Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
(BÍ6721)
Jana Kopecká Milan Bartoš
Přírodovědecká fakulta MU Brno, Ústav experimentální biologie, Oddělení mikrobiologie
Obsah
Vzor protokolu.............................................................................................................................................................1
Amplifikace genu pro 16S rRNA z bakteriálních lyzátů kultur z čeledi Pasteurellaceae................3
Elektroforéza produktů PCR v agarózovém gelu............................................................................................7
Purifikace produktů PCR......................................................................................................................................11
Elektroforéza purifikovaných produktů PCR, kvantifikace, příprava pro sekvenování...............12
Analýza výsledku sekvenování...........................................................................................................................13
Izolace bakteriální DNA z Escherichia coli....................................................................................................16
Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky....................................................................18
Izolace genomové DNA z biologického materiálu.......................................................................................20
Detekce Chlamydia trachomatis metodou PCR (end-point]....................................................................22
Detekce Chlamydia trachomatis metodou real-time PCR.........................................................................25
Izolace DNA z kvasinek, gelová elektroforéza, stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrometricky.......................................................................................................................................................27
PCR ITS regionu pro odlišení komplexu Saccharomyces sensu stricto, RFLP či sekvenace ITS regionu, gelová elektroforéza...............................................................................................................................31
Informační panel - Základní data o nukleových kyselinách a proteinech..........................................3 5
Informační panel - Vzorce užitečné pro design PCR..................................................................................36
Informační panel - informace užitečné pro práci s PCR..........................................................................37
Informační panel - Tabulka standardního genetického kódu.................................................................38
Informační panel- Parametry prokaryotické buňky..................................................................................39
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Vzor protokolu
Vzor protokolu
Protokol, zpracujte ve formě laboratorního deníku, tzn., že si jej předem připravte a vyplňte (možno i elektronicky). Ve cvičení pak do protokolu vyplňujte pozorování, výpočty, získaná data. Následně pak (nejlépe v rámci cvičení) vypracujte Závěry a Diskusi.
Záznamy z přístrojů získané v průběhu cvičení nebo sekvenační data doložte jako Přílohu.
Protokol odevzdejte ihned po skončení cvičení, nejpozději ve cvičení následujícím.
1
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Vzor protokolu
Protokol z laboratorního cvičení [Název cvičení]
Jméno studentky/ta: Datum provedení: Princip úlohy:
Stručně v jedné větě Změny oproti návodu:
Uveďte rovněž, pokud změny oproti návrhu nebyly
Řešení doprovodných úloh:
Řešení úloh uvedených na konci příslušného návodu ke cvičení
Výsledky:
Sem napište veškerá pozorování, získaná data, výpočty
Diskuse:
Podrobně diskutujte získané výsledky
Závěr:
Napište, co vám cvičení přineslo
Přílohy:
Přiložte záznamy získané z přístrojů v průběhu cvičení, sekvenační záznamy apod.
2
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Amplifikace genu pro 16S rRNA z bakteriálních lyzátů kultur z čeledi Pasteurellaceae
Ampliflkace genu pro 16S rRNA z bakteriálních lyzátů kultur z čeledi
Pasteurellaceae (cvičení č. 1)
Úvodní slovo
Přesná klasifikace řady bakteriálních druhů, a nejen zástupců čeledi Pasteurellaceae, není někdy standardními mikrobiologickými a biochemickými testy možná, a proto se stále častěji používá analýza sekvencí některých evolučně konzervativních genů. Jako vhodným se jeví sekvence genu pro 16S rRNA. Tento gen obsahuje jak konzervativní oblasti, které jsou vhodným místem pro návrh primerů pro sekvenování, tak i variabilní úseky, kterými se jednotlivé bakteriální druhy a poddruhy liší. Úsek genu vyznačený dvěma konzervativními primeryje amplifikován a poté sekvenován. Získaná sekvence je opravena, nepřesné úseky jsou eliminovány a výsledný sled nukleotidů je porovnán s obdobnými sekvencemi v genové bance (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Ktomu lze použít standardních prohledavačů umístěných na www stránkách „National Center for Biotechnology Information" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Jedním z nich je prohledavač označovaný jako BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Pracovat s tímto nástrojem se naučíte ve cvičení č. 3b.
Pro diferenciaci mezi zástupci rozsáhlé čeledi významných zvířecích i lidských patogenů se používá také dalších genů, např. provozního genu rpoB, který kóduje (3 podjednotku RNA polymerázy nebo provozního genu infB, který kóduje translační iniciační faktor IF2. Tyto geny jsou vhodné např. pro diferenciaci druhů Pasteurella, Mannheimia, Moraxella. Postup je stejný jako v případě amplifikace a sekvenování genu pro 16S rRNA. Jen primery a podmínky PCR jsou odlišné.
Toto cvičení sestává ze dvou částí
1) Přípravy bakteriálních lyzátů z kultur čeledi Pasteurellaceae
2) Amplifikace jednoho ze tří výše jmenovaných genů, my provedeme amlpifikaci genu pro 16S rRNA
Pro amplifikaci genu pro 16S rRNA použijeme primerů podle publikace (podle Simmon et al. 2006), a to jako forward primer sekvenci 5F (5'- TTG GAG AGT TTG ATC CTG GCT C - 3') a jako reverse primer sekvenci 1194R (5'- ACG TCA TCC CCA CCT TCC TC - 3'). Délka výsledných aplikonů bude pro zástupce čeledi Pasteurellaceae přibližně 1190 bp.
Cíl cvičení
Připravit jednoduchou metodou lyzáty z kultur bakterií čeledi Pasteurellaceae rostoucích na pevné půdě ve formě kolonií pro provedení metody PCR.
Provést amplifikaci genu pro 16S rRNA, který lze následně použít pro diferenciaci bakterií sekvenováním.
3
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Amplifikace genu pro 16S rRNA z bakteriálních lyzátů kultur z čeledi Pasteurellaceae
Seznam přístrojů
• laminárníbox
• vodní lázeň nebo suchý blok
• třepačka Vortex
• centrifuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 14 000 rpm (20 000 g)
• pikofuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 6 000 rpm
• sada pipet o objemech 20, 200 a 500 u.1
• termocykler
Vlastní pracovní postup Příprava bakteriálního lyzátu
1) Naberte bakteriální kolonii kličkou a resuspendujte ji v 50 u.1 deionizované vody
2) Povařte v suchém bloku 5 min. při 98°C
3) Centrifugujte 3 min. při 14 OOOg
4) Lyzát uchovávejte v ledničce při 4°C až 8°C
5) Pro PCR odeberte 2 u.1 supernatantu
Polymerázová řetězová reakce
1) Vytáhněte polymerázu (Maxima™ Probe qPCR Master Mix 2X, „FERMENTAS"), primery a vodu z mrazničky a nechejte rozpustit při laboratorní teplotě (asi 5 minut)
2) Uracil-DNA glykosyláza vyndejte z mrazničky bezprostředně před použitím
3) Namíchejte směs pro 10 reakcí PCR podle následující tabulky:
Komponenta	Množství na 1 reakci (v u.1)	Množství na 10 reakcí (v u.1)
MasterMix	10,0	100,0
Primer5F (100 u.M)	0,1	1,0
Primerll94R(100 u.M)	0,1	1,0
Uracil DNA glykosyláza	0,1	1,0
Deionizovaná voda	7,7	77,0
DNA (lyzát)	2,0	-
CELKEM	20,0	á 18,0
4) Dobře promíchejte pipetou opatrným natažením a vypuštěním (neprobublávat, nevytvářet bublinky) asi 5x
5) Rozpipetujte směs do jednotlivých zkumavek po 18 u.1
6) Přidejte po 2 u.1 lyzátu a do poslední zkumavky jen vodu
4
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Amplifikace genu pro 16S rRNA z bakteriálních lyzátů kultur z čeledi Pasteurellaceae
7) Zkumavky dobře uzavřete,  krátce stočte kapalinu  na pikofúze a vložte zkumavky do termocykleru
8) Amplifikujte podle následujícího programu pro amplifikaci:
Program pro amplifikaci
Krok	Teplota	Čas
1	37°C	2 min.
2	94°C	15 min.
3	94°C	30 s
4	60°C	30 s
5	72°C	2 min.
6	GOTO 2	29x
7	72°C	2 min.
8	10°C	oo
9)  Po ukončení amplifikace proveďte elektroforézu v 1% agarózovém gelu podle cvičení 2a.
Další informace k této problematice najdete v následující literatuře
Christensen H. and Bisgaard M. 2010: Molecular classification and its impact on diagnostics and understanding the phylogeny and epidemiology of selected members of Pasteurellaceae of veterinary importance. Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 123, Heft Vi, Seiten 20-30.
Simmon K.E., Croft A.C., Petti CA. 2006: Application of SmartGene IDNS Software to Partial 16S rRNA Gene Sequences for a Diverse Group of Bacteria in a Clinical Laboratory. Journal of Clinical Microbiology 44(12), 4400-4406.
Kontrolní otázky a příklady
1) Limit detekce DNA na transluminátoru je přibližně 5 ng. Kolik cyklů PCR musí proběhnout, aby bylo možno detekovat amplifikační produkt genu pro 16S-rRNA o délce 1190 bp, jestliže na počátku reakce máte ve směsi pouze jedinou kopii genu?
2) Taq polymeráza připojuje nukleotidy rychlostí 150 nukleotidů/sekundu. Jak dlouho trvá tomuto enzymu, než syntetizuje fragment o délce 1190 bp?
3) Jaké množství dNTP potřebujete dát minimálně do PCR reakce, abyste měli dostatek stavebního materiálu k amplifikaci fragmentu o délce 1190 bp (za předpokladu, že
5
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Amplifikace genu pro 16S rRNA z bakteriálních lyzátů kultur z čeledi Pasteurellaceae
ve fragmentu je rovnoměrné zastoupení všech nukleotidů)? Předpokládejte, že chcete získat 200 ng fragmentu a máte k dispozici zásobní roztok směsi všech čtyř nukleotidů, ve které má každý nukleotid koncentraci 25 mM.
4) Jak dlouhý amplikon může vzniknout na níže popsaném úseku DNA (je uveden pouze jeden z komplementárních řetězců) pokud má experimentátor k dispozici následující dvojici primerů?
Primer forward: Primer reverse:
5'- ATG TGA GCG GTC TAC TG G - 3' 5'- GAT AGC TAG AAT TGA TAG - 3'
Sekvence, na které probíhá amplifikace:
5'- ATG TGA GCG GTC TAC TGG AAA TG C AGT GCA TCA GTC AGC GAT GGG TGA GTC ACC CCC GTC ACG TCA GAT TCA TGA CTA AGC GTC CGT GCT TGA TCG AGT CTA TCA ATT CTA GCT ATC ATC ATG GTT GAC ATC - 3'
5) Jedna jednotka enzymu Taq polymerázy inkorporuje 10 nmol nukleotidů za 30 minut při teplotě 72 °C. Přepočtěte tuto hodnotu na počet inkorporovaných nukleotidů za minutu.
6) Jestliže frekvence začlenění chybného nukleotidu činí u Taq polymerázy 285 x 10"6, kolikrát může tento enzym chybovat při syntéze 200 ng amplikonu o délce 1 190 bp? Co můžete říct o počtu chybných amplikonu v takovém výsledném vzorku DNA?
6
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Elektroforéza produktů PCR v agarózovém gelu
Elektroforéza produktů PCR v agarózovém gelu
(cvičení č. 2a)
Úvodní slovo
Elektroforéza v agarózovém gelu je standardní metoda pro dělení, identifikaci a purifikaci fragmentů DNA. Touto relativně jednoduchou metodou je možné rozdělit i komplexní směsi fragmentů DNA, které nelze rozdělit jinými způsoby, například centrifugací v hustotním gradientu. Kromě toho je při elektroforéze možné přímo sledovat polohu jednotlivých fragmentů a tím stanovit jejich velikost. Díky fluorescenci po „obarvení" ethidiumbromidem odhadnout i koncentraci DNA.
Princip elektroforézy spočívá v protlačování fragmentů DNA (nebo v principu jakýchkoli jiných makromolekul) rozpuštěných v tekutém prostředí ve stejnosměrném elektrickém poli molekulovým sítem, který tvoří gel agarózy. Chemická struktura agarózy, to jsou střídající se zbytky D-galaktózy a 3,6-anhydro-L-laktózy, vzájemně spojené střídavě glykosidickými vazbami (3-1-4 a ot-1-3.
Elektroforetickou pohyblivost ovlivňuje řada faktorů. Základní silou, která určuje pohyb DNA je skutečnost, že součástí struktury DNA jsou zbytky kyseliny fosforečné, které dávají molekule DNA celkový záporný náboj. Proto DNA putuje ve stejno-směrném elektrickém poli od záporného ke kladnému pólu. Rychlost pohybu DNA v elektrickém poli však není dána velikostí náboje, ale především jejími rozměry. Lineární fragmenty DNA se pohybují rychlostí, která je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Dalším důležitým faktorem je koncentrace agarózového gelu. Čím je vyšší koncentrace agarózy, tím hustší je síť, kterou musí fragmenty DNA procházet. Existují různé komerčně dostupné druhy agaróz, ale obecně platí, že na běžném agarózovém gelu (používají se koncentrace 0,6% až 3,0%) lze úspěšně rozdělit fragmenty o velikostech od 100 bp do 20 000bp (20 kbp). Větší fragmenty vyžadují jiné uspořádání, tzv. pulsní gelovou elektroforézu.
Rovněž konformace DNA má vliv na její pohyb v elektrickém poli. Jinou rychlostí se pohybují kompaktní struktury CCC plasmidové DNA, jinou její OC formy a jinou lineární fragmenty. Kromě toho je elektroforéza ovlivňována intenzitou elektrického pole, složením elektroforetického média (pufru) a teplotou.
V tomto cvičení provedete elektroforézu v 1% agarózovém gelu, v tris-borátovém pufru, při laboratorní teplotě, při napětí 10 V/cm gelu (optimální je 5 V/cm).
DNA je v gelu detekována po „obarvení" ethidiumbromidem. Ethidiumbromid, který má planární strukturu, se vmezeřuje mezi báze v nukleové kyselině. Po ozáření krátkovlnným ultrafialovým zářením fluoreskuje červeným světlem o vlnové délce 590 nm, které je možno zachytit fotografickým zařízením. Ethidiumbromid vmezeřený v DNA září asi 80x intenzivněji než ve volném stavu.
Cíl cvičení
Detekovat amplifikační produkty z předchozích cvičení.
7
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Elektroforéza produktů PCR v agarózovém gelu
Seznam přístrojů
• váhy s váživostí+/-0,1 g
• aparatura pro elektroforézu
• mikrovlnná trouba
• sada pipet o objemech 10, 50 a 200 u.1
Příprava gelu
1) Připravte 1 litr 0,5x TBE pufru ze základního roztoku 5x TBE.
2) Změřte velikost gelu, jehož výška musí být 6 mm.
3) Spočítejte objem gelu a navážku agarózy na 2% gel.
4) Navážku agarózy vsypte do Erlenmeyerovy baňky o objemu alespoň 2x větším, než je uvažovaný objem gelu.
5) Odměřte objem 0,5x TBE pufru a nalijte do Erlenmeyerovy baňky s agarózou.
6) Vynulujte váhy s Erlenmeyerovou baňkou.
7) Dokonale rozvařte agarózu v mikrovlnné troubě, tzn. za průběžného míchání, přiveďte 3 až 4x k varu. Pozor na utajený var!
8) Znovu zvažte Erlenmeyerovu baňku s rozvařenou agarózou a úbytek hmotnosti doplňte destilovanou vodou.
9) Zchlaďte rozvařenou agarózu na teplotu 50 až 60 °C (odhadem).
10) Přidejte roztok ethidium bromidu (0,15 mg/ml) v množství stanoveném podle objemu gelu. Platí, že množství přidaného objemu roztoku ethidiumbromidu v mikrolitrech musí být stejné jako objem gelu v mililitrech.
11) V průběhu zchlazování agarózy upevněte matrici pro tvorbu komůrek (hřebínek) do nalévací aparatury. Dolní okraj hřebínku se nesmí dotýkat dna - optimální je výška lmm nad dnem. Nalévací aparatura musí být umístěna na vodorovné podložce.
12) Ochlazenou agarózu nalijte po opatrném, ale důkladném zamíchání do nalévací aparatury, čistou špičkou odstraňte případné bubliny.
13) Nechte gel zatuhnout (asi 30 min).
14) V průběhu tuhnutí nalijte elektroforetický pufr do elektroforetické vany.
15) Po zatuhnutí gelu vložte nalévací aparaturu včetně hřebínku do elektroforetické vany.
16) Tahem kolmo vzhůru vyjměte hřebínek.
17) Zkontrolujte neporušenost komůrek pro nanášení vzorku.
18) Zkontrolujte výšku hladiny pufru nad gelem - musí být alespoň lmm nad gelem.
Nanesení vzorků, elektroforéza
1) Upravte polohu černé fólie pod nanášecí komůrky.
2) Do vzorku po provedené PCR napipetujte koncentrovaný nanášecí pufr (6 x GLB) v poměru 5 : 1 (vzorek : 6 x GLB).
3) Pipetou naneste 10 u.1 směsi do komůrek pod hladinu elektroforetického pufru.
4) Připojte elektroforetické kabely k vaně, zasuňte bezpečnostní kryt a připojte kabely ke zdroji - černý kabel k zápornému pólu, červený kabel ke kladnému pólu. Pozor na správnou orientaci vany. DNA putuje od minus k plus pólu!
5) Proveďte elektroforézu při 10 V/cm gelu.
6) Po 5 minutách zkontrolujte průběh elektroforézy, zejména správný směr pohybu detekční barvičky (bromfenolová modř) obsažené v 6 x GLB pufru.
8
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Elektroforéza produktů PCR v agarózovém gelu
7) Poté, co detekční barvička dosáhne asi 2/3 gelu (nebo uběhne předepsaná doba po kterou se má elektroforéza provádět, což je v našem případě asi 30 min), ukončete elektroforézu.
8) Odpojte elektrické kabely od zdroje.
9) Nasaďte si rukavice.
10) Odsuňte bezpečnostní kryt z elektroforetické vany.
11) Přeneste  gel   na   UV-transluminátor,   proveďte  vizuální  kontrolu  gelu, případně vyfotografujte na dokumentačním zařízení.
Další informace k této problematice najdete v následující literatuře
Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press
Složení roztoků
5 x Tris-borátový pufr (5xTBE pufr)
(0,089M tris-borát/0,089M kyselina boritá/0,002M EDTA)
1) Navažte a postupně rozpusťte v 900 ml destilované vody 54 g trishydroxymethyl-aminomethanu a 27,5 g kyseliny borité.
2) Přidejte 20 ml 0,5M EDTA (pH 8,0).
3) Doplňte objem na 1 000 ml v analytické odměrné baňce.
4) Přelijte roztok do 1 000 ml láhve se šroubovacím uzávěrem.
5) Skladujte při 4 až 8 °C, při tomto způsobu skladování možno používat 6 měsíců.
Zásobní roztok ethidiumbromidu (10 mg/ml)
Ethidiumbromid je červená krystalická látka. Je to mutagen a karcinogén, proto je nutné při jakékoli manipulaci s touto látkou nebo roztoky, které ethidiumbromid obsahují, pracovat v rukavicích a dodržovat zásady manipulace s mutageny a karcinogény !
1) Na analytických vahách navažte 100 mg krystalického ethidiumbromidu do umělohmotné zkumavky s uzávěrem.
2) Přidejte 10 ml destilované vody.
3) Po rozpuštění ethidiumbromidu skladujte roztok při laboratorní teplotě ve tmě, možno skladovat po dobu 5 let.
Nanášecí elektroforetický pufr s barvičkou (6 x GLB)
Pufr se připravuje v šestinásobném zahuštění, obsahuje detekční barvičku bromfenolová modř.
1) Na analytických vahách navažte 0,5 g bromfenolové modři
2) Rozpusťte v 50 ml 1 x TBE pufru.
3) Přidejte 50 ml glycerolu.
4) Doplňte objem do 200 ml pomocí 1 x TBE pufru v analytické odměrné baňce.
5) Sterilizujte v přehřáté páře při 112 °C/30min.
6) Část roztoku po 1 ml sterilně rozpipetujte do sterilních 1,5 ml mikrozkumavek.
7) Rozpipetované dávky a zbytek uskladněte při 4 až 8 °C, lze skladovat po dobu 10 let.
9
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Elektroforéza produktů PCR v agarózovém gelu
Kontrolní otázky a příklady
1) Závislost velikosti DNA na elektroforetické pohyblivosti není lineární. V určitém zjednodušení může být vyjádřena logaritmickou funkcí. Stanovte délku amplifikačního produktu z obrázku výsledné elektroforézy.
Elektroforetická pohyblivost amplikonu = 34,0 mm
Velikost standardů Elektroforetická pohyblivost
A = 500bp 29,0 mm
B = 400bp 32,5 mm
C = 300 bp 35,5 mm
D = 200 bp 38,0 mm
E = 100 bp 45,0 mm
Návod řešení:
Vyneste hodnoty přirozeného logaritmu velikosti standardů a elektroforetické pohyblivosti do grafu a z něho pak odečtěte velikost amplikonu.
N = In X
kde
N = elektroforetická pohyblivost v cm X = velikost DNA fragmentu v bp
2) Jaká je výsledná koncentrace ethidiumbromidu ve vámi připraveném agarózovém gelu?
3) Kolik ml zásobního roztoku ethidiumbromidu (10 mg/ml) použijete pro přípravu 100 ml
roztoku o koncentraci 0,15 mg/ml?
10
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
PCR produktů PCR
Purifikace produktů PCR (cvičení č. 2b)
Úvodní slovo
Během PCR reakce vznikají v malém množství i nespecifické amplikony. Pro některé aplikace (in vitro translace, klonování) je nutné získat potřebné úseky DNA ve velmi čisté podobě, bez příměsí nespecifických amplikonů a v roztoku, který by neinhiboval následné reakce. Po rozdělení produktů takové PCR reakce v agarózovém gelu je možné požadovaný fragment DNA (amplikon) z gelu vyříznout a izolovat ho.
PCR produkty se používají také k sekvenování. I v tomto případě je vhodné amplikony purifikovat a zbavit je přebytečných solí, zbytků polymerázy, nespotřebovaných nukleotidů a primerů. Pokud při PCR nevznikají nespecifické produkty, je purifikace jednodušší, není zapotřebí elektroforézy a vyřezávání amplikonů z gelu.
K výše uvedeným purifikačním procesům (vyčištění PCR směsi nebo izolace amplikonů vyřezaných z gelu) byly vyvinuty komerčně dostupné soupravy, které to umožňují. Základem je pufr, který rozpustí agarózu a uvolní tak DNA do roztoku. Z roztoku je pak DNA vyvázána na silikagel a zachycena na filtr „chromatografické" kolonky. Následuje promytí kolonky, které je spojeno s odstraněním všech kontaminujících látek a eluce čisté DNA do požadovaného roztoku. Takto izolovaný PCR fragment je velmi čistý, bez přítomnosti nespecifických produktů a solí.
Cíl cvičení
Izolovat PCR amplikon z roztoku nebo z gelu pro účely sekvenování
Seznam přístrojů
• sada pipet o objemech 10, 100 a 1000 u.1
• suchý termoblok
• centrifuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 14 000 rpm (20 000 g)
Vlastní pracovní postup
K purifikaci použijeme některou z komerčně dostupných souprav a budeme postupovat přesně podle návodu výrobce. Návod je veden v anglickém jazyce a studenti tak budou mít možnost zdokonalit se v porozumění psaného odborného textu.
Získané produkty prověří studenti elektroforézou v agarózovém gelu v následujícím cvičení.
Další informace k této problematice najdete v následující literatuře
Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manuál. Cold Spring Harbor Laboratory Press
Manuály společnosti QIAGEN (Germany)
Kontrolní otázky a příklady
1) Spočítejte, jaké přetížení působí na dně zkumavky na materiál, jestliže jste na vaší centrifuze použili maximální otáčky, tj. 14 000 rpm. Poloměr rotoru je 7 cm.
11
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Analýza výsledků sekvenování
Elektroforéza puriflkovaných produktů PCR, kvantifikace, příprava pro
sekvenování (cvičení č. 3a)
Úvodní slovo
Poznámky k agarózové elektroforéze jsou uvedeny ve cvičení č. 2a Cíl cvičení
Provést kontrolu purifikace produktů PCR, odhadnout koncentraci produktu a připravit vzorek k odeslání komerční firmě pro účely sekvenování
Seznam přístrojů
• pomůcky k elektroforéze podle cvičení č. 2a
• UV spektrofotometr podle cvičení 4a
• pikofuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 6 000 rpm
Vlastní pracovní postup
Elektroforéza a odhad koncentrace
1) Provedeme elektroforézu malého množství PCR produktu ze cvičení 2b
2) Součástí nanášených vzorků bude i vhodný kvantifikační standard, který umožní odhad koncentrace DNA
Kvantifikační standard je sériově naředěná směs různě dlouhých fragmentů dsDNA o známé koncentraci. Odhad koncentrace se provádí porovnáním intenzity fluorescence fragmentu kvantifikačního standardu s intenzitou fluorescence purifikovaného PCR produktu. Hodnota je ovšem velmi orientační a nelze jí nahradit spektrofotometrii nebo fluorometrii. Nicméně v některých případech může být pro další manipulace s DNA dostačující.
Příprava vzorku pro sekvenování
1) Purifikovaný amplikon nezaměnitelně označíme, uvedeme informaci o stanovené koncentraci DNA a vložíme do transportního sáčku - poštovní obálky
2) Na stránkách společnosti Macrogen (http://dna.macrogen.com/eng/) se seznámíme s nabídkou firmy týkající se sekvenování, způsoby sekvenování, objednávání a odesílání vzorků na sekvenování. O zjištěných skutečnostech sepíšeme krátkou zprávu. Rovněž zjistíme, na jakou adresu odešleme naše vzorky a co dalšího ještě musíme vložit do obálky.
Další informace k této problematice najdete v následující literatuře
Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manuál. Cold Spring Harbor Laboratory Press
Internetové stránky společností Macrogen (http://dna.macrogen.com/eng/) a Generi-Biotech (http://www.generi-biotech.com)
12
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Analýza výsledků sekvenování
Analýza výsledku sekvenování (cvičení č. 3b)
Úvodní slovo
Toto cvičení je přímým pokračováním cvičení č. 1. Pro druhové zařazení může postačovat sekvence části genu pro 16S rRNA. Ověření a přesnější klasifikace lze dosáhnout porovnáním sekvencí více genů v databázi. Pro účely klasifikace vybraných zástupců čeledi Pasteurelllaceae jsme zvolili kromě genu pro 16S rRNA provozní geny rpoB a infB.
Sekvenování se provádí z jednoho z primerů pro sekvenování nebo lze navrhnout vhodnou sekvenci uvnitř amplikonu. V našem případě je takovou sekvencí primer 810R, který leží uvnitř amplikonu získaného amplifikací genu pro 16S rRNA. Nepoužívá se primer amplifikační (1194R). Přehled amplifikačních a sekvenačních primerů je uveden v této tabulce:
Gen	Primer	Účel	Sekvence	Citace
16S rRNA	5F	A, S	5'- TTG GAG AGT TTG ATC CTG GCT C - 3'	Simmon et al. 2006
	1194R	A	5'- ACG TCA TCC CCA CCT TCC TC - 3'	Simmon et al. 2006
	810R	S	5'- GGC GTG GAC TTC CAG GGT ATC T - 3'	Simmon et al. 2006
rpoB	Pasrpob-L	A, S	5'- GCA GTG AAA GAR TTC TTT GGT TC - 3'	Korczaketal. 2004
	Rpob-R	A, S	5'- GTT GCA TGT TNG NAC CCA T - 3'	Korczaketal. 2004
infB	infB-F1241	A, S	5'- CCT GAC TAY ATT CGT AAA GC - 3'	Christensen et al. 2004
	infB-R1727	A, S	5'- GTA GCA ACC GGA CCA CGA CCT TTA T - 3'	Christensen et al. 2004
A = amplifikace, S = sekvenování
Délka amplikonu z genu pro 16S rRNA je přibližně 1190 bp Délka amplikonu z genu pro rpoB je přibližně 558 bp Délka amplikonu z genu pro infB je přibližně 486 bp
Pro porovnávání námi získaných sekvencí s celosvětovou databází použijeme algoritmus BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), který je v současnosti asi nejrozšířenějším heuristickým algoritmem, který umožňuje prohledávat rozsáhlé databáze. Pro účely srovnávání nukleotidových DNA sekvencí bakterií je nejvhodnější využít databáze BLASTN. Po seznámení se s vzhledem příslušných www stránek zvolíme nastavení default, je ale možné zvolit vlastní parametry prohledávání.
13
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Analýza výsledků sekvenování
Cíl cvičení
Analyzovat výsledky sekvenování
Seznam přístrojů
Toto je pouze teoretické cvičení, potřebovat budete pouze záznamy o sekvenování a výsledné protokoly
Analýzy provedete s využitím volně dostupných internetových nástrojů Jediným přístrojem pro toto cvičení je počítač napojený na internet
Vlastní pracovní postup
1) Stáhněte si v elektronické formě "Záznamy o sekvenování", vyberte si 3 záznamy k libovolnému vzorku označenému čísly 22 až 44
2) Vyžádejte si od vyučujícího "Výsledné protokoly ze sekvenování"
3) Zkontrolujte a opravte sekvence
1) Prohlédněte si záznamy sekvencí jednotlivých genů a vyhledejte ty nukleotidy, které nejsou dobře čitelné.
2) Opravte v záznamu software neurčené nukleotidy, případně vyřaďte ty, které jsou nečitelné.
3) Zkontrolujte, jestli na záznamu dokážete najít jeden z primerů, které byly použity k amplifikaci. Je to ten druhý primer než ten, který byl použit pro sekvenování.
4) Zkontrolujte, jak dlouhý je získaný sekvenační záznam oproti délce amplikonu.
5) Vyznačte v sekvenci celistvý úsek, který už po opravě neobsahuje žádné nečitelné nebo špatně čitelné nukleotidy.
4) Prohledejte databázi a zařaďte výsledky
6) Vyhledejte prohledavač označovaný jako BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
7) Vložte sekvenci celistvého úseku do prohledavače.
8) Vyčkejte, až program provede porovnání vaší sekvence s databází.
9) Odečtěte    výsledek    a    zaznamenejte    nejpravděpodobnější    zařazení druhu do vyhodnocovací tabulky.
10) Postupně proveďte vyhledání a zařazení podle všech tří sekvencí, genů pro 16S rRNA, rpoB a infB.
11) Určete, o jaký druh bakterie se nejspíš jednalo.
12) Porovnejte svůj výsledek s tabulkou, ve které jsou uvedeny výsledky zařazující bakterie podle biochemických charakteristik
14
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Analýza výsledků sekvenování
Vzor vyhodnocovací tabulky
Vzorek č.	Zařazení podle			Závěr
	16S rRNA	rpoB	infB	
22				
24				
30				
33				
35				
36X				
37X				
38				
40				
41				
42				
43				
44				
45	Gallibacterium anatis (Actinobacillus sp.)	Gallibacterium anatis	Gallibacterium anatis	Gallibacterium anatis
Další informace k této problematice najdete v následující literatuře
Cvrčkova, F. 2006: Úvod do praktické bioinformatiky. Academia, Praha.
Šmarda et al. 2005: Metody molekulární biologie, Masarykova Universita, Brno
Simmon K.E., Croft A.C., Petti CA. 2006: Application of SmartGene IDNS Software to Partial 16S rRNA Gene Sequences for a Diverse Group of Bacteria in a Clinical Laboratory. Journal of Clinical Microbiology 44(12), 4400-4406.
Korczak B., Christensen H., Emier S., Frey J., Kuhnert P. (2004): Phylogeny of the family Pasteurellaceae based on rpoB sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54, 1393-1399.
Christensen H., Kuhnert P., Olsen J.E., Bisgaard M. (2004): Comparative phylogenies of the housekeeping genes atpD, infB and rpoB and the 16S rRNA gene within the Pasteurellaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54,1601-1609.
15
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Izolace bakteriální DNA z Escherichia coli
Izolace bakteriální DNA z Escherichia coli (cvičení č. 4a)
Úvodní slovo
Obecný postup izolace bakteriální DNA sestává ze čtyř základních kroků:
> Růstu kultury a sedimentace buněk
> Rozbití buněk a jejich obsahu
> Zpracování buněčného extraktu - odstranění všeho kromě DNA
> Zahuštění výsledného roztoku
Nízkomolekulární relativně znečištěnou DNA jsme izolovali jako hrubý lyzát buněk v úloze č. 1. Analýza bakteriálních genů však vyžaduje často izolaci i vysokomolekulárni genomové DNA, která musí být kromě toho získána ve vysoké čistotě. V současné době je na trhu k dispozici celá řada výtečných komerčních souprav, které jsou pro mikrobiológa metodou první volby. Teprve když komerční souprava nedokáže poskytnout dostatečně kvalitní izolát pro analýzu, je třeba sáhnout do teorie a zajistit s pomocí dostupné literatury nebo konzultace s molekulárním biologem jinou metodu.
Principem soupravy, kterou budeme v této úloze používat, je lyže buněk aniontovým detergentem v přítomnosti DNA stabilizátoru. Stabilizátor inhibuje aktivitu vnitrobuněčných DNáz a také DNáz, které by se mohly do izolovaného materiálu dostat z vnějšího prostředí. RNA je ze vzorku odstraněna působením RNázy. Další kontaminanty, např. proteiny, jsou odstraněny precipitací v roztoku s vysokou koncentrací solí. Genomová DNA je získána precipitací v alkoholu a precipitát je rozpuštěn v roztoku lmM EDTA/10 mM Tris.CI pH= 7,5. Izolovaná DNA by měla mít poměr absorbance A260/A280 mezi 1,7-1,9.
Cíl cvičení
Izolovat genomovou DNA bakterie Escherichia coli komerční soupravou
Seznam přístrojů
• vodní lázeň nebo suchý blok
• třepačka Vortex
• centrifuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 14 000 rpm (20 000 g)
• pikofúga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 6 000 rpm
• sada pipet o objemech 20, 200 a 500 uJ
• stopky
Vlastní pracovní postup
K izolaci použijeme některou z komerčně dostupných souprav a budeme postupovat přesně podle návodu výrobce. Návod je veden v anglickém jazyce a studenti tak budou mít možnost zdokonalit se v porozumění psaného odborného textu.
Prvním krokem izolace bude stanovení počtu bakterií ve vzorku. Pro Escherichia coli platí, že při vlnové délce 600 nm hodnota optické hustoty OD60o = 1 odpovídá asi 8 x 108 buněk/ml. Předpokládejme dále, že je závislost počtu buněk na OD60o lineární.
16
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Izolace bakteriální DNA z Escherichia coli
Koncentraci a čistotu izolované DNA proměříme spektrofotometricky ve cvičení č. 4b. Další informace k této problematice najdete v následující literatuře
Marmur, J. 1961: A procedure for isolation of DNA from microorganisms. Journal of Molecular Biology 3, 208-218. Jedná se o první článek, ve kterém jsou popsány základní principy izolace DNA.
Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press
Manuál společnosti QIAGEN (Germany)
Kontrolní otázky a příklady
1) Jakou hmotnost má chromozóm Escherichia coli, u něhož bylo zjištěno celkem 4 x 106 párů nukleotidů? Průměrná molekulová hmotnost jednoho bp je 650.
2) Jestliže máte koncentraci Escherichia coli v suspenzi 8 x 108 buněk/ml, jaké maximální množství DNA můžete teoreticky izolovat ze 2 ml této suspenze?
3) Kolik molekul chromozómu Escherichia coli by bylo obsaženo v 1 u.g DNA?
4) Jak dlouhý je v lineárním stavu chromozóm Escherichia colR Připomeňme si, že vzdálenost mezi dvěma páry bazí je 0,34 nm.
5) Doplňte následující tabulku týkající se genomové DNA různých organismů
Organismus	Velikost DNA (bp)	Molekulová hmotnost	Hmotnost 1 molekuly	Počet molekul v 1 g
Escherichia coli	4,0 x 106			
Bakteriofág X	48 514			
Saccharomyces cerevisiae	1,6 x 107			
Člověk	3,2 x 109			
17
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky
Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky
(cvičení č. 4b)
Úvodní slovo
Rychlou a jednoduchou metodu stanovení koncentrace nukleových kyselin představuje proměření spektra v rozsahu 230 až 320 nm. Báze v nukleových kyselinách mají absorpční maximum při 260 nm. Obecně platí, že pokud je hodnota absorbance A260 v 1 cm kyvetě rovná 1,0, je koncentrace dvouřetězcové DNA v kyvetě 50 u.g/ml. Pro jednořetězcovou DNA a RNA platí hodnota 38 u.g/ml. Čistota DNA je nejčastěji odhadována na základě poměru absorbancí při různých vlnových délkách. Pro čistou DNA platí poměr:
A26o/A28o = 1,80
Tento parametr je nejdůležitější a v běžné praxi nejčastěji používaný. Pokud je hodnota jiná než 1,80, pak je vzorek DNA kontaminován proteiny nebo RNA.
Druhý poměr, který je vhodné sledovat je
A26o/A23o > 2,00
Pokud je tento poměr pod 2,00, pak není izolát čistý a obsahuje zbytky roztoků z izolační soupravy. Poměr A260/A23o nesmí přesáhnout hodnotu 3,00.
Cíl cvičení
Stanovit koncentraci a posoudit čistotu izolované bakteriální DNA
Seznam přístrojů
• UV-VIS spektrofotometr
• sada pipet o objemech 20, 200 a 500 u.1
Vlastní pracovní postup
1) Zapněte spektrofotometr.
2) Do kyvety napipetujte 100 u.1 roztoku AE (eluční pufr ze cvičení č. 1) a proveďte nastavení nulového pozadí (tzv. blank).
3) DNA izolovanou ve cvičení č. 1 nařeďte lOx tak, že k 10 uJ DNA napipetujte 90 uJ roztoku AE.
4) Naředěnou DNA napipetujte do kyvety a změřte hodnoty absorbance při 230, 260 a 280 nm.
18
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky
5) Je-li naměřená hodnota A26o mimo hodnoty 0,1 až 0,3, opakujte ředění vzorku DNA. Jen v rozsahu hodnot 0,1 až 0,3 je závislost koncentrace na absorbanci lineární a naměřené hodnoty jsou přesné.
6) Vyhodnoťte dosažené výsledky.
Další informace k této problematice najdete v následující literatuře
Manchester, K. L. 1995: Calue of A26o/2so ratios for measurements of purity of nucleic acids. BioTechniques 19, 208-219.
Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manuál. Cold Spring Harbor Laboratory Press
Kontrolní otázky a příklady
1) Kolik u.1 vzorku DNA nanesete do reakce, potřebujete-li 2 ng a máte k dispozici roztok DNA
o koncentraci 2 u.g/ml?
2) Kolik molekul DNA plasmidu pCR2.1 o velikosti 3 900 bp je obsaženo ve 100 u.1 vzorku o koncentraci DNA 50 u.g/ml?
3) Kolikrát musíte naředit roztok DNA o koncentraci 100 u.g/ml, aby byla jeho absorbance při 260 nm rovna hodnotě 0,2?
4) Kolik ředícího roztoku přidáte do 30 u.1 vzorku DNA o koncentraci 60 u.g/ml tak, aby koncentrace DNA po zředění klesla na 15 ng/u.1?
5) Kolik molekul plasmidové DNA o velikosti 50 000 bp obsahuje 100 u.1 roztoku, u něhož byla
hodnota absorbance při 260 nm po 10 násobném zředění rovna 0,15?
19
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Izolace genomové DNA z biologického materiálu
Izolace genomové DNA z biologického materiálu
(cvičení č. 5a)
Úvodní slovo
Chlamydia trachomatis jsou gramnegativní bakterie, které parazitují uvnitř vnímavých buněk sliznic. Jedná se o jednoho ze tří původců chlamydiózy. Chlamydia trachomatis se přenáší pohlavním stykem a může u mužů i u žen způsobit vážné zdravotní komplikace. Předpokládá se, že ročně je chlamydiemi infikováno asi 90 milionů lidí.
Laboratorně se chlamydie vyšetřují již od počátku 80. let minulého století. Zpočátku byly chlamydie stanovovány cytologický a tento test byl doplněn kultivací na buněčných kulturách. V 80. a 90. letech pak byly vyvinuty komerční soupravy na detekci antigénu a později i nukleových kyselin.
Klinické vzorky, které se používají k detekci chlamydií, jsou stery z různých tělesných částí nebo tělní tekutiny, jak je uvedeno v tabulce. V tabulce jsou taky uvedeny doporučené diagnostické metody podle typu vzorku, všimněte si, že metoda stanovení z DNA je univerzální pro všechny typy vzorků.
	Diagnostická metoda				
Vzorek	Mikroskopie	Kultivace	Imunoanalýza	Hybridizace	PCR
Spojivkový	+	+	+	+	+
Nasofaryngeální	-	+	-	-	+
Cervikální	-	+	+	+	+
Uterální	-	+	+	+	+
Rektální	-	-	-	-	+
Poševní	-	-	-	-	+
Vaginální	-	-	-	-	+
Introitální	-	-	-	-	+
Moč	-	-	-	-	+
Lymfatický	-	+	-	-	+
Semeno	-	-	-	-	+
V praktiku nepoužijeme přímo klinický materiál, ale vzorky imitující moč obohacené umělou DNA, obsahující část sekvence genomu Chlamydia trachomatis. Přesto budeme ke vzorkům přistupovat jako k potenciálně nebezpečnému klinickému materiálu a budeme dodržovat příslušné bezpečnostní předpisy a pravidla bezpečnosti práce.
Izolovanou DNA použijeme pro metodu polymerázové řetězové reakce ve standardním systému a v modifikaci real-time PCR.
Cíl cvičení
Izolovat genomovou DNA bakterie Chlamydia trachomatis komerční soupravou z klinického materiálu.
Seznam přístrojů
• vodní lázeň nebo suchý blok
• třepačka Vortex
20
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Izolace genomové DNA z biologického materiálu
• centrifuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 14 000 rpm (20 000 g)
• pikofuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 6 000 rpm
• sada pipet o objemech 20, 200 a 500 uJ
• stopky
Vlastní pracovní postup
K izolaci použijeme některou z komerčně dostupných souprav a budeme postupovat přesně podle návodu výrobce. Návod je veden v anglickém jazyce a studenti tak budou mít možnost zdokonalit se v porozumění psaného odborného textu.
Koncentraci a čistotu izolované DNA proměříme spektrofotometricky ve cvičení č. 4b.
Pak provedeme vlastní detekci metodou PCR ve cvičeních 5a a 5b.
Další informace k této problematice najdete v následující literatuře
Marmur, J. 1961: A procedure for isolation of DNA from microorganisms. Journal of Molecular Biology 3, 208-218. Jedná se o první článek, ve kterém jsou popsány základní principy izolace DNA.
Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press
Manuál společnosti Ql AG EN (Germany)
Chernesky, M.A. 2005: The laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Can J Infect Dis Med Microbiol, 16(l):39-44.
http://microbewiki.kenvon.edu/index.php/Chlamydia Kontrolní otázky a příklady
1) Jakou hmotnost má chromozóm Chlamydia trachomatis, u něhož bylo zjištěno celkem 1 042 519 párů nukleotidů? Průměrná molekulová hmotnost jednoho bp je 650.
2) Kolik molekul chromozómu Chlamydia trachomatis by bylo obsaženo v 1 ug DNA?
3) Jak dlouhý je v lineárním stavu chromozóm Chlamydia trachomatis? Připomeňme si, že vzdálenost mezi dvěma páry bazí je 0,34 nm.
4) Kolik párů nukleotidů bylo nalezeno u Ch. pneumoniae?
5) Kolik strukturních  genů  bylo  popsáno  u  Chlamydia  trachomatis,  porovnejte  s Ch. pneumoniae?
6) V kolika genech se oba druhy liší/shodují?
21
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Detekce Chlamydia trachomatis metodou PCR (end-point)
Detekce Chlamydia trachomatis metodou PCR (end-point)
(cvičení č. 5b)
Úvodní slovo
Souprava, se kterou budete ve cvičení pracovat je určena k detekci chromozomální DNA bakterie Chlamydia trachomatis na principu amplifikace sekvence vícekopiového genu pro 16S RNA metodou polymerázové řetězové reakce. Detekční souprava využívá technologii "hot start", která minimalizuje nespecifické reakce a zajišťuje maximální citlivost reakce. Součástí MasterMixu je jako stavební komponenta DNA nukleotid dUTP a enzym uracil-DNA-glykosyláza (UDG), který umožňuje odstranění případných kontaminací produkty amplifikace.
Souprava obsahuje tzv. "interní kontrolu", která je komponentou „MasterMixu"; interní kontrola je určena ke kontrole inhibice PCR.
Cíl cvičení
Provést detekci Chlamydia trachomatis ve vzorcích ze cvičení 5a polymerázovou řetězovou reakci metodou end-point PCR
Seznam přístrojů
• termocykler
• PCR box
• sada pipet o objemech 2, 20, 200 a 500 u.1
• stojánky na zkumavky a PCR zkumavky
Vlastní pracovní postup
Namíchání reakce
Všechny kroky je možno provádět při laboratorní teplotě
1) Nechejte rozpustit MasterMix po dobu asi 5 minut a poté promíchejte několikerým, ale opatrným převracením zkumavky
2) Rozpipetujte MasterMix po 36 u.1 do PCR zkumavek
3) Přidejte po 4 u.1 izolované DNA
4) Do samostatné zkumavky přidejte 4 u.1 pozitivní kontroly
5) Výsledný objem reakčních směsí je 40 u.1
6) Uzavřete PCR zkumavky, krátce zcentrifugujte veškerou tekutinu ke dnu, vložte do termocyleru a proveďte amplifikaci
22
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Detekce Chlamydia trachomatis metodou PCR (end-point)
Amplifikace
Proces	Teplota	Čas
Opracování UDG	37°C	2 min.
Aktivace reakce	95°C	15 min.
PCR	opakovat 45x	
Denaturace	95°C	20 s
Annealing	58°C	20 s
Polymerace	72°C	40 s
Finalizace		
Konečná extenze	72°C	2 min.
Zchlazení	12°C	nekonečno
Vyhodnocení
Provedete elektroforézou ve 2% agarózovém gelu postupem podle cvičení č. 2a. Specifický amplikon pro Chlamydia trachomatis má velikost 300 bp, interní kontrola pak 600 bp.
Interní kontrola
Výsledek
ANO NE
POZITIVNÍ POZITIVNÍ
ANO
NEGATIVNÍ
ANO NE
ANO NE
POZITIVNÍ POZITIVNÍ NEGATIVNÍ NEHODNOTITELNÝ
Pozitivní kontrola
Specifický amplikon
ANO ANO
Negativní kontrola Vzorek
NE
ANO ANO NE NE
V protokolu řádně popište elektroforetický záznam a vypracujte tabulku, ve které uvedete výsledky pro jednotlivé vzorky
Další informace k této problematice najdete v následující literatuře
Persing (2011): Molecular Microbiology - second edition, ASM Press, Washington, D.C.
Manuál dodavatele detekční soupravy
23
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Detekce Chlamydia trachomatis metodou PCR (end-point)
Kontrolní otázky a příklady
1) Limit detekce DNA na transluminátoru je přibližně 5 ng. Kolik cyklů PCR musí proběhnout, aby bylo možno detekovat amplifikační produkt o délce 300 bp, jestliže na počátku reakce máte ve směsi pouze jedinou kopii genu pro 16S Chlamydia trachomatis?
2) Taq polymeráza připojuje nukleotidy rychlostí 150 nukleotidů/sekundu. Jak dlouho trvá tomuto enzymu, než nasyntetizuje fragmenty o délce 300 a 600 bp?
3) Jedna jednotka enzymu Taq polymerázy inkorporuje 10 nmol nukleotidů za 30 minut při teplotě 72 °C. Přepočtěte tuto hodnotu na počet inkorporovaných nukleotidů za minutu.
4) Jestliže frekvence začlenění chybného nukleotidu činí u Taq polymerázy 285 x 10"6, kolikrát může tento enzym chybovat při syntéze 200 ng amplikonu o délce 600 bp? Co můžete říct o počtu chybných amplikonu v takovém výsledném vzorku DNA?
24
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Detekce Chlamydia trachomatis metodou PCR (end-point)
Detekce Chlamydia trachomatis metodou real-time PCR
(cvičení č. 6)
Úvodní slovo
Souprava, se kterou budete ve cvičení, zaciluje stejný gen a má stejné použití jako ta, která byla použita ve cvičení 5b, ale obsahuje kromě sady primerů i TaqMan sondy umožňující detekci produktů PCR v reálném čase. Souprava není určena ke kvantitativnímu stanovení, ale pouze k detekci přítomnosti genomu Chlamydia trachomatis. Přesto je možné na základě získaných hodnot Ct odhadnout množství genomů, které byly přítomny ve vzorku na počátku.
Výhodou této metody je, že nevyžaduje žádnou post-PCR detekci, výsledek je hodnotitelný přímo ze záznamu o průběhu reakce. Odpadá tak mimo jiné možnost kontaminace vzorků amplikony z předchozích reakcí, což je častým problémem u metod, kdy detekce amplikonů probíhá po ukončení PCR na elektroforéze.
Cíl cvičení
1) Vyhodnotit amplifikaci ze cvičení 5b standardní gelovou elektroforézou
2) Provést detekci Chlamydia trachomatis ve vzorcích ze cvičení 5a polymerázovou řetězovou reakci metodou real-time PCR
Seznam přístrojů
• termocykler
• PCR box
• sada pipet o objemech 2, 20, 200 a 500 u.1
• stojánky na zkumavky a PCR zkumavky
Vlastní pracovní postup
Namíchání reakce
Všechny kroky je možno provádět při laboratorní teplotě
1) Nechejte rozpustit MasterMix po dobu asi 5 minut a poté promíchejte několikerým, ale opatrným převracením zkumavky
2) Rozpipetujte MasterMix po 30 u.1 do PCR zkumavek
3) Přidejte po 10 u.1 izolované DNA
4) Do samostatné zkumavky přidejte 10 u.1 PK
5) Výsledný objem reakčních směsí je 40 u.1
6) Uzavřete PCR zkumavky, krátce zcentrifugujte veškerou tekutinu ke dnu, vložte do termocyleru a proveďte amplifikaci
25
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Detekce Chlamydia trachomatis metodou PCR (end-point)
Amplifikace
Program pro amplifikaci:
Proces
Teplota Čas
Opracování UDG 37°C 2 min.
Aktivace reakce 95°C 15 min.
PCR opakovat 45x Denaturace 95°C 5 s
Annealing 60°C 40 s
Polymerace 72°C 20 s
Vyhodnocení
Pozitivní kontrola
Kanál FAM/Sybr
ANO ANO
Negativní kontrola Vzorek
NE
ANO ANO NE NE
Kanál JOE/HEX
Výsledek
ANO NE
POZITIVNÍ POZITIVNÍ
ANO
NEGATIVNÍ
ANO NE
ANO NE
POZITIVNÍ POZITIVNÍ NEGATIVNÍ NEHODNOTITELNÝ
K protokolu doložte záznam z real-time PCR a vypracujte tabulku s výsledky pro jednotlivé
izoláty
Další informace k této problematice najdete v následující literatuře
Persing (2011): Molecular Microbiology - second edition, ASM Press, Washington, D.C.
Manuál dodavatele detekční soupravy
Kontrolní otázky a příklady
1) Popište základní princip kvalitativního a kvantitativního stanovení genotypu pomocí real-time PCR
26
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Izolace DNA z kvasinek
Izolace DNA z kvasinek, gelová elektroforéza, stanovení koncentrace a
čistoty DNA spektrofotometricky
(cvičení č. 7 a)
Úvodní slovo
Izolace DNA u bakterií a kvasinek probíhá obdobným způsobem, ale s ohledem na stavbu buňky je nutné upravit či zařadit některé kroky. Při izolaci DNA z kvasinek je nejprve nutné odstranit buněčnou stěnu, která má odlišné vlastnosti než buněčná stěna bakterií. Nejčastěji se používá enzymatické rozrušení buněčné stěny (enzym lytikáza, zymoláza). Metodicky je nejvýhodnější připravit protoplasty nebo sferoplasty. Po jejich narušení - rozbití se již při izolaci DNA postupuje klasickou fenol-chloroformovou metodou. Pro odstranění RNA se použije enzym RNáza, pro přečištění DNA izopropanol. O čistotě, množství DNA a odstranění RNA je možné se přesvědčit gelovou elektroforézou (viz. cvičení č. 2) a spektrofotometricky (viz. cvičení 3).
Cíl cvičení
Cílem cvičení je osvojit si techniku fenol-chloroformové extrakce DNA, získat čistou DNA v dostatečném množství, která bude následně použita pro PCR, a následně ověřit její koncentraci a čistotu spektrofotometricky.
Seznam přístrojů
• termostat
• třepačka
• sada pipet o objemech 20, 200 a 1000 u.1
• termocykler
• centrifuga
• váhy
• aparát pro elektroforézu
• UV-VIS spektrofotometr Nanodrop
Vlastní pracovní postup 1. Izolace DNA
Příprava suspenze kvasinek pro izolaci DNA
Do 5 ml YPD bujónu (2 % kvasničný extrakt, 1 % pepton, 2 % D-glukóza; pH 8,0) ve zkumavkách se zaočkuje 1 kolonie kultury a kultivace probíhá při teplotě 25°C, 48-72 hod za intenzivního třepání.
27
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Izolace DNA z kvasinek
Lyže buněk
1) Centrifugace kultury kvasinek (množství buněk cca 1-2 x 108 buněk / ml) 4000 rpm, 4°C, 10 min, pelet následně resuspendujte v 10 ml 0,1 M EDTA (pH 7,5) a poté znovu zcentrifugujte
2) Sediment resuspendujte v 1 ml roztoku pro sféroplasty (0,9 M sorbitol; 0,1 M EDTA; 50 mM dithiothreitol; pH 7,5)
3) Přidejte 50 u.1 lytikázy (výsledná koncentrace 500 U / ml), suspenze je inkubována při teplotě 37°C přibližně 60 min (do vzniku viskózni a projasněné suspenze). Asi po 10 min. suspenzi protřepávejte
4) Přidejte 240 u.1 0,5 M EDTA (pH 8) a 25 u.1 proteinázy K (výsledná koncentrace EDTA 0,1 M a proteinázy K 0,2 mg / ml), následuje inkubace 5 min při teplotě 37°C
5) Pro dokončení lyže buněk se k suspenzi přidá 150 u.1 10 % SDS; inkubace při teplotě 37°C/10 min
Purifikace chromozomální DNA
1) Buněčný lyzát smíchejte se 750 u.1 nasyceného a neutralizovaného fenolu, promíchávejte 10 min
2) Přidejte 750 u.1 směsi chloroform/izoamylalkohol (24:1) a míchejte 5 min
3) Centrifugace 4000 rpm, 4°C, 10 min - oddělení vodné a organické fáze se zbytky buněk
4) Horní vodnou fázi, obsahující nukleové kyseliny, odpipetujte plastovou špičkou s ustřihlým okrajem do nové zkumavky. Přidejte 1,5 ml směsi chloroform/izoamylalkohol a směs míchejte po dobu 5 min
5) Po centrifugaci (4000 rpmm, 4°C, 10 min), opět zkrácenou špičkou, odeberte horní vodnou vrstvu (hrubý extrakt nukleových kyselin) do nové zkumavky
6) Jako kontrolní vzorek odeberte 20 u.1 a smíchejte s 5 u.1 vkládacího pufru
7) Přidejte 20 u.1 RNázy A do směsi nukleových kyselin a inkubujte 15 min při teplotě 37°C
8) Odeberte 20 u.1 vzorku, smíchejte s 5 u.1 vkládacího pufru (kontrola odstranění RNA)
Přesrážení hrubého extraktu DNA
1) K hrubému extraktu DNA přidejte izopropanol (v poměru 1 : 0,7; např. 900 u.1 extraktu : 630 u.1 izopropanolu), směs inkubujte 10 min při teplotě -20°C
2) Centrifugace 12 000 rpm, 4°C, 10 min; opatrně odpipetujte supernatant
3) DNA na dně zkumavky je vysušena při pokojové teplotě, poté přidejte 50 u.1 TE pufru. Takto se nechá přes noc rozpouštět v chladničce (4°C), kde je DNA i dále uchovávána
2a. Gelová elektroforéza (kontrola DNA, odstranění RNA)
1)  Připravte 1 % agarózový gel (viz. Cvičení 2a)
28
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Izolace DNA z kvasinek
2) Na gel naneste 5 u.1 DNA markeru (Gene Ruler DNA Ladder Mix 100 - 10 OOObp, Fermetas), 10 u.1 hrubého lyzátu před a po přidání RNázy a 2 u.1 čisté DNA
3) Gel se vzorky vložte do elektroforetické vany a zalijte TAE či TBE pufrem tak, aby byl ponořen zhruba 3 mm
4) Nastavte stálé napětí 90 V, separace bude probíhat cca 45 min
5) Gel se barví v roztoku ethidiumbromidu (0,05 u.l/ml) po dobu nejméně 1 hodiny PRACUJTE V RUKAVICÍCH!!!!
6) Pozorujte gel na transluminátoru pod UV světlem o vlnové délce 302 nm a zdokumentujte
2b. Gelová elektroforéza s použitím netoxického barviva GelRed (bez ethidiumbromidu)
Gel se připraví klasickým způsobem (viz. Cvičení 2a), po rozpuštění agarózy se ještě do horkého roztoku přidá patřičné množství netoxické barvy GelRed, zamíchá se a po zchladnutí se nalije do elektroforetické vany
1) Na gel naneste 1 u.1 DNA markeru (Gene Ruler DNA Ladder Mix 100 - 10 OOObp, Fermetas), 10 u.1 hrubého lyzátu před a po přidání RNázy a 2 u.1 čisté DNA
2) Gel se vzorky vložte do elektroforetické vany a zalijte TAE či TBE pufrem tak, aby byl ponořen zhruba 3 mm
3) Nastavte stálé napětí 90 V, separace bude probíhat cca 45 min
4) Po dokončení elektroforézy už není třeba gel dobarvovat a může se ihned pozorovat na transluminátoru pod UV světlem a zdokumentovat
3. Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky (Nanodrop)
1) Zapněte spektrofotometr.
2) Jako blank použijte eluční pufr (TE pufr), napipetujte 2 u.1 a v levém horním menu vyberte BLANK (nastavení nulového pozadí).
3) Mezi jednotlivými vzorky se měřící plocha neoplachuje, pouze se „leští" buničinou.
4) Napipetujte 2 u.1 izolované DNA a v levém horním menu vyberte MEASURE, přístroj automaticky měří hodnoty absorbance při 230, 260 a 280 nm a spočítá jejich poměry.
5) Po posledním vzorku se pipetuje 5 u.1 destilované vody a povrch se řádně „vyleští".
6) Graf lze převést do .pdf souboru: vlevo dole Reports; Print; Graphs overlay; Report nahoře na záložce; vybrat řádek (vzorek); Tisk, název souboru, procházet; Nová složka; Uložit, ok;
Pro další vzorek se pokračuje od Report.
6) Vyhodnoťte dosažené výsledky.
29
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Izolace DNA z kvasinek
Další informace k této problematice najdete v následující literatuře:
Giudici P., Pulvirenti A. (2002): Molecular methods for identification of wine yeasts. Biodiversity and Biotechnology of Wine Yeast, 35-52, ISBN: 81-7736-120-1.
Nguyen Huu-Vang, Lepingle A., Gaillardin C. (2000): Molecular typing demonstrates homogeneity of Saccharomyces uvarum strains and reveals the existence of hybrids between S. uvarum and S. cerevisiae, including the S. bayanus type strain CBS 380. Systém. Appl. Microbiol. 23, 71-85.
Valente P., Gouveia F.C., de Lemos G.A., Pimentel D., van Elsas J.D., Mendonca-Hagler L.C., Hagler A.N. (1996): PCR amplification of the rDNA internal transcribed spacer region for differentiation of Saccharomyces cultures. FEMS Microbiol. Lett. 137, 253-256.
Kontrolní otázky
1) Jaký je výsledný náboj molekuly DNA? Odkud kam putuje při elektroforéze?
2) Jaké jsou odlišnosti ve stavbě a složení buněčné stěny Gram-negativních, Gram-pozitivních bakterií a kvasinek?
3) Jaký útvar vznikne po odstranění buněčné stěny kvasinek?
4) Proč musíme pracovat s etidiumbromidem v rukavicích?
5) Ve které fázi roztoku (vodné či organické) se nachází DNA při izolování pomocí fenol-chloroformové metody?
30
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Izolace DNA z kvasinek
PCRITS regionu pro odlišení komplexu Saccharomyces sensu stricto, RFLP či sekvenace ITS regionu, gelová elektroforéza
(cvičení č. 7b)
Úvodní slovo
Identifikace kvasinek, a to nejen rodu Saccharomyces, pomocí běžných mikrobiologických a biochemických testuje často nepřesná a nedostatečná, neboť testy mohou být ovlivněny kultivačními podmínkami a jednotlivé rody či druhy poskytují shodné či variabilní výsledky. Proto se, jako i u bakterií, stále více používá analýza sekvencí některých evolučně konzervativních genů či oblastí na DNA. U bakterií je to především gen pro 16S rRNA, u kvasinek potom oblast ITS (Internal Transcribed Spacer), která se nachází mezi podjednotkami genů pro rDNA, 18S, 5,8S a 26S. Po PCR a gelové elektroforéze je možné rozlišit rody, případně druhy na základě odlišné délky ITS regionu, případně jiného restrikčního profilu při použití RFLP. V některých případech je analýzy dále nutno doplnit, např. NTS region (Non-Transcribed Spacer), RFLP mtDNA, amplifikace genů charakteristických pouze pro daný rod/druh, atd.
Pro amplifikaci ITS regionu použijeme naši izolovanou DNA a komerční směs Combi PPP Master-mix (Top-Bio, ČR), která již obsahuje komponenty potřebné pro PCR (polymerázu, horečnaté ionty, nukleotidy). Produkty PCR ověříme gelovou elektroforézou - 1% gel (viz. cvičení 1 a 2), následně přečistíme a můžeme použít pro reštrikční štěpení enzymem Hoelll či pro sekvenaci.
Cíl cvičení
Cílem cvičení je PCR oblasti ITS z izolované kvasničné DNA. Po případném přečištění je možné se získanými PCR produkty dále pracovat - sekvenace, RFLP. Pro reštrikční analýzu ITS regionu rodu Saccharomyces se využívá nejčastěji enzym Hoelll. Ověření PCR produktu i reštrikční analýzy se provádí gelovou elektroforézou.
Seznam přístrojů
• Termostat, termoblok
• třepačka
• sada pipet o objemech 20, 200 a 1000 u.1
• termocykler
• centrifuga
• váhy
• aparát pro elektroforézu Vlastní pracovní postup
31
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Izolace DNA z kvasinek
1. PCR (ITS region)
1) Použijte DNA izolovanou metodou fenol-chloroformové extrakce. Pro ověření, že kmeny patří do rodu Saccharomyces, použijte primery ITS1 a ITS4 (Valente et al. 1996 - pokud je velikost amplifikovaného produktu zhruba 850 bp, patří kmen do rodu Saccharomyces).
Primery
ITS1 - TCC GTA GGT GAA CCT GCG G ITS4 - TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
PCR směs pro celkový objem 50 u.1: PCR směs pro celkový objem 25 u.1:
Master Mix Combi PPP...........................25 u.1 Master Mix Combi PPP..............12 u.1
PCR voda	22 ul		PCR voda		11 U.1
primer 1	lul		primer 1		....................Q,5 ul
primer II	...........1. ul		primer II		....................Q,5 ul
DNA matrice	.1 ul		DNA matrice		.....................1 ul
PCR program:					
Krok	Teplota			Čas	
1	95°C			3 min	
2	95°C			45 sec	
3	55°C			30 sec	
4	72°C			45 sec	
5	Goto 2			33x	
6	72°C			7 min	
7	4°C			oo	
2a . Gelová elektroforéza (ověření PCR produktu)
1) Připravte 1 % agarózový gel (viz. Cvičení 2a)
2) Gel vložte do elektroforetické vany a zalijte TAE či TBE pufrem (ponoření zhruba 3 mm)
3) Na gel naneste 5 u.1 DNA markeru (Gene Ruler DNA Ladder Mix 100 - 10 OOObp, Fermetas) a následně 5 u.1 každého PCR produktu
4) Nastavte stálé napětí 90 V, separace bude probíhat cca 45 min
32
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Izolace DNA z kvasinek
5) Gel se barví v roztoku ethidiumbromidu (0,05 uJ/ml) po dobu nejméně 1 hodiny PRACUJTE V RUKAVICÍCH!!!!
6) Pozorujte gel na transluminátoru pod UV světlem o vlnové délce 302 nm a zdokumentujte
2b. Gelová elektroforéza s použitím netoxické barvy GelRed (bez ethidiumbromidu)
Gel se připraví klasickým způsobem (viz. Cvičení 2a), po rozpuštění agarózy se ještě do horkého roztoku přidá patřičné množství netoxické barvy GelRed, zamíchá se a po zchladnutí se nalije do elektroforetické vany
1) Gel vložte do elektroforetické vany a zalijte TAE či TBE pufrem (ponoření zhruba 3 mm)
2) Na gel naneste 1 u.1 DNA markeru (Gene Ruler DNA Ladder Mix 100 - 10 OOObp, Fermetas) a následně 5 u.1 každého PCR produktu
3) Nastavte stálé napětí 90 V, separace bude probíhat cca 45 min
4) Po dokončení elektroforézy už není třeba gel dobarvovat a může se ihned pozorovat na transluminátoru pod UV světlem a zdokumentovat
3a. Štěpení PCR produktu (RFLP)
1) Ke štěpení enzymem Hoelll použijte PCR produkt (ITS region) - bud' produkt přečistěte (viz. Cvičení 2b) nebo použijte hrubý PCR produkt, štěpení probíhá min. 2 hod při 37°C
2) Výsledek ověřte gelovou elektroforézou (2% gel), kdy nanesete 8 u.1 vzorku + 2 u.1 vkládacího pufru (při použití MM Combi PPP směs již obsahuje vkládací barvivo a není třeba ho dodávat)
Směs pro štěpení ITS regionu (celkový objem 20 u.1):
Voda..........................................8,5 u.1
Pufr pro enzym 2t0 u.1
PCR produkt/DNA .............8,5 u.1
Enzym Hoelll..............................1^0 u.1
3b. Sekvenace PCR produktu
1) Pro sekvenaci se využije ITS region - produkt se přečistí (viz. cvičení 2b) a zašle na Středisko sekvenování DNA, MBÚ AV ČR (www.biomed.cas.cz/mbu/labll9/index.htm)
2) Výsledkem sekvenační reakce je soubor ve formátu .abi, se kterým můžeme dále pracovat (viz. Cvičení 3b)
33
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Izolace DNA z kvasinek
\ HKVfNOVANl
rmMlklMtHM>»*iHWv» pnintyM !>|MtÉJ"■■«<««Éd>f«>.it«v*ll
DODÁTE NASI PRACÍ
I
Mm tmi* • imiWiM l«u
■ i. li, i i
J
ii     ■   t tni .-,  l. li i
——I
Další informace k této problematice najdete v následující literatuře:
Giudici P., Pulvirenti A. (2002): Molecular methods for identification of wine yeasts. Biodiversity and Biotechnology of Wine Yeast, 35-52, ISBN: 81-7736-120-1.
Nguyen Huu-Vang, Lepingle A., Gaillardin C. (2000): Molecular typing demonstrates homogeneity of Saccharomyces uvarum strains and reveals the existence of hybrids between S. uvarum and S. cerevisiae, including the S. bayanus type strain CBS 380. Systém. Appl. Microbiol. 23, 71-85.
Valente P., Gouveia F.C., de Lemos G.A., Pimentel D., van Elsas J.D., Mendonca-Hagler L.C., Hagler A.N. (1996): PCR amplification of the rDNA internal transcribed spacer region for differentiation of Saccharomyces cultures. FEMS Microbiol. Lett. 137, 253-256.
Kontrolní otázky
1) Které sekvence se nejčastěji využívají pro identifikaci bakterií a kvasinek?
2) Jaké druhy rodu Saccharomyces znáte, jsou průmyslově využívané?
3) Jaký je princip druhové identifikace při RFLP?
34
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Inform a ční panely
Informační panel - Základní data o nukleových kyselinách a proteinech
Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty
(Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4
Počet částic v jednom molu = 6,023 x 10 Průměrná molekulová hmotnost páru bazí v DNA = 650 Průměrná molekulová hmotnost bazí v RNA = 360 Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny = 110
Pro dsDNA když A26o= 1,0 v 1 cm kyvetě, pak koncentrace dsDNA = 50 u.g/ml = 0,15 mM Pro ssDNA když A26o= 1,0 v 1 cm kyvetě, pak koncentrace ssDNA = 33 u.g/ml = 0,10 mM Pro ssRNA když A26o= 1,0 v 1 cm kyvetě, pak koncentrace ssRNA = 40 u.g/ml = 0,11 mM Molekulová hmotnost dsDNA = (počet bp) x 650
Počet molů konců dsDNA = 2 x (hmotnost DNA v gramech) / (molekulová hmotnost)
Počet molů konců vytvořených restrikčním štěpení
a) kružnicová DNA     = 2 x (moly DNA) x (počet štěpných míst)
b) lineární DNA = 2 x (moly DNA) x (počet štěpných míst) + 2 x (moly DNA)
lu.g DNA o délce 1 000 bp = 1,5 pmol = 9,1 x 1011 molekul lu.g DNA plasmidu pUC18/19 (délka 2 686 bp) = 0,57 pmol = 3,4 x 1011 molekul lu.g DNA plasmidu pBR322 (délka 4 361 bp) = 0,35 pmol = 2,1 x 1011 molekul lu.g DNA fága M13mpl8/19 (délka 7 249 bp) = 0,21 pmol = 1,3 x 1011 molekul lu.g DNA fága X (délka 48 502 bp) = 0,03 pmol = 1,8 x 1010 molekul
1 pmol DNA o délce 1 000 bp = 0,66 u.g 1 pmol DNA plasmidu pUC18/19 (délka 2 686 bp) = 1,77 u.g 1 pmol DNA plasmidu pBR322 (délka 4 361 bp) = 2,88 u.g 1 pmol DNA fága M13mpl8/19 (délka 7 249 bp) = 4,78 u.g 1 pmol DNA fága X (délka 48 502 bp) = 32,01 u.g
DNA o délce 1,0 kb má kódovací kapacitu 333 aminokyselin = protein o M = 37 000 Protein o M = 10 000 může být kódován DNA o velikosti 270 bp Protein o M = 50 000 může být kódován DNA o velikosti 1,55 kbp
35
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Inform a ční panely
Informační panel - Vzorce užitečné pro design PCR
Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty
(Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4
Přepočty koncentrací
Pro oligonukleotid platí, když A26o= 1,0 v 1 cm kyvetě, pak jeho koncentrace = 20-30 u.g/ml Molekulová hmotnost (M)
M = (NA x 312,2) + (NG x 328,2) +(NC x 288,2) +(NT x 303,2) + P kde
Nx = počet specifických nukleotidů (A, T, C nebo G) v oligonukleotidu P = + 17 pro fosforylované oligonukleotidy P = - 61 pro defosforylované oligonukleotidy
Přepočet uq na pmol
pmol oligonukleotidu = u.g (oligonukleotidu) x (106 pg/ 1 u.g) x (1 pmol/330 pg) x (1/N) =
= [ug (oligonukleotidu) x 3,030] /N
kde N = počet nukleotidů v oligonukleotidu
např. 1 u.g oligonukleotidu o délce 20 bazí je přibližně 151,5 pmol
Přepočet pmol na ua
u.g oligonukleotidu = pmol (oligonukleotidu) x (330 pg/ 1 pmol) x (1 u.g/106 pg) x (N) =
= pmol (oligonukleotidu) x N x 3,3 .104
kde N = počet nukleotidů v oligonukleotidu
např. 1 pmol oligonukleotidu o délce 20 bazí je přibližně 0,0066 u.g
Přepočet uM na pmol
1 u.1 X u.M roztoku primem obsahuje X pmol primem
např. 1 u.1 2,5 u.M roztoku primeru obsahuje 2,5 pmol primeru
Přepočet pmol na uM
1 u.1 roztoku primeru o koncentraci X pmol/u.1 má koncentraci primem X uM
např. 1 u.1 roztoku primeru o koncentraci 20 pmol/u.1 má koncentraci primeru 20 u.M
36
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Inform a ční panely
Informační panel - informace užitečné pro práci s PCR
Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty
(Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4
Zkratky používané pro označení bází v nukleotidech používá se např. při objednávání oligonukleotidů pro PCR
Kód	Značí	Kód	Značí
A	adenin	K	keto (T a G)
T	thymin	M	amino (C a A)
G	guanin	D	všechny kromě C
C	cytosin	V	všechny kromě T
Y	pyrimidiny (C a T)	H	všechny kromě G
R	puriny (A a G)	B	všechny kromě A
W	„weak" (A a T)	N	všechny
S	„strong" (G a C)	X	neznámý
Výpočty teplot annealingu
pro oligonukleotidy dlouhé 14 až 25 nukleotidů
Tm = [2 °C x (počet bází A a T)] + [4 °C x (počet bází G a C)] +
pro oligonukleotidy delší než 25 nukleotidů
Tm = 81,5 °C + 16,6 [Na+] + 0,41 (% GC) - 0,61 (% for) - 500/N
kde
[Na+]    = koncentrace Na+ iontů
%GC   = podíl nukleotidů G a C v sekvenci
% for   = podíl formamidu v hybridizačním roztoku
Vybrané odkazy na důležité www stránky
1) www.ncbi.nim.nih.gov = databáze sekvencí (Genová banka) a literárních odkazů
2) www.dgb.org = umístění lidských genů, fragmentů DNA, populace,
polymorfismy, mapy, mutace
3) www.rebase.neb.com = reštrikční enzymy a metylázy
4) www.scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop = klasifikace struktur proteinových domén
5) www.expasy.ch/sprot = databáze proteinových sekvencí SWISS-PROT
37
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Inform a ční panely
Informační panel - Tabulka standardního genetického kódu
Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty
(Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4
kodony					
první nukleotid	druhý nukleotid				třetí nukleotid
	U	C	A	G	
U	Phe (F)	Ser (S)	Tyr (Y)	Cys (C)	U
	Phe (F)	Ser (S)	Tyr (Y)	Cys (C)	C
	Leu (L)	Ser (S)	terminace	terminace, SeC Pyr (O)	A
	Leu (L)	Ser (S)	terminace	Trp (W)	G
C	Leu (L)	Pro (P)	His (H)	Arg (R)	U
	Leu (L)	Pro (P)	His (H)	Arg (R)	C
	Leu (L)	Pro (P)	Gin (Q)	Arg (R)	A
	Leu (L)	Pro (P)	Gin (Q)	Arg (R)	G
A	lle(l)	Thr (T)	Asn (N)	Ser (S)	U
	lle(l)	Thr (T)	Asn (N)	Ser (S)	C
	lle(l)	Thr (T)	Lys (K)	Arg (R)	A
	Met nebo iniciace	Thr (T)	Lys (K)	Arg (R)	G
G	Val (V)	Ala (A)	Asp (D)	Gly(G)	U
	Val (V)	Ala (A)	Asp (D)	Gly(G)	C
	Val (V)	Ala (A)	Glu (E)	Gly(G)	A
	Val (V)	Ala (A)	Glu (E)	Gly(G)	G
SeC     = selenocystein Pyr     = pyrolysin
Tučnejšou vyznačeny kodonové rodiny
38
BÍ6721 Speciální metody analýzy mikroorganizmů I
Inform a ční panely
Informační panel- Parametry prokaryotické buňky
Převzato z: Bartoš et al. (2009): Biotechnologie a farmakogenetika pro farmaceuty
(Návody k praktickým cvičením), VFU Brno, ISBN: 978-80-7305-089-4
Složení bakteriální buňky
Hodnoty platí pro Escherichia coli, případně Salmonella typhimurium
Parametr	Na buňku	Na litr kultury (109 buněk/ml)
Vlhká hmotnost	950 fg	950 mg
Suchá hmotnost	280 fg	280 mg
Obsah proteinů	155 fg	155 mg
Obsah genomové DNA	17 fg	17 mg
Obsah RNA	100 fg	100 mg
Objem	1,15 u.m3 = 1 pikolitr	
Vnitrobuněčná koncentrace proteinů	135 ug/ml	
Antibiotika používaná v buněčných kulturách
Antibiotikum	Koncentrace	Gram+ bakterie	Gram" bakterie	Mycoplasmata	Kvasinky	Stabilita při 37°C
ampicilin	50-100 mg/ml	+	+	-	-	3 dny
amfotericin B	0,25-25 u.g/ml	-	-	-	+	3 dny
carbenicilin	100 U/ml	+	+	-	-	3 dny
ciprofloxacin	10 ug/ml			+		5 dnů
erythromycin	100 u.g/ml	+	+	+	-	3 dny
gentamycin	5-50 u.g/ml	+	+	+	+	3 dny
kanamycin	100 u.g/ml	+	+	+/-	-	5 dnů
lincomycin	50 ug/ml	+	-	-	-	4 dny
neomycin	50 ug/ml	+	+	-	-	5 dnů
nystatin	100 U/ml	-	-	-	+	3 dny
penicilin G	50-100 U/ml	+	-	-	-	3 dny
polymixin B	100 U/ml	-	+	-	-	5 dnů
streptomycín	50-100 u.g/ml	+	+	-	-	5 dnů
tetracyklín	5-10 u.g/ml	+	+	+	-	3 dny
39