Srovnání tří metod stanovení lysozymu v hemolymfě hmyzu
Pavel HYRŠL & Veronika Mandátová
Ústav experimentální biologie, Oddělení živočišné fyziologie a imunologie, Přírodovědecká fakulta,
Masarykova univerzita, Kotlářská 2, Brno 61137,Česká republika
e-mail: hyrsl@mail.muni.cz
Úvod:
Lysozym je součástí humorální složky přirozené imunity hmyzu stejně tak jako jiných
bezobratlých a obratlovců. Řadíme ho mezi antibakteriální proteiny hemolymfy, které se
nacházejí běžně v hemolymfě (fenoloxidázy ve formě profenoloxidáz, lysozym, lektiny,
hemolin, aglutininy). Jejich další část je exprimována pouze v případě infekce (baktericidní
peptidy).
Lysozym náleží ke skupině heterogenních enzymů, která zahrnuje asi 20 příbuzných
enzymů, označovaných jako N-acetylmuramylhydrolázy – E.C.3.2.1.17. U hmyzu jsou
známy tři nepatrně se lišící alelické varianty cecropia enzymu (izolovaný z Hyalophora
cecropia) a lysozym Bombyx mori (Yu et al. 2002). Lysozym je velmi konzervativní
molekula o relativní molekulové hmotnosti 14,5 kDa, kterou tvoří 129 aminokyselin
(Vodrážka 1992).
Lysozym katalyzuje hydrolýzu polysacharidových řetězců ze střídajících se Nacetylglukózaminových
jednotek a zbytku N-acetylmuramové kyseliny, které dodávají tuhost
buněčným stěnám bakterií. Působí pouze na G+ bakterie, protože mají odlišnou stavbu
buněčné stěny než G- bakterie (lytický, baktericidní faktor pro G+ bakterie, bakteriostatický
faktor pro G- bakterie) (Morishima et al. 1994).
U hmyzu se vyskytuje ve všech tkáních. Jeho aktivita (koncentrace) v hemolymfě stoupá
po injikaci antigenu i po poranění až l0x (Wiesner & Götz 1993, Kanost et al. 1990).
Cílem práce bylo porovnat tři metody stanovení lysozymu v hmyzí hemolymfě.
ll
1. Radiální difúze v agaróze:
Množství lysozymu lze stanovit radiální difúzí v agaróze podle Hyršl & Marek (1999).
Agaróza (Lachema) byla povařena v Britt.-Robinsonově pufru (pH 7,0) společně s M.
luteus a nalita na skleněné plotny 18 x 8,5 cm. Do vysekaných jamek bylo nanášeno 5 µl
neředěné hemolymfy nebo kalibračního roztoku. Inkubace probíhala ve vlhké komůrce za
laboratorní teploty 24 hodin. Velikost difúzní zóny je přímo úměrná velikosti bakteriolytické
aktivity hemolymfy. Průměr difúzní zóny byl odečítán měřítkem IDP – SEVAC. Množství
lysozymu ve vzorku bylo přepočítáno podle kalibrační křivky na mg/ml hemolymfy.
Kalibrační křivka
y = 10,42x + 81,409
0
50
100
150
200
250
300
350
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Koncentrace lysozymu (mg/ml)
Průměrdifúznízóny
Diskuze:
Nejpřesnější hodnoty koncentrace lysozymu pro vzorky hemolymfy pocházejí hlavně
z metody radiální difúze v agaróze, i když byly většinou potvrzené i dalšími metodami.
Elektroforetické stanovení lysozymu je časově velmi náročné a dochází při něm
k přebarvení ostatních proteinových frakcí. Využití elektroforézy pouze za účelem
stanovení je tedy velmi neekonomické, i když vhodné jako potvrzení jeho přítomnosti ve
vzorku. Turbidimetrická metoda se nejeví jako spolehlivá, protože změna absorbance není
jednoznačně úměrná koncentraci lysozymu (viz. kalibrační křivka), a proto množství
lysozymu v hemolymfě přepočítané podle kalibrační křivky není tak přesné jako u zbylých
dvou metod. Ačkoliv má tato metoda využití např. při stanovení množství lysozymu
v tkáních a tělních tekutinách ryb (Ellis 1990), nám se u hmyzu neosvědčila.
Závěr:
Nejlépe se osvědčila metoda radiální difúze v agaróze, protože je velmi rychlá,
levná, citlivá a použitelná nejen pro vzorky hmyzí hemolymfy a tkání, ale i pro jiné
vzorky obsahující lysozym.
Kalibrační křivka
y = 0,0003x - 0,0005
-0,001
0
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0,008
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Koncentrace lysozymu (mg/ml)
Změnaabsorbance
Materiál metody:
Pro srovnání tří uvedených metod byl použit kalibrační roztok lysozymu (E.C.3.2.1.17,
Sigma) o koncentraci 2, 5, 10, 15 a 20 mg/ml. Dále byla použita hemolymfa bource
morušového (Bombyx mori) a zavíječe voskového (Galleria mellonella). Všechny metody
využívají Micrococcus luteus (M. lysodeikticus, CCM 169), který patří k nejcitlivějším
mikroorganizmům rozpouštěným tímto enzymem (Powning & Davison 1973).
2. Elektroforéza SDS-PAGGE
Sodium dodecylsulfat polyacrylamide gradient gel electrophoresis - metoda podle
Laemmliho (1970) modifikovaná podle Hyršl & Šimek (2005).
Polyakrylamidové gely vznikají kopolymerací dvou monomerů, akrylamidu a N’,N’methylenbisakrylamidu.
SDS (Sodium dodecylsulfát) se váže shodně na všechny bílkoviny
v poměru 1,4 g / 1g bílkoviny a předává jim silný záporný náboj, vlastní náboj je poté
zanedbatelný.
Byl použit 5 % koncentrační gel a separační gel 14 x 10,5 cm s gradientem 7,5 – 20,0 %.
Vertikální elektroforéza SE 600 (Hoefer Scientific Instruments) probíhala v prostředí
running buffer, pH 8,3, v automatickém dvoukrokovém režimu 7 - 8 hodin. Dělení proteinů
probíhalo paralelně ve dvou gelech, každý z nich pro 15 vzorků, jedním vzorkem byl vždy
standard (SDS-PAGE Molecular Weight Standard Broad Range, Bio-Rad, No. 161-0317).
Gely byly barveny stříbrem podle Kirkeby et al. (1993). K vyhodnocení
elektroforetogramů byl použit videodensitometr GS-670 a software Molecular Analyst (BioRad)
verze 1.1.1. Kalibrační křivka byla sestrojena na základě množstevní (kvantitativní)
analýzy detekovaných frakcí, molekulová hmotnost 14,5 kDa byla ověřena porovnáním se
standardem molekulových hmotností.
Obr.: Agarózový gel s vysekanými jamkami a difúzními zónami (vlevo). Horní řada obsahuje vzorky kalibračního
roztoku lysozymu o koncentraci 2, 5, 10, 20 a 25 mg/ml. Další čtyři řady jsou vzorky hemolymfy B. mori. Kalibrační
přímka (vpravo) a její rovnice, podle které se vypočítají výsledné hodnoty obsahu lysozymu ve vzorcích.
Obr.: Vlevo nahoře akrylamidový gel s frakcemi lysozymu R1 - R5 (2 - 20 µl/ml), vpravo kalibrační křivka lysozymu
sestrojená podle tabulky (dole) na základě programu Volume Analysis.
3. Turbidimetrická metoda - spektrofotometrie
Metoda podle Parry et al. (1965), která stanovuje aktivitu lysozymu jako pokles
absorbance vzorku obsahujícího lysozym v 20 minut povařené suspenzi M. luteus.
Absorbance vzorku (kontroly) byla měřena při laboratorní teplotě a vlnové délce 530 nm
v 1 ml bakteriální suspenze (0,2 mg/ml Britt.-Robinsonova pufru o pH 7,0). Absorbance
byla měřena ihned po přidání kalibračního roztoku (25 µl) nebo hemolymfy (2, 5, 10, 15
nebo 20 µl) a po 10 minutách inkubace při laboratorní teplotě. Byl zaznamenán pokles
absorbance způsobený bakteriolytickou aktivitou lysozymu.
Množství lysozymu ve vzorcích bylo přepočítáno podle kalibrační křivky na mg/ml
hemolymfy.
Obr.: Kalibrační křivka určená na základě měření změny absorbance po deseti minutách působení
lysozymu o různé koncentraci na suspenzi M. luteus.
Tabulka výsledků:
Literatura:
Ellis A.E.: Techniques in Fish Imunology. 12: 101-103, 1990.
Hyršl P. & Marek M.: Biological Bulletin of Poznaň., vol. 36, no. 2, s. 103-110, 1999.
Hyršl P. & Šimek V.: Biologia, 60 (2), 207-213, 2005.
Kanost M. R., Kawooya J. K., Law J. H., Ryan R. O., Van Heusden M. C. and Ziegler R.: Advances in Insect Physiology. 22: 299-396, 1990.
Kirkeby S., Moe D. and Bog-Hansen T.C.: Electrophoresis. 14: 51-55, 1993.
Laemmli U.K.: Nature 227: 680-685, 1970.
Morishima I., Horiba T. and Yamano Y.: Comp. Biochem. Physiol. 108A: 311-314, 1994.
Parry R. M., Chandau R. C. and Shahani R. M.: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 119: 384-386, 1965.
Powning R. F. & Davidson J.: Comp. Biochem. Physiol. 45B: 669-681, 1973.
Vodrážka Z.: Academia. 1992.
Wiesner & Götz: J.Insect Physiol. 39 (10): 865-876, 1993.
Yu K. H., Kim K. N., Lee J. H., Lee H. S., Kim S. H., Cho K. Y, Nam M. H. and Lee I. H.: Dev. Comp. Immun. 26: 707-713, 2002.
Tab.: Množství lysozymu v hemolymfě vybraných zástupců hmyzu (n = 10).
Kalibrační křivka LSM
0
5
10
15
20
25
30
35
40
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Koncentrace lysozymu (mg/ml)
AdjVolume(ODxmm)