1 Metody separace buněk
Pro izolace krevních elementů z plné krve se používají různé metody, přičemž důležitým faktorem je
především čistota získané buněčné populace. Zpravidla platí, že čím vyšší je čistota výsledné
suspenze, tím vyšší je také cena a náročnost dané separační metody.
4.1 GRADIENTOVÁ SEPARACE
Metoda je založena na rozdílné hustotě separovaných buněk. Erytrocyty a granulocyty mají vyšší
hustotu než monocyty a lymfocyty. Separace je velmi jednoduchá a spočívá v navrstvení
heparinizované krve na separační gradient (např. dextran, Ficoll, Histopaque). Po následné
centrifugaci dojde k typickému rozdělení buněk (viz obr. 4.1).
Obr. 4.1: Separace buněk gradientovou centrifugací s využitím Histopaque.
Kvůli získání agranulocytů se musí vrstva plasma/trombocyty/monocyty/lymfocyty znovu promývat a
centrifugovat, aby se odmyly trombocyty. Celá příprava trvá asi hodinu a z 1 ml periferní krve lze
získat 1 – 2 x 10
6
agranulocytů. Tyto buňky lze dále použít k řadě funkčních testů (proliferační testy,
testy cytotoxicity, průtoková cytometrie apod.). Je-li vyžadována frakce čistých lymfocytů, musí se
monocyty oddělit pomocí adherence na plastový povrch. Tuto metodu lze také kombinovat s použitím
protilátek, které mohou vázat některou z přítomných buněčných populací.
Výhody: Cena, jednoduchost, buňky po centrifugaci zůstávají plně funkční.
Nevýhody: Technicky obtížné je sesbírání prstence agranulocytů. Nejlepších výsledků je dosahováno
při teplotě 18 – 20 °C, kdy dochází k menší agregaci erytrocytů, což usnadňuje jejich oddělení
od ostatních buněk. Pokud mají být buňky v další fázi použity pro kultivaci, musí se pracovat za
sterilních podmínek. V některých případech (při separaci pupečníkové krve, u malých dětí nebo za
patologických stavů) se v krvi vyskytuje zvýšené množství prekurzorů erytrocytů, které obsahují jádra
a po separaci zůstávají společně s agranulocyty v horní vrstvě.
4.2 IZOLACE LYMFOCYTŮ POMOCÍ ROZET
Metoda využívá povrchových receptorů lymfocytů. CD2 na povrchu T-lymfocytů funguje jako receptor
pro povrchové antigeny ovčích erytrocytů a vytváří s nimi tzv. rozety (označované jako T-rozety).
Podobně reaguje B-lymfocyt s myšími erytrocyty. Tato metoda byla používaná před objevem
monoklonálních protilátek a průtokové cytometrie. Hodnocení spočívalo ve zjišťování počtu rozet ve
světelném mikroskopu. Dnes se tato metoda využívá ve spojení s gradientovou centrifugací.
Erytrocyty se po centrifugaci odstraňují osmotickou lýzou.
Výhody: Cena, jednoduchost.
Nevýhody: Metoda využívá vazbu na receptor buněk, tudíž dochází k aktivaci buněk.
Plasma + trombocyty
Histopaque
Centrifugace
krev
Histopaque
Monocyty + lymfocyty
Granulocyty + erytrocyty
4.3 IMUNOMAGNETICKÁ SEPARACE
Široce používaná metoda využívající pro separaci povrchových markerů buněk. Používá se
v pozitivním nebo negativním uspořádání. Pozitivní separace spočívá ve výběru buněk podle
přítomnosti určitého znaku (povrchové molekuly). Negativní pak spočívá v odstranění všech, které
specifický znak nenesou. Používají se tzv. selekční protilátky, které jsou pevně navázány na
magnetické částice.
Nejprve se buňky naváží na povrch magnetických kuliček, které jsou potaženy specifickou selekční
protilátkou. Poté suspenze buněk prochází separační kolonou, která je umístěna v magnetickém poli.
Magnetické kuličky s navázanými buňkami zůstávají v magnetickém poli, zatímco zbytek buněk projde
kolonou. Jde-li nám o frakci buněk, která zůstává zachycena v magnetickém poli pomocí specifických
protilátek, hovoříme o tzv. pozitivní selekci (Obr. 4.2A). Naopak chceme-li frakci buněk, která kolonou
prochází, aniž by se vázala na specifické protilátky navázané na povrchu magnetických kuliček,
hovoříme o negativní selekci (Obr. 4.2B).
Obr. 4.2: Znázornění průběhu magnetické separace v pozitivním (A) a negativním (B)
uspořádání. Při pozitivní selekci je na magnetické mikročástice navázána monoklonální
protilátka proti charakteristickému povrchovému znaku izolované buněčné populace (na
obrázku modře). Negativní selekce je založena na navázání magnetických mikročástic na
všechny buněčné populace kromě té sledované. Buňky navázané prostřednictvím protilátek na
magnetické mikročástice jsou následně zachyceny v magnetickém poli (červeně).
Nevýhodou pozitivní selekce je aktivace izolovaných buněk prostřednictvím vazby na povrchový
marker. Proto se častěji využívá negativní selekce, při které ze suspenze vychytáváme všechny typy
buněk, které chceme odstranit. Je tedy jasné, že negativní selekce je dražší, neboť při ní potřebujeme
více druhů specifických protilátek. Často se používá pro izolaci buněk CD34 a subpopulací lymfocytů.
Výhody: Jednoduchost, rychlost. Existuje široká škála komerčně dostupných separátorů a kitů
specifických pro určité buněčné populace.
Nevýhody: Cena, aktivace izolovaných buněk v případě pozitivního uspořádaní.
4.4 SELEKCE POMOCÍ PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE
Jedná se o tzv. třídění neboli sortrování buněk, což je jedna z funkcí průtokového cytometru.
Sledované buňky se označí fluorescenční protilátkou. Při průchodu přístrojem jsou pak tyto buňky
detekovány na základě svých optických vlastností, elektrickým výbojem vychýleny ze své dráhy a
nasměrovány do sběrné zkumavky. Ostatní neoznačené buňky cytometrem projdou nevychýleny a
jsou zachyceny odděleně od požadované buněčné populace.
Výhody: Vysoký stupeň čistoty (až 99 %).
Nevýhody: Vysoká náročnost na přístrojové a materiálové vybavení a vysoká pořizovací cena
průtokového cytometru.
ÚLOHA 3: Izolace agranulocytů z myší krve
Tato metoda se běžně používá v biochemických či výzkumných laboratořích jako mezistupeň
před následným stanovením imunitních vlastností lymfocytů jako je např. proliferace buněk nebo
aktivita buněčných enzymů. Izolované lymfocyty mohou sloužit také jako zdroj DNA pro genetické
analýzy. V nádorové terapii se používá izolovaných lymfocytů k určení proliferační aktivity lymfocytů
po vystavení nádorovým buňkám či extraktům a pro stanovení cytotoxické aktivity výkonných buněk
proti nádorům. Ve cvičení pracujeme s malými objemy krve, což ztěžuje průběh separace. Výtěžnost
metody je proto velice nízká v porovnání s výtěžností dosahovanou v klinických laboratořích.
Princip
Krev se rozdělí centrifugací na hustotním gradientu. Během centrifugace se erytrocyty a granulocyty
shlukují a sedimentují, zatímco lymfocyty a monocyty zůstávají ve vrstvě plazma – Histopaque
(viz obr. 4.1). Získaná frakce agranulocytárních buněk se následně promyje, abychom ji zbavili
zbylých erytrocytů a dalších nečistot.
Měřený vzorek
 heparinizovaná myší krev – myší krev s přídavkem heparinu (50 U/ml)
Chemikálie a roztoky
 Histopaque 1083 – komerčně dodávaná suspenze o hustotě 1,083 g/ml (Sigma Aldrich, CZ)
 Tűrkův roztok pro barvení leukocytů
Pomůcky a přístroje
 polystyrénové zkumavky pro separaci
 centrifuga
 Bűrkerova komůrka
 termostat
Postup
1. Připravíme si polystyrenovou zkumavku s 300 µl vytemperovaného roztoku Histopaque.
2. Na Histopaque opatrně pipetou navrstvíme 300 µl heparinizované myší krve.
3. Centrifugujeme 15 – 30 minut při 1500 rpm.
4. Během centrifugace si spočítáme pomocí Bürkerovy komůrky počet leukocytů v myší krvi před
separací (viz Obecné laboratorní postupy – str. 11). Pro počítání buněk použijeme směs krve
s Türkovým roztokem (ředění 1 : 20; 10 μl krve + 190 μl Türkova roztoku).
Pro výpočet výtěžnosti metody však nestačí znát počet leukocytů v daném vzorku myší krve, ale je
nutné znát přesné procentuální zastoupení izolovaných monocytů a lymfocytů. To lze stanovit po
obarvení krevního nátěru Leukodifem (viz Obecné laboratorní postupy – str. 9) a následném určení
krevního diferenciálu. Z časových důvodů tento krok ve cvičení vynecháme a množství monocytů a
lymfocytů v dané krvi určíme jednotně pro celou skupinu podle fyziologických hodnot krevního
diferenciálu pro myší krev.
5. Po centrifugaci pipetou opatrně sesbíráme světlou střední vrstvu obsahující mononukleární buňky
(cca 1 – 2 mm). Můžeme sesbírat i celou vrchní vrstvu (plasma + trombocyty + mononukleární
buňky). Pomocí automatických pipet změříme co nejpřesněji objem získané suspenze!
Pozn. Takto získaná suspenze lymfocytů se musí dále promývat, aby se odstranila plazma,
Histopaque a zbytkové erytrocyty. Postup je uveden níže; objemy Hanksova roztoku a 0,87% NH4Cl
záměrně uvedeny nejsou, protože se volí podle objemu separované krve. Ve cvičení ale toto
promývání už neděláme, protože v malých objemech je těžko proveditelné.
 Suspenzi centrifugujeme 10 min při 1500 rpm.
 Sediment resuspendujeme v NH4Cl, tím se zlyzují zbytkové erytrocyty.
 Centrifugujeme 10 min při 1500 rpm.
 Sediment resuspendujeme v Hanksově roztoku.
 Centrifugujeme 10 min při 1500 rpm.
 Sediment resuspendujeme ve zvoleném množství Hanksova roztoku (zpravidla se
vypočítává podle toho, jakou potřebujeme výslednou hustotu suspenze).
6. V odebrané suspenzi spočítáme pomocí Bürkerovy komůrky počet buněk – agranulocytů získaných
po separaci. Buňky jsou viditelné pod mikroskopem i bez obarvení Türkovým roztokem, a proto lze
suspenzi použít pro počítání přímo. Suspenze sice obsahuje poměrně vysoké množství zbytkových
erytrocytů, ty jsou však menší, ploché a bezjaderné na rozdíl od větších kulatých lymfocytů a
monocytů. Buňky počítáme v 50 velkých čtvercích mřížky (viz Obecné laboratorní postupy – str. 10).
Pokud připadá na jeden čtverec velké množství buněk, je možné suspenzi naředit a to přímo
Türkovým roztokem, který zároveň odstraní zbývající erytrocyty.
7. Ze zjištěného počtu agranulocytů, známého objemu 50 čtverců a celkového objemu odebrané
suspenze určíme, kolik buněk jsme při izolaci fakticky získali. Pokud byla suspenze před počítáním
ředěna, je nutno při výpočtu počtu získaných buněk toto ředění také zohlednit!
Hodnocení a výstup
Uveďte počet leukocytů a hodnotu krevního diferenciálu v původní krvi před separací. Z těchto
hodnot vypočtěte, kolik agranulocytů vstupovalo do separace v původních 300 μl krve (viz Obecné
laboratorní postupy – str. 11). Vycházejte z koncentrace buněk zjištěné v kroku 4 postupu, objemu
krve použité pro separaci a fyziologických hodnot počtu lymfocytů pro daný druh.
Uveďte počet agranulocytů po separaci v 50 čtvercích a celkový počet získaných buněk. Vycházejte
z koncentrace buněk zjištěné v kroku 6 postupu a objemu získané suspenze.
Z vypočítaných hodnot určujících počet agranulocytů před a po separaci, určete výtěžnost vlastní
separace v %.