Nádory krvetvorby
Obnovné buněčné populace
Leukemie a lymfomy
Diagnostika
Kontrola hemopoézy a léčba
Využití cytokinů
Sebeobnovné buněčné populace
Obnovné buněčné populace
Hierarchická struktura vývoje tkání:
• kožní epitel
• střevní epitel
• krvetvorné systémy
• zárodečné populace
Kmenové totipotentní buňky (v kostní dřeni – potenciál vytvářet různé buněčné typy)
Kmenové multipotentní buňky (schopné sebeobnovy, zásoba ve tkáních)
Progenitorové buňky (transit-amplifying, více diferencované, částečně schopné dělení)
Zralé terminálně diferencované buňky (nedělící se klidové buňky, v G0 fázi, umírají
apoptózou)
Je nutné, aby byla dodržována přísná rovnováha počtu a typů buněk v jednotlivých
kompartmentech.
Rovnováha mezi proliferací, diferenciací a apoptózou (mezibuněčné interakce,
stimulační a inhibiční signály, diferenciační faktory, viabilitní faktory atd.)
3
Linie kmenových buněk v dospělé tkáni a
normální obnova tkání
4Sell S., Crit Rev Oncol Hematol 51, 2004:1-28
Symetrické a asymetrické dělení
Symetrické dělení – identické dceřinné buňky, embryonální
kmenové buňky, logaritmický nárůst
Asymetrické dělení – 1 dceřinná buňka zůstává kmenová,
druhá je základem diferencující populace, sebeobnova tkání
5
Sell S., Crit Rev Oncol Hematol 51, 2004:1-28
Definice kmenové buňky
Asymetrické dělení:
2 různé dceřinné buňky
zajišťující sebeobnovu a
diferenciaci
6
Figure 12.5a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Replikace DNA kmenové buňky
7
Kmenová buňka
Terminálně diferencované
buňky
Nasměrované (komitované)
přechodně se dělící buňky
8
Figure 12.1 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Sebeobnovná buněčná populace
9
10
Sebeobnovná krvetvorná tkáň
10
Předpokládaná diferenciační dráha kmenové
buňky kostní dřeně
Multi/pluripotentní nejprimitivnější hematopoetická buňka je klidová kmenová buňka
reagující na stres. Z ní vzniká většina proliferujících buněk v kostní dřeni (progenitory)
Zralé diferencované buňky – erytrocyty (rbc) – bez jádra,
polymorfonukleární b. – inaktivované jádro Sell S., Crit Rev Oncol Hematol 51, 2004:1-28
11
V jednotlivých fázích
krvetvorby a u různých typů
krevních buněk se uplatňují
specifické růstové a viabilní
faktory (kolonie stimulující
faktory – CSF, erytropoetin
a interleukiny -IL)
12
Tvorba nádorů:
• Kmenová buňka produkuje jen nové kmenové buňky
• Dceřinná buňka není schopna normální diferenciace
13
Normální a narušená kontrola produkce
z kmenové buňky
Změny v počtu buněk je třeba interpretovat jako změny buněčné
kinetiky - sledování změn v čase.
Tvorba terminálně diferencovaných buněk z časných buněčných
prekurzorů – 4-8 dnů (3-6 mitotických dělení)
Setrvání v periferní krvi – 10 h (neutrofilní leukocyty), 10 dnů
(trombocyty), více než 100 dnů (erytrocyty).
Schopnost produkce kmenových buněk – každý den vzniká asi 3x 1011
funkčních buněk – může se zvýšit až 10x.
Poruchy krvetvorby
Anemie - snížená produkce erytrocytů
Polycytemie – zvýšená produkce erytrocytů
Kvantitativní poruchy se mohou týkat různých úrovní diferenciace
erytrocytů
Trombocytopenie a trombocytemie – poruchy produkce trombocytů
jsou následkem poruchy tvorby nebo ploidie megakaryocytů
14
Neutropenie – poruchy granulocytárního systému. Periferní
neutropenie mohou být způsobeny zrychleným odbouráváním buněk,
poruchou v jejich produkci nebo změnou jejich distribuce.
Neutrofilní leukocytózy – podmíněny nadprodukcí nebo přesunem
mezi kompartmenty (CML – příklad klonálně podmíněné leukocytózy).
Lymfopenie a lymfocytózy –poruchy lymfocytů (CLL).
Pancytopenie – kvantitativní porucha několika bun. systémů
Aplastická anemie – snížení hemopoetických buněk v kostní dřeni
Vytvoření kultivačních systémů pro klonální vývoj hemopoetických
buněk umožnilo odhalit proteiny, které regulují buněčnou viabilitu, růst
a diferenciaci různých hemopoetických línií a také odhalovat molekulární
základy normálního a abnormálního vývoje krvetvorných tkání.
Tyto regulátory zahrnují cytokiny zvané faktory stimulující růst kolonií
(CSF) a interleukiny. Různé cytokiny indukují viabilitu, množení a
diferenciaci a hemopoéza je kontrolována sítí interakcí cytokinů.
15
Tato multigenová síť zahrnuje pozitivní regulátory jako jsou CSF a IL a
negativní regulátory jako TGF beta a TNF-alfa.
Síť cytokinů, která vznikla během evoluce umožňuje značnou flexibilitu
závisející na tom, která část sítě je aktivována a na okamžitém zesílení
odpovědi na příslušný stimul.
CSF a IL indukují buněčnou viabilitu inhibicí programované buněčné
smrti - apoptózy. Ta je též regulována geny jako p53, c-myc a bcl-2 a
suprese nebo indukce tohoto programu může vyústit v podporu nebo
supresi nádoru.
Cytokiny, které regulují normální hemopoézu mohou kontrolovat
abnormální růst jistých typů leukemických buněk a potlačovat malignitu
indukcí diferenciace.
Genetické abnormality, z nichž vzniká malignita jsou tak obcházeny a
jejich účinek anulován indukcí diferenciace a apoptózy.
Hemopoetické cytokiny objevené in vitro jsou aktivní in vivo a jsou
klinicky využívány.
16
Leukemie a lymfomy
Leukemie a lymfomy
P. Klener: Klinická onkologie 18
Vznikají nekontrolovanou klonální proliferací a expanzí
hemopoetických buněk, které ztratily schopnost normálně
diferencovat do zralých krevních buněk.
Mechanismy iniciace a progrese leukémií souvisejí
se změnami v normálním homeostatickém
mechanismu -reguluje produkci krevních buněk.
Vzniká na různých úrovních vývoje
hemopoetických buněk.
Základní typy: lymfoidní a myeloidní, mnohdy
těžko definovatelné.
Heterogenní onemocnění s odlišnými
epidemiologickými, histologickými,
cytologickými, imunologickými a genetickými
charakteristikami.
Liší se projevy, stupněm malignity a odpovědí
na léčbu. Vyskytují v dětském i dospělém věku
Je nutná klasifikace – různé systémy, důležité
pro prognózu a léčbu
CD systém charakteristických povrchových
antigenů (markerů).
Preleukemické stavy
vyjadřují jen část plného leuk. fenotypu" buď expanzi růstu
(myeloproliferační syndromy) nebo diferenciační blok (myelodysplasie).
• myeloproliferační syndrom - expanze růstu chronické leukemie (CLL,
CML)
• myelodysplasie - porucha diferenciace
myelodysplastický syndrom
malé počty cirkulujících zralých buněk, asynchronie zrání jádra a
cytoplasmy. Chromosomální abnormality: delece dlouhých ramen 5 a 7
chromosomu
Progrese do
• akutní leukemie - porucha proliferace i diferenciace cirkulující
nediferencované lymfoidní (ALL) nebo myeloidní blastové buňky (AML)
19
Chronická lymfatická leukemie (CLL)
Lymfoproliferativní onemocnění – klonální proliferace lymfocytů na
určité úrovni maturačního procesu s postupnou akumulací nefunkčních
lymfocytů v lymfatické tkáni (slezina, uzliny, játra, kostní dřeň) i
periferní krvi
• B-CLL - nejčastější forma, zástava mezi pre-B a zralými B-lymfocyty
• T-CLL – méně častá, v etiologii infekce retrovirem HTVL-1, horší
prognóza a odpověď na léčbu
Prolymfocytární leukemie (PLL)
Chronická myeloidní leukemie (CML)
je klonální myeloproliferativní onemocnění pluripotentní progenitorové
buňky.
Zahrnuje myeloidní, erytroidní, megakaryocyt, B- někdy T-lymfoidní
elementy, ale ne fibroblasty kostní dřeně (KD).
20
Nemoc je silně heterogenní, má 2 až 3 fázový průběh, nejčastěji
u osob nad 50 let.
Specifická cytogenetická abnormalita - Philadelphia (Ph) chromozom.
Molekulární marker bcr-abl zfúzovaný gen, translokace t(9;22)
V minulosti byla prognóza pacientů s CML velmi špatná (stř. doba
přežití 3 roky).
Nyní se prognóza zlepšila díky včasné diagnóze, zlepšující se terapii a
podpůrné léčbě.
Léčba hydroxyureou a busulfanem podporovaná IFN a autologní
transpl. KD. Nyní je stř. doba přežití asi 60-65 měsíců.
S IFNalfa 20-25% pacientů přežívá. Vedlejší účinky - horečka,
nechutenství, svalové bolesti, dlouhodobější - ztráta váhy, deprese,
nespavost atd.
21
Charakteriky různých typů leukemií
ilustrují vztah ke stadiu zástavy diferenciace.
Typické genetické změny ovlivňující jak proliferaci (aktivované kinázy)
tak apoptózu (Bcl-2)
22
Z. Adam, J. Vorlíček, J. Koptíková: Obecná onkologie a podpůrná léčba 23
P. Klener:Klinická onkologie
Chronická myeloidní leukemie
24
P. Klener:Klinická onkologie
Chronická lymfatická leukemie (CLL)
25
Akutní leukemie
Akutní lymfoblastické leukemie (ALL) – akumulace nezralých lymfoidních
buněk v KD
převážně u dětí – asi 80% všech leukemií dětského věku a asi 25% všech
dětských nádorů. Prognóza je relativně příznivá.
U dospělých staršího věku asi 20% všech akutních leukemií – méně
příznivá prognóza.
Dva základní typy – B-ALL nebo T-ALL
Akutní myeloidní leukemie (AML) – nejčastější leukemické onemocnění
dospělých – až 85% AL u osob starších 20 let. Prognóza se v posledních
letech zlepšila.
Non-hodgkinské lymfomy (maligní lymfomy, NHL)
Vznikají nádorovou transformací buněk lymfoidních tkání.
Klasifikace obtížná, někdy není rozdíl mezi leukemií a lymfomem jasný.
U dětí asi 12% u dospělých 3-4% všech zhoubných nádorů.
26
ALL – řada subtypů lišících se v odpovědi
k terapii a riziku relapsu v závislosti
na diagnostickém karyotypu.
Polysomie
25-30% - více než 50 chromozomů
(hyperdiploidie) bez dalších struktur.
karyotypových abnormalit
27Teixeira M.R. and Heim S., Seminars in Cancer Biology 2005:3)
AML – genetické změny vedoucí ke konstitutivní aktivaci receptoru
pro IL-3 – aktivace tyrosin kináz a proliferace.
Konstitutivní aktivace IL-3 receptoru podporuje růst všech typů
myeloidní řady
28
Sell S., Crit Rev Oncol Hematol 51, 2004:1-28
B-lymfomy, Burkittův lymfom
Translokace a aktivace imunoglobulinového (Ig) promotoru spojená
s aktivací onkogenů
c-Myc (podpora proliferace) a Bcl-2 (blok apoptózy)
Rychlý nárůst nezralých B buněk, které neumírají.
Genetická změna v kmenové bunňce, ale růst nádoru je určen stadiem
maturace, kde dojde k aktivaci Ig promotoru.
29
Sell S., Crit Rev Oncol Hematol 51, 2004:1-28
Z. Adam, J. Vorlíček, J. Koptíková: Obecná onkologie a podpůrná léčba 30
P. Klener:Klinická onkologie 31
Diagnostika, léčba, terapeutické
využití cytokinů
33
Diagnostika
Nejdůležitější vyšetření, tzv. imunofenotypizace
Imunofenotyp - soubor povrchových znaků – CD antigenů charakteristický
pro určitý typ buněk periferní krve a kostní dřeně.
Stanovení imunohistochemické a imunocytochemické – řezy tkání, nátěry –
antigeny se znázorňují protilátkou vizualizovanou zpravidla enzymatickou
reakcí. Umožňuje současné stanovení morfologie buněk
a vyšetření tkání.
Imunofluorescence - v buněčných suspenzích – krev, kostní dřeň, výpotky,
mozkomíšní mok, suspenze ze solidních tkání.
Umožňuje detekovat zkoumané antigeny pomocí specifických fluorescenčně
značených protilátek (fluorochromy, imunofluerescence, přímé nebo
nepřímé značení). Rychlá metoda, široké spektrum protilátek.
Tzv. kokteily protilátek – jedním fluorochromem značeno více protilátek,
Kombinace více protilátek proti různým epitopům jednoho antigenu
Stanovení - fluorescenční mikroskopie a průtoková
cytometrie
Mikroskopické stanovení – morfologie
Molekulárně biologické metody – FISH (fluorescenční in situ hybridizace)
Rostoucí frakce, morfologie a klinický průběh tří typů leukémií
(akutní myeloidní leukémie, chronická myeloidní leukémie, chronická lymfocytární
leukémie)
34
Sell S., Crit Rev Oncol Hematol 51, 2004:1-28
P. Klener: Klinická onkologie 35
Z. Adam, J. Vorlíček, J. Koptíková: Obecná onkologie a podpůrná léčba
In situ fluorescenční hybridizace (FISH)
36
Průtoková cytometrie
(flow cytometry)
37
FACSDiVa (Vantage)
High performance, high speed cell sorter
Flow sorting instrument for the research
laboratory
The FACSCalibur is the first a 4-colour, dual laser,
benchtop system capable of both cell analysis and
sorting fully integrated multiparameter system,
wide range of research and clinical applications
BD LSR - the first 6-Color Benchtop Research
Flow Cytometer
It has combined benchtop easy-of-use with
the flexibility and performance of high-end flow
cytometers
Building on the easy-of-use standard set
by the FACSCalibur, the BD LSR offers
software instrument Control, push button
fluids, and fine-adjust sample
flow-rate control
Becton Dickinson Instruments (BD) – since 1974 BD
has been the leading provider -recent models of innovative technology in flow cytometry
38
FACSCalibur
39
Basics of flow cytometry
represents:
Electronics
Optics
Fluids
40
Flow Cell - Mechanism
Injector
Tip
Fluorescence signals
Focused laser beam
Sheath
fluid
Purdue University Cytometry Laboratories,
www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate.htm
Flow Chamber
Cells in single file
flow through
an illuminated volume
where they scatter light
and emit fluorescence
converted
to digital values
In most instruments this
(laminar flow) is accomplished
by injecting sample into a
sheath fluid as it pass through
a small 50-300 micrometers
orrifice
that are stored
on a computer
are collected, filtered
The speed of flowing cells
Optimum for immunophenotyping: 1000 cells/s
Optimum for DNA analysis: 200-300 cells/s
…need to have cells in suspension !!!
41
Cell
Interaction of light with the cell
Fluorescence is emitted, and light scattered, in all directions.
The amount of light scattered at
large angles (15 - 150°)
increases with cells’ internal
granularity and surface
roughness
Extinction, i. E., the light
loss from the incident
beam, represents the sum
of light absorbed and light
scattered by the cell
The amount of light scattered
at small angles (0.5 - 5°) gives
a rough measure of cell size
Incident light beam
The amount of fluorescence
emitted must be less than the
amount of light absorbed, and
is generally proportional to the
amount(s) of intrinsic and/or
extrinsic fluorescent material(s)
in or on a cell but is affected
by other factors,
such as refractive index
42
Purdue University Cytometry Laboratories,
www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate.htm
How Forward Angle Light Scatter is
collected
When a laser light source is used the amount of light scattered in the Forward
direction is detected in the forward scatter channel (along the same axis that
the laser light is traveling)
43
Laser
FALS Sensor
The intensity of forward scatter
is proportional to the
• size
• shape
• optical homogenity
of cells (or other particles)
Purdue University Cytometry Laboratories,
www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate.htm
The intensity of side scatter
is proportional to the
• size
• shape
• optical homogenity
of cells (or other particles)
When a laser light source is used
the amount of light scattered to the
side is detected in the side or 90°
scatter channel (perpendicular to the
axis that the laser light is traveling)
44
Laser
FALS Sensor
How 90 Degree (side) Light Scatter is
collected
90LS Sensor
Purdue University Cytometry Laboratories,
www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate.htm
0
8
15
20
30
40
50
100
200
1000
Lymphocytes
Monocytes
Neutrophils
Side Scatter Projection
Light Scatter Gating
Side Scatter
45
1000800600400200
ForwardScatter
800600400200 1000
0
ForwardScatterProjection
Scale
Purdue University Cytometry Laboratories,
www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate.htm
Control ATRA DMSO
NaBt vit. D3
0.02% 0.17%
0.14%
0.02% 0.37%
11.9%
0.14% 0.8%0.8%
12.2%
49.3%
1.7%0.04%
16.6%
57.9%4.8%
FITC
FITC
FITC
CELLULAR ANTIGENS
© Karel Souček 2000
Two-parametric analysis
of cell surface antigens
(HL-60 human leukemic cells
treated with agents of differentiation)
CD11b (granulocyte/ monocyte marker)
CD14 (monocytic marker)
CD 14
CD 11b
46
Kontrola hemopoézy a léčba
• pozitivní regulace - využití hemopoetických tzv. kolonie
stimulujících růstových faktorů (CSF): erytropoetin, G-CSF granulocytární
růst. faktor, M-CSF - monocytární růst. faktor, GMCSF
- granulocytární-makrofágový růst. faktor, interleukin3 (IL-3)
• negativní regulace hemopoézy - prevence poškození kmenových
buněk při chemoterapii - TGF 
• autokrinní růst - blokáda přenosu růstových signálů antagonisty
růstových faktorů, receptorů a inhibitory dalších stupňů přenosu
signálů (inhibitory PKC, lipidového metabolismu, “antisense”
látky, atd.)
• imunomodulační látky - ovlivnění imunitního systému hostitele
(IL-2, interferon alfa a gama
47
Pluripotentní hemopoetické kmenové buňky
Všechny elementy krve a lymfy jsou odvozeny během fetálního a
dospělého života od pluripotentní hemopoetické kmenové buňky.
Nachází se v malém počtu v kostní dřeni a většina z nich se aktivně
nedělí.
Pokrok v izolaci a charakterizaci pluripotentní kmenové buňky pomáhá
k poznání s ní souvisejících malignit.
Lidské kmenové buňky nesou povrchový znak CD34 a jsou schopny
tvořit řadu kolonií v semisolidním prostředí v odpověď na různé
specifické růstové faktory.
Jisté lidské leukemické buňky jako chronická myeloidní leukémie (CML)
nebo akutní myeloidní leukémie (AML), které představují velmi nezralé
kmenové buňky nebo prekursory jednotlivých línií, se jen velmi obtížně
kultivují in vitro, přesto, že v pacientech rostou velmi rychle.
Chybí asi specifické faktory dodávané mikroprostředím kostní dřeně.
48
V současné době byl objeven nový tzv. steel faktor produkovaný
stromálními buňkami a jeho receptor c-kit přítomný na řadě
hemopoetických buněk.
U myší byly definovány dva genetické lokusy regulující vývoj kmenové
buňky - steel (SL) a white-spotting (W).
W lokus kóduje c-kit onkogen, což je člen třídy onkogenů pro tyrosin
kinázové receptory.
Je to receptor pro produkt genu Sl majicí růstově promoční aktivitu pro
mnoho hemopoetických línií a vykazující synergii s dalšími růstovými a
diferenc. faktory jako GM-CSF, Epo a IL-7.
Sl faktor je považován za kritický pozitivní efektor růstu a vývoje
kmenových buněk.
Proto je věnována pozornost jeho roli v růstové rsgulaci u leukemií, které
představují primitivní typy kmenových buněk.
49
Úloha stromatu v kostní dřeni
Poměrně dobře je objasněna úloha stromatu kostní dřeně v regulaci
normální krvetvorby.
Byly vytvořeny dlouhodobé kultury pro myeloerytroidní a lymfoidní vývoj.
Řada údajů předpokládá, že vzájemné kontakty buněk a specifické účinky
extracelulární matrix pomáhají regulovat vývoj kmenové buňky.
Různé typy leukémií se mohou lišit od normálních protějšků tím, že
nevyžadují dále blízký buněčný kontakt pro růstovou expanzi a cirkulaci v
krvi.
Při vývoji buněk kostní dřeně existuje kontrola a rovnováha, která limituje
celkovou buněčnost a odpověď na stresy jako záření, krvácení a pod.
Negativní regulátory kmenových i líniově specifických buněk, např. TGF
beta produkovaný stromálními buňkami.
Pozornost věnována tomu jak kmenové buňky a různé leukemie unikají
této negativní kontrole.
50
Proliferation
RECEPTOR
pro růstový
faktor
Model prostorové organizace hemopoetických kmenových
buněk a růstových faktorů v mikroprostředí kostní dřeně
Progenitorová buňka
Proliferace
MÍSTO
BUNĚČNÉ
ADHEZE
STROMÁLNÍ BUŇKA
Růstový faktor
(indukovaný)
Membrána
Proteiny matrix
Růstový faktor
(vnější)
51
Síť interakce cytokinů, positivní a negativní
zpětná vazba
• IFN-g - interferon gamma
• LPS - lipopolysacharide
• TNF - tumor necrosis factor
GM - CSF
T buňka B buňka
makrofág
Kostní dřeň
IL - 3
IL - 1
IFN - g
IL - 2
IL - 4
IL - 1
LPS
TNF
(-)TNF
G - CSF
Protilátka
52
Línie výzkumů mechanismů působení retroviru indukujícího
erytroleukémii vedlo k odhalení, že virové proteiny mohou
stimulovat růst hostitelských buněk tím, že působí jako
pseudoligandy pro receptory růst. faktorů.
U lidských i živočišných leukémií byly identifikovány geny
homologní se známými transkripčními aktivátory.
Některé hrají roli v diferenciaci hemopoetických buněk, protože
jsou homologní nebo identické s geny dříve identifikovanými
v jiných experimentálních systémech jako geny ovlivňující vývoj
a diferenciaci.
Existuje tedy vazba mezi onkogenezí a transkripční deregulací.
53
Transkripční faktory jsou málo exprimovány u kmenových buněk CD34. Působením blíže
nedefinovaných signálů, jako je vliv interakce ve stromatu nebo signály růstových faktorů,
dochází k upregulaci specifických tr. faktorů např. GATA-1 or PU.1. To vede k jejich
autoregulaci a upregulaci specifických receptorů pro růstové faktory, což má za následek
vzestup proliferace, diferenciace a supresi apoptózy specifických linií. Downregulace
specifických faktorů (jako je GATA-1 během myeloidního vývoje) může také hrát důležitou
úlohu.
1
Aktivace
transkripčních
faktorů
2
Zvýšená exprese
specifických
CSF receptorů
3
Maturace indukovaná
transkripčními faktory
a CSF
Neutrofil
myeloidní
prekursor
GM-CSF R
erytroidní
prekursor
Monocytární
prekursor
myeloidní
prekursor
M-CSF R
EpoR EpoR
Epo
M-CSF
G-CSF
Gata-1
PU.1
PU.1
C/EBPa
CD34 Monocyt
Erytrocyt
54
Model indukce hematopoetické diferenciace specifickými
transkripčními faktory.
G-CSF R
V normální buňce je rovnováha stimulačních a inhibičních signálů
pečlivě regulována, protože to souvisí s regulací buněčného cyklu, který
je rozhodující pro buněčnou proliferaci a diferenciaci.
V nádorové buňce je v důsledku změn v signálních drahách organizace
buněčného cyklu narušena.
Buňka je vybavena také zpětnovazebnými mechanizmy, které mohou
působit proti neobvyklým změnám v procesu bun. dělení.
Patří k nim např. programovaná buněčná smrt - apoptóza, schopnost
buňky spáchat za určitých podmínek sebevraždu, tj. jestliže její základní
komponenty jsou porušeny nebo jestliže je její kontrolní systém
deregulován.
Tak působí např. poškození chromozomální DNA. V tomto procesu se
účastní také specifické geny např. p53 nebo bcl-2. Mutace těchto genů
pak způsobují poruchy apoptózy.
Neschopnost apoptózy přispívá ke vzniku nádorů a k jejich rezistenci
k terapii.
55
p16
Exprese genů kontrolujících buněčný cyklus v jednotlivých stádiích
hematopoetické diferenciace a její vztah k funkčnímu stavu.
Geny kontroly buněčného cyklu v hemopoéze
Typ buněk:
Funkce:
Komitované progenitoryKmenové buňky Morfologicky zralé buňky
Sebeobnova Zásobárna pto tvorbu krve
Diferenciace
Bílé
krvinky
p15
Zástava G0/G1
(pomalé cyklování)
cyklin D1
Terminální diferenciace
Stav
buněčného
cyklu:
Vstup do S-fáze
(aktivní cyklování)
Zástava G0/G1
(diferenciace)
Červené
krvinky
Mega
karyocyty
cdc2
p21
cyklin D3
cykliny
cdk2
cdc2
cykliny
cdk2
cdc2
p16
p21
56
Vztah mezi buněčným cyklem a diferenciací
57
Terapeutické aspekty využití cytokinů
Identifikace řady protoonkogenů jako růst. faktorů nebo jejich receptorů
a důležité účinky těchto proteinů na hemopoetické buňky vedly k hledání
dysregulace růst. faktorů a jejich receptorů u leukémií.
Biologická terapie s využitím cytokinů a růstových faktorů
představuje zcela nový přístup.
Hemopoéza může být ovlivňována buď hemopoetickými růstovými
faktory nebo negativními regulátory, které mohou zabránit poškození
kmenové buňky během chemoterapie. Na základě poznatků o
autokrinních mechanismech růstu mohou být klidové maligní buňky
uvedeny do buněčného cyklu svými růstovými faktory, čímž se stanou
citlivější k chemoterapii.
Vědomosti o biologické terapii jsou teprve na počátku, zvláště pokud se
týče všech aspektů propojené sítě cytokinů.
Cytokiny a růstové faktory přenášejí signály mezi hemopoetickým a
imunitním systémem buď samotné nebo indukcí uvolňování dalších
cytokinů.
58
Hemopoéza je regulována více než 20 dobře charakterizovanými
faktory definovanými jako kolonie stimulující faktory, interleukiny a
cytokiny.
Některé z těchto faktorů jsou běžně používány, ale potenciální klinické
využití není úplně objasněno.
První byl využit erytropoetin.
Ovlivňování pacientů cytokiny podléhá zcela jiným pravidlům, nežli
působení cytotoxickými látkami.
Cytokiny mají široké spektrum účinků in vivo jako je modulace imunitní
odpovědi, stimulace hemopoézy, přímá regulace buněčného růstu a
diferenciace, toxicita pro nádorové buňky, účinky na vaskularizaci
nádorů apod.
Navíc nevykazují jen primární účinky, ale spouštějí kaskádu
sekundárních účinků.
Působí v síti.
59
Erytropoetin
• stimulace erytropoézy po chemoterapii a transplantaci KD
• u některých lymfoproliferačních poruch jako jsou mnohočetné
myelomy a chronická lymfocytární leukémie
• u anémií spojených s chronickým onemocněním (nádory, AIDS)
• v programech autologního odběru krve
CSF (colony stimulating factors, GM-CSF, G-CSF)
• prevence a ovlivnění myelosuprese
• intenzifikace chemoterapeutických programů s nebo bez autologní
podpory progenitorů z kostní dřeně (KD) nebo periferní krve
• rekonstituce krvetvorby po chemo- a radioterapii a autogenní nebo
llogenní transplantace KD
• podpora a expanze progenitorů periferní krve
• stimulace hemopoézy u syndromů poruch v KD jako je cyklická
neutropenie, aplastická anémie
• aktivace efektorových buněčných funkcí (AIDS, poruchy funkce
leukocytů)
• zvýšení účinnosti cytotoxických léčiv vybuzením klidových
leukemických buněk
60
Kostní dřeň obsahuje asi 0.001% pravých kmenových buněk, 10x víc
“multilineage” progenitorů a 100x víc líniově specifických
progenitorů.
U dospělců cirkuluje v perif. krvi asi 5-10% počtu progenitorových
buněk v KD. Představují asi 0.1% mononukleární frakce perif. krve.
Vyvinuty metody zvýšení cirkulujících progenitorů aplikací specif.
cytokinů.
CD34+ je glykosylovaný povrchový antigen exprimovaný především
kmenovými a méně progenitorovými buňkami.
Byla vyvinuta řada metod pro selekci buněk s tímto znakem. S
vývojem metod in vitro kultivace lze tyto buňky namnožit s pomocí
synergického působení kombinace cytokinů (steel faktor + další),
pak reinfuze.
61
Využití vysokých dávek chemoterapeutik, které účinně působí
na citlivé nádory je omezeno vedlejšími účinky s hematologickou
toxicitou.
Jednou z cest jak překonat tyto obtíže je metoda transplantace
kmenových buněk z periferní krve (PBSC), která je alternativou
k transplantaci kostní dřeně (KD) a je stále více využívána.
Výhody:
• sběr PBSC leukaferézou probíhá mimo pacienta bez potřeby
anestézie a možností autograftu v případě ovlivnění KD infiltrací
nádoru, fibrózou nebo hypoplasií po chemo- a radioterapii
• dochází k rychlejšímu obnovení granulocytopoézy a
megakaryocytopoézy redukována možná kontaminace transplantantu
maligními buňkami.
62
Myelodysplastický syndrom (MDS)
je získaná klonální porucha kostní dřeně charakterizovaná
kvantitativními i kvalitativními poruchami v hemopoéze (hodně u
starších lidí - není možná drastická terapie)
Řada léčebných protokolů je zaměřena na využití diferenciačních látek
k podpoře zrání blokovaných buněk.
Existují in vitro modely, kde je možno pomocí retinové kyseliny, DMSO
nebo vit D3 příp. G-CSF, GM-CSF navodit diferenciaci. Avšak v praxi u
pacientů nepřinášejí žádoucí výsledky.
Kyselina all-trans retinová (ATRA) je nyní efektivním lékem při léčbě
akutní promyelocytární leukémie (APL).
Na MDS má však malý účinek (genetický důvod - absence translokace
15,17 důležité pravděp. pro klinický účinek ATRA).
Rekombinantní růst. faktory jako GM-CSF a IL-3 jsou u MDS pacientů
úspěšně využívány ke zvýšení počtu cirkulujících bílých krvinek a
destiček.
63
64
Diferenciace myeloidních leukemických buněk do
nemaligních zralých makrofágů nebo granulocytů
interleukinem-6
Transplantace
Autotransplantace
Před plánovanou radio- či
chemoterapií nádorů
(nehemopoetických).
Odběr zdravé kostní dřeně
nebo krve – izolace
kmenových buněk či
progenitorů (někdy
s podporou příslušných růst.
faktorů). Po léčbě zpětná
transplantace pro obnovu
krvetvorby.
Transplantace od vhodného
dárce – u hemopoetických
malignit.
65
66
Využití LAK (lymphokine-activated killer) buněk
v protinádorové terapii
TIL‘S (tumor-infiltrating lymphocytes) vyžadují víc
než měsíc přípravy před aplikací pacientům
67
Výukovou pomůcku zpracovalo
Servisní středisko pro e-learning na MU
http://is.muni.cz/stech/
68