/
© Pavel Hyršl 1998 Fyziologie živočichů 26.8.1998
Stanovení lysozymu radiální difúzí v agaróze
1. Příprava půdy pro Micrococcus luteus:
• Do erlenky/ lOOml / navážit 2.8g Nutrient agar / nebo 0.5g kvasničného extraktu + 0.5g baktoprptonu + 2.0g 1 hod. nabobtnaného agaru /, přidat l.Og glukózy. Doplnit dH20 na lOOml. Mícháním v různých kádinkách vznikají ztráty, proto vše v jedné baňce. Pokud se míchá agar z jednotlivých složek, Glc přidat až po rozvaření agaru s kvasničným extraktem a baktopeptonem, pH upravit špetkou NaOH. Zakrýt alobalem
• Fyziologický roztok 0.9% NaCl / cca 0.5ml / do malé baňky, zakrýt alobalem.
• Fyziológ, roztok a půdu v erlence sterilizujeme v papiňáku 30 min. Po 24 hod. opakujeme sterilizaci, tím docílíme likvidaci plísňových spór.
• Petřino misky / průměr lOcm / sterilizujeme min. 30 min. v sušárně vyhřáté na 200°C. Na 100 ml agaru je třeba 4-5 misek.
• Agar nalíváme trochu zchladlý / když je moc horký, odpařuje se hodně vody a orosí se víčko petričky /. Agar tuhne při 60°C. Vrstva substrátu by měla být asi 0.5cm. Po rozlití okamžitě uzavřeme petričky a necháme ztuhnout / zrát / min 2 hodiny v laboratorní teplotě / je to důležité aby se vytvořil pevný povrch /.
2. Očkování Micrococcus luteus:
• Micrococcus lysodeicticus a Micrococcus luteus je to samé, pouze některé kmeny se hodí ke stanovení lysozymu. / M.lys. je starší název /.
• Lyofilizovaný M.lys. / CCM 169 / se vysype po rozlomení ampule do sterilního fyziologického roztoku / čím méně fýzáku, tím koncentrovanější roztok /. Očkujeme vyžíhanou kličkou na agarové plotny. Lze očkovat i ze živé kultury z jiné misky / popř. z tekutého média /. Životnost M.lys. je min. 3 měsíce v lednici v alobalu dnem vzhůru. Víčko petričky je nutno odkrývat co nejméně, aby do půdy nepadaly vzdušné bakterie a spóry.
• Naočkované plotny obrátíme dnem vzhůru a necháme růst v laboratorní teplotě 3-4 dny zabalené v alobalu.
3. Briitt. -- Robinsonův pufr:
AJ 0,492 g H3BO3 B/ 0,840 g NaOH do 105 ml dH20
0,782 g kone. H3P04 0,480 g kone CH3COOH do 200 ml d H20
AJ + B/ = 305 ml pufru       pH= 7,0 /velmi důležité /
Vážit na stačí na předvážkách, kyseliny kapeme z pipety, pH změřit papírkem.
4. Agarózovy gel:
• Rada fy Biovendor: Nejprve uvařit lOx řidší agarózu / tj. 0,125 %, 0,125g agarózy do 100 ml Britt.-Robinsonova pufru /, nalít na plotny a nechat vyschnout. Vysychání buď za laboratorní teploty / den a více / nebo v sušárně / ale pozor na vyvážení /. Tato vrstvička je jako podklad pro hustší agarózu, po vysekání jamek zůstane na skle, vzorky nepřijdou až na sklo, nemohou se dostat pod gel po skle. Je to pro přesnější měření.
• Agarózu vaříme cca 1,25%. l,25g agarózy do 105 ml Britt. - Robinsonova pufru + M.lys., aby byl roztok zakalený, čím více, tím lépe, aspoň bude zřetelnější rozhraní jednotlivých zón. Chvilku v erlence povařit
/ pár minut / na vodní lázni. Erlenku možno přikrýt víčkem s dírkou / uražený trychtýrek / a dírkou prostrčit skleněnou tyčinku. Po celou dobu varu mícháme.
1
• Plotny jsou lepší větší, tj. 18 x 8,5 cm, vejde se tam více vzorků. Na toto plotnu je potřeba 16-20 ml agarózy / lepší je 20 ml, protože bude silnější vrstva gelu, nebude se tolik trhat při sekání jamek a nebude vytékat vzorek z jamky /. Plotny naléváme na vyvážené podložce. Naléváme pipetou / 20 ml /, kterou nejprve propláchneme teplou vodou / z lázně /. Po nalití opět propláchneme teplou vodou, aby agaróza nezatuhla v pipetě. Nalíváme rychle, aby gel nezatuhl a nebyl různě silný. Gel necháme pár desítek minut zatuhnout.
• Gel uchovávat vždy ve vlhké komůrce, aby nevyschl. Komůrka: nádoba s vlhkou buničinou. Plotny bez vzorků uchovávat v lednici / ne moc dlouho, nedal jsem nic proti plísním... /. Plotny se vzorkama
v komůrce za laboratorní teploty.
• Jamky vysekáváme do gelu pomocí zbroušené jehly o průměru cca 2 mm. Tuto jehlu nasadíme na vývěvu a kolmo na plotnu ji zapíchneme do gelu. Po vyndání je jamka hotova. Rozmístění jamek na plotně je nejlepší nakreslit na papír, na kterém potom sekáme jamky. Na plotně 18 x 8,5 cm je ideální rozložení 8x5 jamek. Jako označení orientace plotny je dobré seříznout některý roh.
5. Nanášení vzorků:
• Každá plotna / protože jsou různě silné / musí mít kalibraci. Kalibrace lysozymu / Sigma EC3.2.1.17 /:
1. 2 mg/ml
2. 5 mg/ml
3. 10 mg/ml
4. 15 mg/ml
5. 20 mg/ml
• Do jedné jamku 2 \i\ kalibračního roztoku nebo vzorku. Možno vše jednou špičkou, má nesmáčivý povrch, ale hemolymfa pění, takže stejně tak po 4 použitích je nutno vyměnit špičku. Každý vzorek do dvou jamek = paralelně, pak se bude počítat průměr. Vzorky na okrajích jsou někdy zkresleny, protože gel je slabší, nebo naopak silnější, ideální je střední část plotny.
• Inkubace plotny ve vlhké komůrce za laboratorní teploty 24 - 48 hodin. Pokud je moc dlouhá, zóny se rozpliznou a odečet je špatný.
• Odečítá se průměr difúzni zóny specielním měřítkem oproti černému podkladu. Čím větší zóna, tím horší odečet a větší zkreslení výsledků.
2