1 Elektroforetické metody
Princip
Rozdělení proteinů (nejčastěji krevních bílkovin) na základě jejich pohyblivosti v elektrickém poli. Po
tomto kroku většinou navazují další metody založené na reakci antigen – protilátka. Důležité je, že
bílkoviny se dělí podle povrchového náboje. K realizaci elektroforetických metod je nutný zdroj
stejnosměrného elektrického proudu, speciální elektroforetické vany, vhodný pufr a vhodný nosič.
Jako nosič se v minulosti používal papír, acetatcelulózová membrána nebo agar, dnes se prakticky
výlučně používá agaróza nebo polyakrylamidový gel.
Rozdíl mezi agarózou a agarem spočívá v tom, že agar je nehomogenní směs polysacharidů
získaných z mořských řas, zatímco agaróza je homogenní, po chemické stránce se jedná o polymer
složený z disacharidových jednotek – agarobiózy. Agaróza se pro elektroforézu používá v koncentraci
0,5 – 2 %. Při této koncentraci tvoří gel, který vyhovuje požadavkům, pouze je křehký, což mírně
komplikuje manipulaci.
Polyakrylamid je homogenní, hydrofilní, má výborné mechanické vlastnosti, nízkou elektroosmózu a
nízkou absorpci. Lze ho připravit v různé hustotě, zkoumané látky se potom dělí nejen podle náboje,
ale i podle velikosti molekul. Nevýhodou je pouze toxicita základního monomeru.
Imunoelektroforéza: jedná se o elektroforetickou separaci následovanou imunoprecipitací
rozdělených proteinů specifickými protilátkami, většinou v prostředí agarózy. V této metodě je tedy
obsažena i imunologická reakce antigen – protilátka. Metoda imunoelektoforéza (imunoelfo) byla
poprvé publikována v roce 1952 a od té doby našla rozsáhlé uplatnění v imunologickém výzkumu i
diagnostice. V současnosti se nejvíce používá při stanovení paraproteinu (čili neúplných řetězců
imunoglobulinů) při monoklonálních gamapatiích.
Výhody a nevýhody: metoda imunoelektroforézy je nenáročná na čas i vybavení, není drahá. Pouze
proces odečítání a interpretace výsledků je do značné míry závislý na zkušenostech pracovníka, o
složitosti této problematiky svědčí fakt, že o imunoprecipitaci proteinů existují celé samostatné
monografie.
Imunofixace: je modifikací imunoelektroforézy; spočívá v tom, že po elektroforéze se na agarózový
gel položí maska s výřezy. Otvory se naplní příslušnými protilátkami anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti
kappa, anti lambda. Vzniklé precipitační linie se pak porovnávají se standardním sérem a lze tak
posuzovat odchylky ve smyslu poklesu nebo nárůstu jednotlivých tříd protilátek, resp. lehkých řetězců.
Využití elektroforetických metod:
- orientační vyšetření bílkovin krevní plasmy: zde se nejčastěji posuzují linie odpovídající albuminu, α1
α2 β a γ globulinu. Při imunologických vyšetřeních lze touto metodou zachytit zvýšení, resp. snížení γ
globulinové frakce.
- rozdělení antigenů pro imunoblotting
- obecně dělení bílkovin v experimentálních studiích
ÚLOHA 10: Raketová elektroimunodifuze podle Laurella
Princip
Zkoumaný antigen je stejnosměrným elektrickým proudem unášen po gelu s protilátkou. Vazbou
antigenu a protilátky vznikají imunokomplexy, které se projeví jako precipitát v podobě tzv. raket.
Podstatou techniky je putování antigenu a tvorba imunokomplexů až do vzdálenosti, ve které je
veškerý antigen ze vzorku vyvázán protilátkou v gelu. Jde o jednu z nejpřesnějších kvantitativních
elektroimunodifuzních metod.
Výhody a nevýhody
Metoda je poměrně přesná a jednoduchá na provedení. Vyžaduje však nákladné přístrojové vybavení.
Je také nutné počítat s nejméně hodinovou rezervou při elektroforetické fázi a vyhodnocení výsledku
je možné až po určité době.
Chemikálie a roztoky
1. Komerční lidské sérum obsahující IgM pro kalibraci (Orion Diagnostica)
Obsah IgM je 1,25g/l.
2. Protilátka - sérum s anti-IgM protilátkami
3. Fyziologický roztok
4. Agaróza v práškové formě
5. Borát-fosfátový pufr (pH 6,8)
6. Roztok Coomassie blue - malé množství rozpuštěné v dH2O
7. Barvící roztok
225 ml CH3OH + 25 ml CH3COOH + 0,25 g amidočerni 10B
8. Odbarvovací diferenciační roztok
CH3OH : CH3COOH - 10:1
Vzorek: Komerční lidské sérum obsahující neznámé množství IgM (Orion Diagnostica)
Vystupuje jako antigen.
Přístroje a pomůcky
Skleněné plotny 5x5 cm, skleněná pipeta, korkovrt na vysekávání jamek, vývěva, zdroj napětí,
elektroforetické komory, Petriho misky na vlhkou komůrku, filtrační papír.
Skleněné plotny s agarózovým gelem:
1. Vyvážíme podložku na nalévání do vodorovné polohy.
2. Skleněnou plotnu (5x5 cm) očistíme alkoholem a necháme oschnout.
3. Připravenou skleněnou pipetu několikrát propláchneme horkou vodou.
4. Na plotnu naneseme skleněnou pipetou 2,4 ml 1% roztoku agarózy v borát-fosfátovém
pufru s anti-IgM sérem.
5. Gel necháme několik minut zatuhnout na kalibrované vodorovné ploše.
6. Z Petriho misky a vlhkého filtračního papíru připravíme vlhkou komůrku. Do ní umístíme
skleněnou plotnu s agarózou, aby tato nevyschla.
Postup (vlastní práce) - pracujeme ve dvojicích
1. Ze zásobního komerčního séra o známé koncentraci IgM si připravíme další ředění.
a) do zkumavek 2. a 3. napipetujeme 10 μl fyziologického roztoku
b) do zkumavky 1. napipetujeme 20 μl séra se známou koncentrací IgM
c) ze zkumavky 1. přenášíme 10 μl do zkumavky 2., důkladně promícháme a přeneseme 10 μl
do zkumavky 3.
d) do další zkumavky si připravíme směs 10 μl ze zkumavky 3. a 5 μl roztoku coomassie blue
Označení zkumavky 1. 2. 3. 4.
Coomasie Blue - - - 5 µl
Fyziologický roztok - 10 µl 10 µl Antigen
(sérum) 20 µl - - Ředění:
- 2x 4x Koncentrace
[g/l]:
Celkový objem: 10 µl 10 µl 10 µl 15 µl
2. Podle šablony vysekáme do gelu s protilátkou řadu pěti jamek. Do jamek naneseme:
a) do prvních tří jamek 5 μl ze zkumavek 1.-3.
b) do čtvrté jamky 5 μl séra o neznámé koncentraci
c) do páté jamky 5 μl naředěného kontrolního séra smíchaného s roztokem coomassie blue ze
zkumavky 4.
3. Do elektroforetických komor nalijeme borát-fosfátový pufr, na hranici mezi katodou a anodou
položíme připravená sklíčka a ze dvou protilehlých stran (od katody a anody) přiložíme na kraj
gelu filtrační papír nasátý borát-fosfátovým pufrem za účelem vedení elektrického proudu.
4. Každou komoru obsahující tři sklíčka zakryjeme a zapojíme elektrický obvod tak, aby do každé
elektroforetické komory vedl proud o velikosti 60 mA (20 mA na sklíčko). Elektroforéza bude
probíhat cca 1 hodinu, přičemž její průběh budeme sledovat na séru označeném roztokem
coomassie blue.
5. Po skončení elektroforézy pereme skla nejvýše 2 minuty ve fyziologickém roztoku, zabalíme je do
chromatografického papíru navlhčeného fyziologickým roztokem a přes noc sušíme při pokojové
teplotě.
6. V dalším cvičení sejmeme ze sklíček papír, skla opereme pod tekoucí vodou a barvíme barvícím
roztokem do dostatečného obarvení linií. Pozadí odbarvíme diferenciačním roztokem. Nakonec
opereme v destilované vodě a usušíme bez papíru.
1 : 8 1 : 4 1 : 2 konc.
10 µl 10 µl 10 µl
Ukázka raketové elektroimunodifuze
Hodnocení
Plocha popř. výška raketky po odečtení startovací jamky je úměrná koncentraci antigenu.
Hodnoty výšky/plochy precipitačních útvarů (cm
2
) u prvních tří jamek vyneste do bodového grafu proti
hodnotám koncentrace séra v příslušné jamce a vyneste kalibrační křivku s rovnicí regrese a
hodnotou spolehlivosti
Hodnotu výšky/plochy precipitačního útvaru u čtvrté jamky (lidské sérum o neznámé koncentraci IgM)
dosaďte do rovnice regrese a vypočítejte koncentraci IgM.
Výstup
1) Tabulku s hodnotami výšky/plochy precipitačních útvarů různých koncentrací kontrolního séra a
vzorku.
2) Kalibrační graf závislosti výšky/plochy precipitačních útvarů na koncentraci kontrolního séra s
rovnicí regrese a hodnotou spolehlivosti.
3) Výpočet koncentrace IgM ve vzorku lidského séra.
-
+
1. 2. 3. sérum s
coomassie
blue
vzorek