává s případy degenerativních onemocnění (Parkinson, Alzheimer, Duchenne aj.), které jsou potenciálně léčitelné buněčnou terapií s ESC.  To formuje jejich vztah k ESC ESC a veřejnost  Velký vliv mají postižené celebrity 8.4.2016 121  Stupně regulace  Bez regulace (USA, Kanada)  Úplný zákaz  Povolen jen výzkum, nikoli tvorba ESC (Německo)  Povolen výzkum i tvorba ESC z nadpočetných embryí z IVF (ČR) z terapeutického klonování (GB, Aus.) Regulace ESC ČR – zákon 227/2006 Sb.  Výzkum ESC – povoluje ministerstvo školství Dovezené i nově vytvořené linie Vytváření ESC z embryí po IVF Není povoleno terapeutické klonování Bioetická komise – poradní sbor expertů 8.4.2016 122 Regulace ESC  Výzkum může provádět jen ten, kdo 1) prokáže vysokou kvalifikaci 2) prokáže, že výzkum přinese významné nové poznatky 3) prokáže, že tyto poznatky nelze získat výzkumem na jiném typu buněk Financování a patenty  Soukromé zdroje  Veřejné zdroje  Patentování  USAPatentovatelné - nové, zlepšující, fungující bez ohledu na etiku (ale nepatentovali lidsko-zvířecí chiméry)  Evropa – v biotechnologiích nelze patentovat věci, které jsou v rozporu s dobrými mravy a morálkou 8.4.2016 123 Patenty  Výzkum financovaný ze soukromých zdrojů nemusí být vždy patentován K jeho výsledkům může být volný přístup  D. Melton (2004) – získal ESC pro výzkum dětské cukrovky za peníze ze soukromých zdrojů. Buňky poskytuje zdarma. Douglas Melton Harvard University Patentování hESC v EU  2011 – Evropský soudní dvůr  Zákaz patentování hESC  Lze i nadále patentovat „přidružené techniky“ (např. složení kultivačních medií) nebo samotné léčebné postupy  Snahy omezit financování výzkumu hESC z fondů EU 8.4.2016 124 Dostupnost buněčné terapie  Lze předpokládat, že léčba pomocí ESC bude náročná technicky i finančně  Obtížná dostupnost V zemích s nízkou úrovní medicíny V zemích, kde na to nebude stačit zdravotní pojištění Dostupnost buněčné terapie  Léčba pomocí ESC může být dostupná jen úzké skupině lidí  Máme právo vynakládat veřejné prostředky na výzkum ESC, když jeho výsledky pak bude využívat jen elita?  Je to jeden z bodů etických výhrad proti ESC 8.4.2016 125 Dostupnost buněčné terapie  Postupem času bude terapie s ESC dostupnější i pro méně movité  Původní nerovný přístup se vyrovná  Péče o neléčené nemocné představuje ještě větší ekonomickou zátěž  Jsou tu i sociální dopady např. rodiny, které se starají o parkinsonika ESC, embryo a lidská důstojnost  Klíčem diskusí o ESC je otázka lidské důstojnosti a statut lidského embrya  Je člověk něco víc než ostatní tvorové?  Proč?  Lidská racionalita, komunikace  Lidská duše a stvoření k obrazu boha 8.4.2016 126 ESC, embryo a lidská důstojnost  Obecná koncepce lidské důstojnosti  Člověk se vymyká má větší „hodnotu“ než zvířata  Odráží se to např. v zákazech otroctví kanibalismu Může vést k paradoxním interpretacím. např. odmítání očkování proti neštovicím, protože se používá virus skotu a jeho podání lidem narušuje lidskou důstojnost. ESC, embryo a lidská důstojnost  Konkrétnější koncept lidské důstojnosti  Výjimečnost člověka tkví ve schopnosti jeho mozku mírnit či napravovat následky chorob.  Choroba připravuje člověka o důstojnost  Léčba pomocí ESC může vrátit důstojnost např. parkinsonikům 8.4.2016 127 ESC, embryo a lidská důstojnost  Vědci Je třeba vážit důstojnost člověka důstojnost embrya  Člověk trpí  Embryo Není individuum, nemá hlavu, srdce, končetiny. Nemá rozlišenou spodní a svrchní stranu těla ESC, embryo a lidská důstojnost  Paul Berg: Jsme z etických a morálních důvodů povinní provádět výzkum na ESC, abychom ulevili těm, co trpí.  John Gearhart: Neetické je ničení embryí pokud bychom je mohli využít pro léčbu, jež zachraňuje životy. 8.4.2016 128 ESC, embryo a lidská důstojnost  Některé víry upřednostňují obecnější koncept lidské důstojnosti a vidí člověka a lidské embryo jako z principu hodné zvláštního zřetele (např. římští katolíci)  Některé víry se kloní ke konkrétnějšímu konceptu lidské důstojnosti (např. presbyteriáni, judaisté) ESC, embryo a lidská důstojnost  Zastánci obecnějšího konceptu Konkrétnější koncepce lidské důstojnosti hrozí vstupem na šikmou plochu. Hrozí, že budeme dělat vše, co dělat umíme. Leon Kass: Opravdovým úkolem současné společnosti je využít přínosy nové biologie bez toho, že bychom se vydali na cestu k „Nádhernému novému světu“ a degradaci člověka. 8.4.2016 129 Judaismus a ESC  Oplozené vajíčko není osoba  Neschvalují interupci na základě Genesis 9:6 – Prolita bude krev toho, kdo sám prolil lidskou krev  Embryo nemá krev do 40. dne „jakoby embrya byla voda“  Zmrazené embryo smí být zničeno nebo použito na výzkum včetně ESC Judaismus a ESC  Lidé mají za povinnost léčit a hojit  Výzkum na ESC má z tohoto hlediska velký potenciál  Použití nadpočetných embryí podle některých rabínů lze obhájit odkazem na záchranu lidského života při léčbě pomocí ESC 8.4.2016 130 Římsko–katolická církev  Od oplození vajíčka spermií je zárodek lidskou bytostí  Zákaz jakéhokoli výzkumu na ESC  V důsledku odporu k interupcím odmítají i embryonic germ stem cells Ortodoxní pravoslavná církev  Člověk se blíží během života k bohu  Tento proces začíná početím proto odmítají interupci Interupce je akt proti boží vůli  Nelze podporovat tvorbu ESC  Medicína je dar od boha lidé jsou povinni léčit povolují výzkum na hotových liniích ESC nebo na buňkách ze spontánních potratů 8.4.2016 131 Protestantské církve  Velmi různorodá stanoviska  Na jedné straně striktní příkaz ochrany embrya jako nejslabšího člena lidské společnosti. Embryo má stejný statut jako dospělý člověk. Jakýkoli výzkum či zásah do embrya je vyloučen. Protestantské církve  Na druhé straně  Podpora výzkumu ESC z nadpočetných embryí po IVF  Podpora výzkumu na buňkách z plodů po intrerupcích provedených ze zdravotních důvodů  Řada protestantů silně podporuje výzkum na ESC 8.4.2016 132 Islám  Velká tolerance k ESC  Oduševnění po 40. ale i až po 120. dni těhotenství Povolují výzkum na ESC, které byly získány ze zárodků před tímto termínem Povolují tvorbu ESC z nadpočetných embryí po IVF a v některých případech i terapeutické klonování Ideály a činy Mnoho lidí jedná v rozporu s tím, co hlásají  Kristus chtěl mír, ale křesťan jde do války  Ochránce zvířat nosí kožené boty  Al Gore brojí proti globálnímu oteplení a má doma vyhřívaný bazén 8.4.2016 133 Ideály a činy - ESC  Jižní Korea– buddhistická země  Buddhismus – důraz na neubližování jakékoli formě života  Embryo není důležité, jestli je to člověk je živé a musí být chráněno  Embryo nese karmickou identitu zemřelé osoby, zaslouží si stejný respekt jako osoba Ideály a činy - ESC  Jižní Korea  Je rájem interrupcí, i když interrupce ze sociálních důvodů jsou zakázány buddhismus interrupce odmítá Počet interrupcí v Jižní Koreji ročně přes 1,5 milionu Většina interrupcí je ilegálních 8.4.2016 134 Ideály a činy - ESC  Jižní Korea  podpora výzkumu na ESC  podpora terapeutického klonování Ideály a činy - ESC  Část veřejnosti podporuje výzkum na ESC, i když jsou proti interrupcím a klonování  Velkou roli hraje příslib léčby závažných onemocnění 8.4.2016 135 Ideály a činy - ESC  Co když ECS přinesou léčbu závažných onemocnění?  Jak se zachovají ti, co ESC odmítají?  Lze nechat léčit psími ESC cukrovku u psa a přitom odpírat stejnou léčbu diabetickému dítěti?