δ13C δ15N 32P Využití izotopů při studiu symbióz •všechny prvky se vyskytují ve formě různých izotopů •stabilní a radioaktivní izotopy •Z – počet protonů •N – počet neutronů •A – počet nukleonů •A = Z + N Oblast stabilních jader Z – počet protonů A – počet nukleonů izotopy Uhlík - carbon (C) Izotop Forma Poločas rozpadu Přirozený výskyt (%) 10C radioaktivní 19,3 s - 11C radioaktivní 20,3 m - 12C stabilní - 98,89 13C stabilní - 1,11 14C* radioaktivní (β-) 5 730 let 10-10 15C radioaktivní 2,45 s - * radiokarbonová metoda; https://cs.wikipedia.org/wiki/Radiokarbonová_metoda_datování Do svrchních vrstev zemské atmosféry dopadají z vesmíru neustále částice primárního kosmického záření. To je z tvořeno převážně protony (kolem 88 %), z 10 % částicemi alfa (jádra helia) a zbytek tvoří převážně elektrony, pozitrony a atomy těžkých prvků. Tyto se sráží s částicemi v atmosféře, čímž vzniká sekundární kosmického záření, jež dopadá až na zemský povrch. Interakcemi sekundárního kosmického záření s molekulami vzduchu neustále vznikají nejrůznější radioaktivní nuklidy prvků zastoupených v atmosféře. Srážkou neutronu sekundárního kosmického záření s atomem dusíku 147N vzniká izotop uhlíku 146C,[3] konkrétně . K produkci radioaktivního uhlíku dochází v horních vrstvách zemské atmosféry, převážně ve výšce kolem 15 kilometrů. Dále se tento izotop oxiduje na oxid uhličitý, jenž se poté promíchává se svou neaktivní formou tvořenou izotopy 126C a 136C, které nejsou radioaktivní. Tato směs je pak fotosyntézou vstřebávána rostlinami a jejich prostřednictvím se dostává i do těl živočichů.[4] Vodík - hydrogen (H) Izotop Forma Poločas rozpadu Přirozený výskyt (%) 1H stabilní - 99,985 2H stabilní - 0,015 3H radioaktivní 12,32 roku - Kyslík - oxygen (O) Izotop Forma Poločas rozpadu Přirozený výskyt (%) 14O radioaktivní 70,6 s - 15O radioaktivní 122,2 s - 16O stabilní - 99,759 17O stabilní - 0,037 18O stabilní - 0,204 19O stabilní - - Dusík - nitrogen (N) Izotop Forma Poločas rozpadu Přirozený výskyt (%) 12N radioaktivní 0,1 s - 13N radioaktivní (β+) 10 min - 14N stabilní - 99,63 15N stabilní - 0,37 16N stabilní - - 17N stabilní - - Fosfor - phosphorus (P) Izotop Forma Poločas rozpadu Přirozený výskyt (%) 31P stabilní - 100 32P* radioaktivní (β-) 14,3 dne - 33P** radioaktivní (β-) 25,3 dne - • 23 izotopů, 24P to 46P (https://en.wikipedia.org/wiki/Isotopes_of_phosphorus) * dceřinný izotop 32S ** dceřinný izotop 33S Stabilní izotopy – používané termíny a veličiny •(přirozený) výskyt = • • •R= • • •R(13CO2)= • • •mechanismy variability výskytu jednotlivých stabilních izotopů •standardy pro jednotlivé stabilní izotopy • látkové množství studovaného izotopu prvku látkové množství všech izotopů daného prvku [%] výskyt (abundance) těžkého izotopu výskyt (abundance) lehkého izotopu 13CO2 12CO2 R = (isotopic) ratio, izotopový poměr Mechanismy variability výskytu stabilních izotopů •frakcionace = variabilita ve výskytu stabilních izotopů; jsou výsledkem (malých) rozdílů ve fyzikálních a chemických vlastnostech izotopů daného prvku; čím větší hmotnostní rozdíl mezi izotopy, tím větší rozdíly ve fyz-chem vlastnostech daných izotopů a tím větší frakcionace •termodynamické rovnováhy •kinetické procesy (asociovány s jednosměrnými procesy – výpar, difůze, disociační reakce…) •enzymatické diskriminace • •všechny tyto mechanismy vedou k variabilitě výskytu v řádu odchylky o max. jednotky procent z původního množství (!) „těžkého“ izotopu! Standardy pro výskyt stabilních izotopů •v současnosti jsou akceptovány 4 mezinárodní standardy pro pět základních prvků využívaných v biologickém výzkumu Primární standard Izotopový poměr R (×106) ± 95% CI Standard Mean Ocean Water (SMOW) 2H/1H 18O/16O 17O/16O 155,76 ± 0,10 2 005,20 ± 0,43 373 ± 15 PeeDee belemnite (PDB) 13C/12C 18O/16O 17O/16O 11 237,2 ± 9,0 2 067,1 ± 2,1 379 ± 15 Air 15N/14N 3 676,5 ± 8,1 Standardy pro výskyt stabilních izotopů •4. primární standard: Canyon Diable meteorite (CD) – pro síru •originální SMOW a PDB již vyčerpány •sekundární standardy: •V-SMOW – směs různých vod; IAEA •SLAP – standard light Antarctic precipitation – Plateau Station, Antarctica •hodnoty sekundárních standardů precizně porovnány s hodnotami primárních standardů (V-SMOW~ SMOW; R(D/H)SLAP=89,02 ± 0,05 •pro 15N/14N se běžně využívá vzduch Definice δ (malé delta) RSample – RStd RStd 0,01123 – 0,01124 0,01124 = -0,00089 RSample – RStd RStd × 1 000 RSample RStd ( –1 ) × 1 000 δ [‰] = RStd –1 × 1 000 RSample ( ) = – 0,89 δ [‰] = RStd –1 × 1 000 RSample ( ) • δ je bezrozměrná veličina • ‰ indikuje pouze matematickou operaci (× 1 000) • vždy nutné specifikovat, s kterým izotopem se pracuje: • δ13C δ15N δ17O δ18O δ2H = δD • izotopový podpis (isotopic signature), izotopové složení (isotopic composition) δ [‰] = RStd –1 × 1 000 RSample ( ) δ > 0 RSample > RStd tj. výskyt těžšího izotopu je větší ve vzorku oproti standardu, vzorek je tedy tímto izotopem obohacen δ < 0 RSample < RStd tj. výskyt těžšího izotopu je větší ve vzorku oproti standardu, vzorek je tedy tímto izotopem ochuzen standardy: δ = 0 δ [‰] = RStd –1 × 1 000 RSample ( ) Výhody použití δ • operací (×1 000) se malé rozdíly v izotopových poměrech stávají snáze „vnímatelné“ • • technika stanovení izotopových poměrů (IRMS) má mnohem větší přesnost při stanovování relativních rozdílů v izotopových poměrech (vztaženo na standard) než při měření absolutních izotopových poměrů • • při využití mezinárodních standardů jsou výsledky vyjádřené jako δ vzájemně plně srovnatelné Diskriminace Δ •Δ = • • •Δ = Rsource Rproduct – 1 δsource – δproduct 1 + δproduct Δ > 0 dsource > dproduct produkt je vzhledem k substrátu ochuzen o těžší izotop Δ < 0 dsource < dproduct produkt je vzhledem k substrátu obohacen o těžší izotop Δ je nezávislé hodnotě dsource Δ hodnota se mění s teplotou Technika stanovení izotopových poměrů • CF-GC-IRMS •= Continuous Flow - Gas Chromatography – Isotope Ratio Mass Spectrometer • • Zjednodušené schéma: •izotopy musí být nejprve převedeny do plynné fáze (H2, N2, CO2, CO, O2, SO2, SF6) •plynová chromatografie – He jako nosič •„mass-spec“ – hmotnostní spektrometr; průchod proudu izotopů (g) elektromagnetickým polem; vychýlení jejich dráhy dle jejich hmotnosti • Příprava vzorků pro mass-spec •C a N v pevných vzorcích (organický materiál, karbonáty) •oxidace: všechen C ® CO2; všechen N ® NOX •redukce: CO2 se neredukuje; NOX ® N2 •vysušení – odstranění veškeré vody •GC kolona: separace CO2 a N2 • •Kyslík ve vodě, organických materiálech nebo karbonátech •pyrolýza (vysoká t) •konverze kyslíku na CO •GC kolona: separace CO od zbytku • •Uhlík a kyslík v CO2 (např. vzduch) •GC kolona: separace CO2 od N2 a O2 Mass-spec Mass-spec Proč jsou stabilní izotopy tak “trendy“? •Protože jsou STABILNÍ •odpadá radioaktivita •nepotřebujete certifikované laboratoře •vzorky nepodléhají „zkáze“ •Protože mass-spec je vysoce citlivá metoda •N: cca 20μg N ~ 0,15 mg sušiny rostlin •C: cca 300μg C ~ 0,025 mg sušiny rostlin •O: cca 0,5 μl vody •C a O v CO2: 4 nmol CO2 •Protože ceny analýz jsou dnes již velmi příznivé •http://stableisotopefacility.ucdavis.edu/ (►) Příčiny variability výskytu stabilních izotopů Kinetické izotopové efekty •Uplatňují se u jednosměrných procesů typu: •evaporace •difuze •disociačních reakcí • kdy dochází k bezprostřednímu odčerpávání produktu (neustavuje se termodynamická rovnováha) • Jsou způsobené různou pohyblivostí různých izotopomerů (např. 12CO2 vs. 13CO2) • • Příčiny variability výskytu stabilních izotopů Kinetické izotopové efekty d18Ovapor = -10‰ d18Owater = 0‰ Příčiny variability výskytu stabilních izotopů Kinetické izotopové efekty CO2 CO2 CO2 CO2 CO2 CO2 CO2 CO2 CO2 d13Catmosphere = -8‰ d13Cleaf = -12.4‰ Latitude effect d 18O -30 -20 -10 0 10 20 30 -90 -60 -30 0 30 60 90 Mean temperature (°C) d18O of meteoric water ROZANSKI et al. 1993 Příčiny variability výskytu stabilních izotopů Rovnovážné izotopové efekty •Uplatňují se u rovnovážných procesů •Hmotnost atomu (molekuly) ovlivňuje její termodynamické vlastnosti •Molekuly obsahující těžké izotopy jsou “stabilnější” než molekuly s lehkými izotopy a mají tedy vyšší abundanci ve “složitějších” sloučeninách • • d13C(HCO3-) > d13C(CO2) CO2 + H2O « H++HCO3- H2_01 O18_01 N15_01 C13_02 european diet CAM plants marine carbonates C 3 plants d 13 C (‰,V-PDB) north american diet terrestrial carbonates atmospheric CO 2 atmospheric CH 4 C 4 plants PDB -50 -40 -30 -20 -10 0 petroleum (marine source rock) Global Depletion of d13CO2 d13CCO2 C13_01 Kinetická frakcionace uhlíku Occurs when a reaction is sensitive to molecular mass of the substance and, so, the reaction velocity differs for both isotopes; for example carboxylation reactions CO2 + rubisco+RUBP 2 (3-PGA) frakcionační faktor je: HCO3- + PEPC+PEP OAA + P C3 rostliny: C4 rostliny: d13C CO2 Hungary winter Food web You are what you eat… …plus a few permile Pages from badeck_etal_2005_RCMS Rozdíly izotopového složení rostlinných orgánů Pages from badeck_etal_2005_RCMS-2 Rozdíly izotopového složení komponent rostlinných orgánů Pages from badeck_etal_2005_RCMS-3 http://en.wikipedia.org/wiki/Stable_isotope (►)